在線(xiàn)固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定水中10種抗生素

＊蔣昕慶

（湖南水科檢驗(yàn)檢測(cè)有限公司 湖南 410000）

抗生素是生物（包括動(dòng)物、植物、微生物）自身產(chǎn)生的或者人工合成的，能在低微濃度下有選擇地抑制或影響其他生物功能的有機(jī)物質(zhì)[1]。按照抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)，可以分為6大類(lèi)：林可霉素類(lèi)、諾酮類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、β-內(nèi)酰胺類(lèi)、喹大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)[2]。隨著科技發(fā)展，近年來(lái)常常有濫用抗生素的現(xiàn)象，使大量細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，污染水體環(huán)境，在水生生物體內(nèi)富集，通過(guò)食物鏈和環(huán)境危害人體健康。四環(huán)素、土霉素、金霉素、磺胺甲惡唑等抗生素在地表水、地下水、自來(lái)水中均有檢出[3-7]。目前，用來(lái)檢測(cè)殘留抗生素的主要技術(shù)有免疫學(xué)分析法、微生物法和儀器分析法等，水體中多采用高效液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS/MS）技術(shù)、高效液相色譜儀與紫外檢測(cè)儀/熒光檢測(cè)儀聯(lián)用技術(shù)（HPLC-UV/HPLC-FD）。本文采用在線(xiàn)固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC-MS/MS）測(cè)定水中已發(fā)現(xiàn)對(duì)水體有污染的10種抗生素[8]，操作簡(jiǎn)單，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，有良好的應(yīng)用效果。

1.實(shí)驗(yàn)

（1）儀器與試劑。在線(xiàn)固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（美國(guó)Thermo公司），包括二元高壓泵、四元低壓泵、在線(xiàn)脫氣機(jī)、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器；一體式氮?dú)獍l(fā)生器；超聲波清洗器。

喹諾酮類(lèi)、磺胺類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)4大類(lèi)10種抗生素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司）；乙腈、甲酸均為HPLC級(jí)；流動(dòng)相超純水為屈臣氏蒸餾水。

（2）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100mg/L）：分別稱(chēng)取10種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品1mg，用乙腈分別溶解并定容至10mL，-18℃儲(chǔ)存。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1mg/L）：分別移取0.1mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10mL容量瓶中，用乙腈定容。

（3）在線(xiàn)固相萃取條件。萃取柱為Hypersil GOLD aQ 20mm×2.1mm，粒徑12μm；流動(dòng)相：A超純水，B含0.1%甲酸的乙腈，洗脫速率為1.0mL/min，梯度洗脫程序：0～5.5min為0%B，5.51～8.5min為100%B，10.7min為0%B。

表1 在線(xiàn)固相萃取條件

（4）色譜條件。色譜分析柱為Hypersil GOLD 50mm×2.1mm，粒徑3μm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：1mL；流動(dòng)相：A超純水，B含0.1%甲酸的乙腈，洗脫速率為0.3mL/min，梯度洗脫程序：0～0.5min為95%A、5%B，2～3.5min為90%A、10%B，4.5～7min為5%A、95%B， 7.01～10.5min為95%A、5%B。

表2 色譜條件

（5）質(zhì)譜條件。鞘氣壓力：37MPa；輔助氣壓力：12MPa；離子傳輸毛細(xì)管溫度：300℃；霧化溫度：350℃；噴霧電壓：（+）3500V；碰撞氣壓力：1.5MPa。采用選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（SRM）檢測(cè)。其他參數(shù)見(jiàn)表3。

表3 定量離子選擇

2.結(jié)果及討論

(1)樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

喹諾酮類(lèi)、磺胺類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)4個(gè)類(lèi)別的抗生素分子結(jié)構(gòu)各不相同，同時(shí)保證提取效果，難度較大。本實(shí)驗(yàn)比較了超純水提取、純乙腈提取、乙腈-超純水提取的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較于另外兩種提取方式，超純水的提取效果較好，回收率也更高。用純乙腈或者乙腈-超純水提取，磺胺類(lèi)物質(zhì)的回收率較低，響應(yīng)差，很難在液質(zhì)聯(lián)用儀上檢測(cè)出來(lái)。

(2)質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化

通過(guò)手動(dòng)進(jìn)樣針采用連續(xù)注射的方式，分別將質(zhì)量濃度為10mg/L的10種抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液通過(guò)管路直接注入電噴霧離子源，在正離子模式（HESI+）下優(yōu)化鞘氣壓力、離子傳輸毛細(xì)管溫度、霧化溫度、噴霧電壓等參數(shù)，得到10種抗生素最大響應(yīng)值以后，通過(guò)MRM（多反應(yīng)監(jiān)測(cè)）系統(tǒng)優(yōu)化碰撞能，得到相應(yīng)的母離子、定量子離子和定性子離子。

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及檢出限

用超純水稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1mg/L）制成濃度范圍為1.0～10.0ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，根據(jù)MDL=t(n-1,0.9)×SD計(jì)算本方法的檢出限，根據(jù)RQL=4×MDL計(jì)算測(cè)定下限。結(jié)果表明10種抗生素在1.0～10.0ng/mL濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性良好，相關(guān)系數(shù)大于0.99，檢出限范圍0.126～0.227ng/mL，且10種抗生素均能完全分離，分離度高。詳見(jiàn)表4。

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性及檢出限

表5 方法精密度（n=7）

幾種典型抗生素質(zhì)譜圖：

圖1 4ng/mL磺胺嘧啶質(zhì)譜圖

圖2 4ng/mL頭孢氨芐質(zhì)譜圖

圖3 4ng/mL氧氟沙星質(zhì)譜圖

圖4 4ng/mL四環(huán)素質(zhì)譜圖

圖5 4ng/mL羅紅霉素質(zhì)譜圖

(4)方法的回收率和精密度

①方法空白試驗(yàn)。采用本文所述方法進(jìn)行空白試驗(yàn)，10種抗生素均未檢出。

②方法精密度。分別配制1.00ng/mL、2.00ng/mL和8.00ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液，上機(jī)測(cè)定7次，RSD范圍為0.5%～6.7%。

③方法回收率。加標(biāo)回收樣品采用從南方某城市采集的無(wú)抗生素檢出的出廠水、管網(wǎng)水和原水，分別加入標(biāo)準(zhǔn)混合液，使最終濃度為2ng/mL和8ng/mL，上機(jī)測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表6。兩種濃度的回收率范圍為71.4%～104.8%。

表6 方法回收率

3.結(jié)論

本文采用在線(xiàn)固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立了一種快速檢測(cè)水體中多種類(lèi)抗生素的檢測(cè)方法，檢出限低、回收率高、重復(fù)性好，可應(yīng)對(duì)不同分子結(jié)構(gòu)的抗生素，為進(jìn)一步研究水體中抗生素的殘留及去除提供參考依據(jù)。