LncRNA TUG1介導(dǎo)Nrf2/HO-1信號(hào)通路對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響

劉永政 劉曉靜 王俊俠 劉平原 劉淑華

(秦皇島市第一醫(yī)院心內(nèi)科,河北 秦皇島 066000)

在心肌梗死、心肌炎、缺血性心肌病、糖尿病性心肌病等多種心血管系統(tǒng)疾病中均存在心肌細(xì)胞凋亡,脂多糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞模型具有成模穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)〔1～3〕。長(zhǎng)鏈非編碼RNA是與心血管疾病心功能重構(gòu)、細(xì)胞凋亡聯(lián)系密切的非編碼RNA,Li等〔4〕和Yang等〔5〕研究發(fā)現(xiàn),?；撬嵘险{(diào)基因(TUG)1過表達(dá)可促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡,而下調(diào)TUG1則抑制心肌細(xì)胞凋亡。心肌組織正常功能發(fā)揮需充足氧氣支持,而當(dāng)氧氣缺乏時(shí)可造成心肌細(xì)胞不可逆損傷,進(jìn)而凋亡。氧化應(yīng)激在心肌損傷的級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起到重要作用,核因子E2相關(guān)因子(Nrf)2/血紅素氧化酶(HO)-1是對(duì)抗氧化應(yīng)激的主要防御機(jī)制〔6〕。基于此,本研究分析LncRNA TUG1介導(dǎo)Nrf2/HO-1信號(hào)通路對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1研究材料 研究細(xì)胞:心肌細(xì)胞HPC2購(gòu)自上海弘順生物,本次研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。主要試劑:RPMI1640培養(yǎng)基(武漢益普生物科技有限公司),脂多糖(上海馮萊生物科技有限公司),LncRNA TUG1沉默載體和上調(diào)載體(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒(上海鈺博生物科技有限公司),酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(上海富衡生物科技有限公司),二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司),天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2相關(guān)X蛋白(Bax)、Bcl-2、Nrf2、HO-1抗體(北京中杉金橋生物試劑公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及脂多糖處理 將人心肌細(xì)胞HPC2放入RPMI1640培養(yǎng)液(10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml酶聯(lián)素)中,后放入培養(yǎng)箱(溫度37 ℃、5%CO2),3 d換1次培養(yǎng)液,密度達(dá)80%～90%時(shí),除去培養(yǎng)基,進(jìn)行傳代培養(yǎng),取3～5代細(xì)胞后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)心肌細(xì)胞接種于6孔板上(2×105個(gè)細(xì)胞/孔),培育過夜,加入10 mg/L脂多糖,繼續(xù)培養(yǎng)6 h。

1.3脂多糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中LncRNA TUG1表達(dá)量檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測(cè)各組LncRNA TUG1表達(dá)量,Trizol試劑提取細(xì)胞中總RNA,總RNA純度、濃度通過超微量核酸蛋白檢測(cè)儀進(jìn)行測(cè)量,后合成總cDNA,以cDNA為模板U6為內(nèi)參,采用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列,啟動(dòng)PCR儀,采用2-ΔΔCt方法計(jì)算出各組細(xì)胞中LncRNA TUG1表達(dá)量。試驗(yàn)重復(fù)測(cè)量3次。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效率測(cè)定 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期脂多糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞HPC2接種于6孔板上,每孔1×105個(gè)細(xì)胞,放入培養(yǎng)箱內(nèi)(37 ℃ 5% CO2飽和濕度),采用Lipofectamine2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染,分為對(duì)照組、上調(diào)組、下調(diào)組。對(duì)照組不做處理,上調(diào)組做LncRNA TUG1上調(diào)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,下調(diào)組做LncRNA TUG1沉默質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。

1.5細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,TUNEL法測(cè)定細(xì)胞凋亡率,將所培養(yǎng)細(xì)胞做洗滌、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色封片后的細(xì)胞核分別呈現(xiàn)為藍(lán)色熒光(陰性細(xì)胞數(shù))、綠色熒光(陽性細(xì)胞數(shù)),之后細(xì)胞凋亡情況采用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察,細(xì)胞凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。試驗(yàn)重復(fù)測(cè)量3次。

