成都地區(qū)拓?fù)洚悩?gòu)酶基因突變?cè)诮怆咫逶w對(duì)氟喹諾酮類藥物耐藥中的作用

張紅艷,鄭良建,肖慈然,楊婷,丁少川,張劍波

解脲脲原體(Ureaplasmaurealyticum,UU)也稱為溶脲脲原體,隸屬于細(xì)菌域、柔膜菌門、柔膜菌綱、支原體目、支原體科下的脲原體屬,分為2個(gè)生物群,共14個(gè)血清型。解脲脲原體主要存在于人體的泌尿生殖道,在男性可導(dǎo)致非淋菌性尿道炎、前列腺炎、附睪炎、不育等［1-2］;在女性導(dǎo)致陰道炎、宮頸炎、盆腔炎、不孕不育、早產(chǎn)、圍產(chǎn)期感染、合并陰道加德納菌感染等［3-5］;還可以導(dǎo)致新生兒腦室出血、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變等不良妊娠結(jié)局［6］。

氟喹諾酮類藥物具有廣譜抗菌活性、口服吸收好、在泌尿生殖道中極易達(dá)到抗菌濃度等優(yōu)點(diǎn),成為臨床上治療支原體感染的一線藥物。然而,由于抗生素濫用、反復(fù)感染及遷延不愈等多種因素,解脲脲原體對(duì)氟喹諾酮類藥物的敏感性下降,出現(xiàn)耐藥并日趨嚴(yán)重,給臨床治療帶來極大的挑戰(zhàn),嚴(yán)重威脅人類的身體健康和生活質(zhì)量。盡管目前已有研究報(bào)道解脲脲原體對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥率和耐藥機(jī)制,但不同地區(qū)的研究結(jié)果之間存在地域差異。因此,研究本地區(qū)解脲脲原體臨床株的拓?fù)洚悩?gòu)酶基因突變特點(diǎn)對(duì)于掌握本地區(qū)耐藥株的流行病學(xué)資料、減少耐藥株的產(chǎn)生、指導(dǎo)臨床用藥以及提高患者治愈率具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1菌株來源 四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院東院區(qū)2021年9月—2022年2月分離的對(duì)氟喹諾酮類藥物不同程度耐藥的解脲脲原體臨床菌株。男性患者取尿道分泌物,禁尿2 h以上用無菌細(xì)小棉拭子緩慢插入尿道2～4 cm處,捻轉(zhuǎn)1周并停留30 s后取柱狀上皮細(xì)胞;女性患者取宮頸分泌物,無菌棉拭子插入宮頸1～2 cm旋轉(zhuǎn)360°后停留30 s取柱狀上皮細(xì)胞。標(biāo)本采集后立即送檢。

1.2標(biāo)準(zhǔn)菌株 解脲脲原體標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27815由眾愛生河北生物科技有限公司惠贈(zèng)。

1.3主要試劑 支原體肉湯基礎(chǔ)(英國OXOID公司),A7固體培養(yǎng)基(廣東江門凱琳貿(mào)易有限公司),最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)藥敏板(溫州康泰生物科技有限公司),支原體鑒定及藥敏試劑盒(眾愛生河北生物科技有限公司),DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司),PCR試劑(成都擎科生物科技有限公司)。

1.4支原體鑒定及藥敏試驗(yàn) 支原體鑒定及藥敏試劑盒購自眾愛生河北生物科技有限公司,液體培養(yǎng)基由黃色變?yōu)榉奂t色且固體培養(yǎng)基上有典型的支原體菌落生長判讀為陽性,低倍鏡下觀察解脲脲原體呈棕褐色“海膽”樣菌落。具體操作及結(jié)果判定均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.516SrRNA分子鑒定 通過商品化試劑盒篩選出對(duì)氟喹諾酮類藥物不同耐藥表型的解脲脲原體共58株,其中有2株敏感株。將菌落在固體平板(A7瓊脂)上純化后, 按照天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的操作說明提取DNA模板,并用16SrRNA測序技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分子鑒定。

1.6藥物MIC值測定 經(jīng)16SrRNA分子鑒定確認(rèn)的陽性菌株,參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)CLSI M43-A(2011版)指南［7］,將4種氟喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LEV)、莫西沙星(MXF)和加替沙星(GAT)倍比稀釋成12個(gè)不同的濃度,每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)計(jì)2個(gè)空白,1個(gè)陰性對(duì)照和1個(gè)陽性對(duì)照。以解脲脲原體標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27815為整個(gè)實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組和質(zhì)控株。采用微量肉湯稀釋法測定MIC,LEV和MXF的MIC≥4 μg/mL判讀為耐藥。

1.7PCR擴(kuò)增測序 針對(duì)UU拓?fù)洚悩?gòu)酶基因(gyrA、gyrB、parC、parE)的氟喹諾酮耐藥決定區(qū)域(quinoloneresistancedeterminingregions, QRDRs)設(shè)計(jì)引物［8］。gyrA-F:TTGCTGCTTTCGAAAACGG,gyrA-R:CTGATGGTAAAACACTTGG;gyrB-F:CCTGGTAAAT TAGCTGACTG,gyrB-R:TTCGAATATGACTGCCATC;parC-F:ACGCAATGAGTGAATTAGG,parC-R: CACTATCATCAAAGTTTGGAC;parE-F:ATGGGCGGAA AATTAACGC,parE-R:CTTGGATGTGACTACCATCG。挑取A7固體培養(yǎng)基上的單顆菌落,按照天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的操作說明提取DNA模板。PCR擴(kuò)增采用50 μL的反應(yīng)體系,反應(yīng)條件為:98 ℃預(yù)變性3 min; 98 ℃變性10 s、54 ℃退火10 s、72 ℃延伸10 s,共循環(huán)40次;最后72 ℃進(jìn)一步延伸5 min。PCR反應(yīng)完畢后,將產(chǎn)物點(diǎn)樣于溴乙錠預(yù)染色的1.25%的瓊脂糖凝膠上電泳35 min,同時(shí)用DL5000 DNA Marker做對(duì)照。目的條帶回收純化后,由成都擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.8數(shù)據(jù)分析 測序結(jié)果用DNAMAN軟件和BLAST將測定序列與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27815(GenBank CP000942.1)的序列進(jìn)行比對(duì),找出拓?fù)洚悩?gòu)酶基因的堿基突變位點(diǎn)及相應(yīng)的氨基酸改變。分析gyrA、gyrB、parC、parE基因QRDR區(qū)域的基因突變與氟喹諾酮類藥物MIC值的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1解脲脲原體對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥率 2021年9月—2022年2月本院區(qū)微生物實(shí)驗(yàn)室共收到支原體培養(yǎng)標(biāo)本1 387例,其中解脲脲原體單獨(dú)陽性感染的有635例,解脲脲原體陽性率為45.78%(635/1 387)。從解脲脲原體陽性的標(biāo)本中隨機(jī)選取58例經(jīng)16SrRNA基因測序證實(shí)為解脲脲原體的菌株進(jìn)行微量肉湯稀釋法藥敏試驗(yàn)。藥敏結(jié)果顯示,解脲脲原體對(duì)左氧氟沙星和莫西沙星的耐藥率分別為79.31%(46/58)和5.17%(3/58),結(jié)果見表1。

表1 解脲脲原體對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥率

2.2解脲脲原體拓?fù)洚悩?gòu)酶QRDR區(qū)堿基與對(duì)應(yīng)的氨基酸變異 在58株拓?fù)洚悩?gòu)酶基因測序的UU中,有46株發(fā)生了parC基因248位堿基C到T的突變,導(dǎo)致ParC 83位絲氨酸變異為亮氨酸(TCA→TTA),ParC S83L的變異率為79.31%(46/58); 9株發(fā)生了parC基因373位堿基A到G的突變,導(dǎo)致ParC 125位蘇氨酸變異為丙氨酸(ACA→GCA),ParC T125A的變異率為15.52%(9/58); 3株發(fā)生了gyrB基因1 384位堿基C到T的突變,導(dǎo)致GyrB 462位脯氨酸變異為絲氨酸(CCA→TCA),GyrB P462S的變異率為5.17%(3/58)。具體結(jié)果見表2,圖1。

The arrow indicates a mutation in the 248 base C of the parC gene to T, resulting in ParC S83L; The arrow indicates a mutation at base C of gyrB gene 1 384 to T, resulting in GyrB P462S