1.6Caspase-3、Bax、Bcl-2及Nrf2/HO-1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)量檢測(cè) 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,通過Western印跡法檢測(cè)Caspase-3、Bax、Bcl-2、Nrf2、HO-1表達(dá)量十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)于每孔加入80 μg蛋白后進(jìn)行,電泳結(jié)束后將蛋白電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脫脂奶粉對(duì)PVDF膜進(jìn)行封閉,Caspase-3、Bax、Bcl-2、Nrf2、HO-1一抗(1∶1 000)于搖床上室溫孵育,共孵育120 min,完成后采用TBST洗膜3次,5 min/次,后將Caspase-3、Bax、Bcl-2、Nrf2、HO-1二抗(1∶1 000)于搖床上室溫孵育,共孵育60 min,完成后采用TBST洗膜3次,10 min/次,化學(xué)發(fā)光顯影采用ECL,以GAPDH為內(nèi)參,相對(duì)條帶灰度光密度值采用ImageJ軟件分析。

1.7氧化應(yīng)激及炎性因子水平檢測(cè) 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液,3 500 r/min,離心10 min,保留上清液,通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法對(duì)乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、白細(xì)胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、F檢驗(yàn)、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.13組脂多糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞LncRNA TUG1表達(dá)量對(duì)比 如表1所示,與對(duì)照組相比,上調(diào)組LncRNA TUG1表達(dá)量上升,下調(diào)組LncRNA TUG1表達(dá)量下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說明LncRNA TUG1轉(zhuǎn)染成功。

表1 3組脂多糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞LncRNA TUG1表達(dá)及心肌細(xì)胞凋亡對(duì)比

2.23組脂多糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡情況對(duì)比 如表1所示,與對(duì)照組相比,上調(diào)組凋亡率、Caspase-3、Bax表達(dá)量上升,Bcl-2表達(dá)量下降,下調(diào)組凋亡率、Caspase-3、Bax表達(dá)量下降,Bcl-2表達(dá)量上升,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與上調(diào)組相比,下調(diào)組凋亡率、Caspase-3、Bax表達(dá)量下降,Bcl-2表達(dá)量上升,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.33組脂多糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激及炎性因子水平對(duì)比 如表2所示,與對(duì)照組相比,上調(diào)組LDH、MDA、IL-6、TNF-α水平上升,SOD水平下降,下調(diào)組LDH、MDA、IL-6、TNF-α水平下降,SOD水平上升,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與上調(diào)組相比,下調(diào)組LDH、MDA、IL-6、TNF-α水平下降,SOD水平上升,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 3組脂多糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎性因子水平及Nrf2/HO-1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)量對(duì)比

2.43組脂多糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞Nrf2/HO-1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)量對(duì)比 如表2所示,與對(duì)照組相比,上調(diào)組Nrf2、HO-1表達(dá)量下降,下調(diào)組Nrf2、HO-1表達(dá)量上升,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

脂多糖是具有劑量依賴性細(xì)胞毒作用的革蘭陰性菌外膜成分,可造成心力衰竭、心肌損傷,脂多糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可出現(xiàn)持續(xù)性應(yīng)激反應(yīng),激活凋亡途徑,最后造成了心肌細(xì)胞凋亡〔7,8〕。本研究結(jié)果提示,脂多糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中LncRNA TUG1呈高表達(dá),下調(diào)其表達(dá)可抑制心肌細(xì)胞凋亡。分析其原因?yàn)?長(zhǎng)編碼RNA是具有引導(dǎo)核糖酸復(fù)合體、介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡等功能的功能性RNA分子,在心血管疾病中可參與心室重構(gòu)、心肌肥厚、心肌細(xì)胞凋亡,在疾病狀態(tài)下表達(dá)差異性較為明顯。心肌組織中LncRNA TUG1可在缺氧后顯著上調(diào),這樣又加重了心肌細(xì)胞的損傷〔9,10〕。將LncRNA TUG1的表達(dá)下調(diào)后發(fā)現(xiàn)小鼠心功能和梗死面積均有明顯改善,表明抑制LncRNA TUG1對(duì)發(fā)生心梗小鼠的心肌有一定保護(hù)作用〔11〕。國(guó)內(nèi)學(xué)者通過檢測(cè)各組細(xì)胞的炎癥因子表達(dá)情況,來評(píng)估LncRNA TUG1對(duì)缺氧心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響提示,抑制lncRNA-TUG1會(huì)減輕缺氧心肌細(xì)胞的炎癥發(fā)生〔12〕。