表2 解脲脲原體拓?fù)洚悩?gòu)酶QRDR區(qū)堿基與對(duì)應(yīng)的氨基酸變異

2.3解脲脲原體QRDR氨基酸變異與氟喹諾酮類藥物MIC值的相關(guān)性 對(duì)環(huán)丙沙星和左氧氟沙星同時(shí)耐藥的解脲脲原體株發(fā)生了ParC S83L的氨基酸變異,ParC S83L的氨基酸變異使解脲脲原體對(duì)環(huán)丙沙星的MIC值從4 μg/mL升高至8～32 μg/mL,對(duì)左氧氟沙星的MIC值從2 μg/mL升高至4～16 μg/mL。對(duì)莫西沙星和加替沙星同時(shí)耐藥的解脲脲原體株發(fā)生了GyrB P462S的氨基酸變異,GyrB P462S的氨基酸變異使解脲脲原體對(duì)莫西沙星和加替沙星的MIC值從2 μg/mL升高至4～8 μg/mL。ParC S83L合并GyrB P462S氨基酸變異時(shí),解脲脲原體對(duì)環(huán)丙沙星的MIC值則可進(jìn)一步升高至64～128 μg/mL,對(duì)左氧氟沙星的MIC值可進(jìn)一步升高至32 μg/mL。7株耐藥株和2株敏感株中發(fā)現(xiàn)了ParC T125A的氨基酸變異,ParC T125A變異株相較于未產(chǎn)生該變異的菌株,其與4種氟喹諾酮類藥物MIC值的變化相關(guān)性差。標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27815無任何氨基酸變異發(fā)生,所有菌株均未發(fā)現(xiàn)gyrA基因和parE基因?qū)?yīng)的氨基酸改變,見表3。

表3 解脲脲原體 QRDR氨基酸變異與氟喹諾酮類藥物MIC值的相關(guān)性

3 討論

泌尿生殖道支原體感染是臨床上關(guān)注的熱點(diǎn)問題。解脲脲原體感染占據(jù)支原體感染的首位,與泌尿生殖道炎癥、不孕不育等疾病密切相關(guān)。目前,大多數(shù)醫(yī)療單位均采用單純的液體培養(yǎng)法對(duì)支原體進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn),容易受到細(xì)菌和真菌的污染導(dǎo)致假陽性。本研究通過引入固體培養(yǎng)法來確認(rèn)支原體的菌落形態(tài),并進(jìn)一步利用16SrRNA基因序列分析技術(shù)對(duì)解脲脲原體進(jìn)行分子水平的鑒定,顯著提高了泌尿生殖道支原體感染診斷的準(zhǔn)確性。本研究綜合美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)CLSI M43-A文件和生殖道支原體感染診治專家共識(shí),采用微量肉湯稀釋法檢測解脲脲原體對(duì)氟喹諾酮類藥物的敏感性。結(jié)果顯示,解脲脲原體對(duì)環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星的MIC50分別為16、4、1、1 μg/mL,MIC90分別為32、8、2、2 μg/mL,說明新一代氟喹諾酮類藥物莫西沙星和加替沙星較老一代環(huán)丙沙星和左氧氟沙星具有較強(qiáng)的抗解脲脲原體活性。本研究顯示,解脲脲原體對(duì)左氧氟沙星的耐藥率高達(dá)79.31%,這與中國杭州地區(qū)和上海地區(qū)的研究相一致［9-10］。而在突尼斯、法國等地區(qū),解脲脲原體對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥率則較低［11-12］。德國的研究發(fā)現(xiàn),解脲脲原體對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥率為7.1%［13］。不同國家和地區(qū)的解脲脲原體對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥性報(bào)道不一致,可能與研究的人群構(gòu)成不同、樣本量不同、抗生素使用習(xí)慣以及各地區(qū)流行率差異和檢測方法不同等因素有關(guān)。

氟喹諾酮類藥物作用靶酶是Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶,包括DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ。氟喹諾酮類藥物通過與拓?fù)洚悩?gòu)酶形成復(fù)合物來阻斷DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等功能,進(jìn)而抑制DNA的合成,發(fā)揮抑菌或殺菌作用。DNA旋轉(zhuǎn)酶又稱拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ,由兩個(gè)亞單位A和B以A2B2的形式組成四聚體,其中A亞單位由染色體基因gyrA編碼,B亞單位由染色體基因gyrB編碼。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ也是A2B2形式的四聚體, 其中A亞單位由染色體基因parC編碼,B亞單位由染色體基因parE編碼。拓?fù)洚悩?gòu)酶基因(gyrA、gyrB、parC、parE)的突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌或支原體對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥,這些區(qū)域稱為QRDRs［14-15］。解脲脲原體對(duì)氟喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率逐年上升,其最重要的耐藥機(jī)制是由DNA旋轉(zhuǎn)酶基因 (gyrA、gyrB)與拓樸異構(gòu)酶Ⅳ基因 (parC、parE)在QRDRs發(fā)生點(diǎn)突變導(dǎo)致。

在本次納入研究的解脲脲原體中,有46株發(fā)生了parC基因248位堿基C到T的突變,導(dǎo)致ParC 83位絲氨酸變異為亮氨酸(TCA→TTA); 9株發(fā)生了parC基因373位堿基A到G的突變,導(dǎo)致ParC 125位蘇氨酸變異為丙氨酸(ACA→GCA); 3株發(fā)生了gyrB基因1 384位堿基C到T的突變,導(dǎo)致GyrB 462位脯氨酸變異為絲氨酸(CCA→TCA)。結(jié)果顯示ParC S83L為本地區(qū)最常見的變異,變異率為79.31%。因此,ParC S83L變異為成都地區(qū)解脲脲原體對(duì)氟喹諾酮類藥物耐藥的主要機(jī)制,與國內(nèi)外的研究報(bào)道一致［8-9,16-17］。

ParC S83L的氨基酸變異導(dǎo)致解脲脲原體對(duì)環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的MIC值升高了2～16倍,GyrB P462S的氨基酸變異使解脲脲原體對(duì)莫西沙星和加替沙星的MIC值從2 μg/mL升高至4～8 μg/mL,因此,gyrB基因的突變使解脲脲原體對(duì)莫西沙星和加替沙星從敏感變成了耐藥。有3個(gè)樣本同時(shí)發(fā)生了parC和gyrB基因的雙突變,這3個(gè)樣本對(duì)環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的MIC值進(jìn)一步增加到64～128 μg/mL和32 μg/mL,提示當(dāng)DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ均發(fā)生變化, 則耐藥程度大于單個(gè)酶改變,表明解脲脲原體對(duì)氟喹諾酮類耐藥性相關(guān)的多個(gè)基因突變對(duì)于耐藥性的表型有累加效應(yīng)。7株耐藥株和2株敏感株中發(fā)現(xiàn)了ParC T125A的氨基酸變異,ParC T125A變異株相較于未產(chǎn)生該變異的菌株,其與4種氟喹諾酮類藥物MIC值的變化相關(guān)性差,表明ParC T125A變異與解脲脲原體對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥沒有相關(guān)性,只是非耐藥相關(guān)的種屬特異的多態(tài)性表現(xiàn)。日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)了1株GyrA D112H變異［8］,但并沒有足夠證據(jù)表明gyrA基因突變與解脲脲原體對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥有關(guān)。重慶地區(qū)的報(bào)道發(fā)現(xiàn)了1個(gè)新突變ParE L408I［18］,但該突變也沒有引起解脲脲原體對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥,可能為無義突變。表明拓?fù)洚悩?gòu)酶gyrA和parE基因即使存在突變,也有可能是無義突變,在解脲脲原體對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥中作用不大。本次研究所有菌株均未發(fā)現(xiàn)gyrA和parE基因?qū)?yīng)的氨基酸改變,提示gyrA和parE基因在本地區(qū)解脲脲原體對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制中不占主要作用。

綜上所述,拓?fù)洚悩?gòu)酶基因parC248位堿基C突變?yōu)門導(dǎo)致的ParC S83L變異為解脲脲原體對(duì)氟喹諾酮類藥物耐藥的主要機(jī)制,parC和gyrB基因的雙突變可導(dǎo)致耐藥性的進(jìn)一步增加。此外,在解脲脲原體對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥株中并非全部都能檢出突變基因,這說明除了拓?fù)洚悩?gòu)酶基因介導(dǎo)的耐藥外,還可能存在其他的耐藥機(jī)制,例如過度表達(dá)外排泵以及生物膜的形成［19-20］等因素。因此,解脲脲原體對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。