Caspase-3是可激活核酸內(nèi)切酶、引發(fā)DNA損傷修復(fù)酶降解的半胱氨酸蛋白酶,可誘導(dǎo)細(xì)胞核染色質(zhì)的固縮及凋亡小體的產(chǎn)生,為調(diào)控細(xì)胞凋亡的主要環(huán)節(jié),在被激活時(shí)可裂解大量底物,造成細(xì)胞凋亡〔13,14〕。Bcl-2是對(duì)線粒體外膜通透性具有調(diào)節(jié)作用的抑凋亡基因,Bax為促凋亡基因,心臟在血管氧化應(yīng)激病理進(jìn)展期間可出現(xiàn)不同程度的心肌細(xì)胞凋亡〔15〕。LDH作為反映細(xì)胞損傷情況的細(xì)胞毒性指標(biāo),在細(xì)胞損傷、凋亡中呈高表達(dá),MDA可對(duì)氧化應(yīng)激損傷程度進(jìn)行反映,SOD可保護(hù)細(xì)胞免受損傷,在細(xì)胞膜經(jīng)氧化應(yīng)激破壞后,不飽和脂肪酸受到攻擊,造成MDA生成增加、SOD生成減少〔16,17〕。心肌缺氧、缺血后可造成無菌性炎性反應(yīng),聚集免疫細(xì)胞,促進(jìn)IL-6、TNF-α等炎性因子釋放,并引起心肌收縮減弱。有研究報(bào)道IL-6、TNF-α可由動(dòng)脈粥樣硬化斑塊合成,并且作用于血管壁引起損傷,進(jìn)一步促進(jìn)血栓的形成和發(fā)展〔18,19〕。既往實(shí)驗(yàn)表明,IL-6參與心力衰竭途徑主要通過抑制心肌收縮及促進(jìn)心肌凋亡,而給予干預(yù)可降低大鼠體內(nèi)IL-6及心肌細(xì)胞凋亡〔20〕。有研究指出,TNF-α可使培養(yǎng)鼠心肌細(xì)胞凋亡,且凋亡數(shù)目與TNF-α呈正比〔21〕。本研究結(jié)果提示,下調(diào)LncRNA TUG1表達(dá)可降低免疫炎癥反應(yīng),抑制脂多糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。

Nrf2/HO-1通路為細(xì)胞氧化應(yīng)激的主要通路,可發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、減少線粒體損傷、抗氧化、抗炎等作用,在心力衰竭、原發(fā)性高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、心律失常、心肌缺血再灌注損傷等心血管疾病中激活Nrf2/HO-1可發(fā)揮保護(hù)作用〔22,23〕。Nrf2為減緩抗氧化酶及細(xì)胞凋亡的表達(dá)以減緩氧化受損的氧化還原的一種轉(zhuǎn)錄因子,可與keap1形成復(fù)合物的重要轉(zhuǎn)錄因子,在抗氧化反應(yīng)中具有關(guān)鍵作用,當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí),可集合抗氧化反應(yīng)原件,后啟動(dòng)HO-1、NQO1等下游基因,而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用〔24〕。陶卉等〔25〕通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Nrf2或HO-1過表達(dá)可減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)的表達(dá),說明Nrf2/HO-1表達(dá)增強(qiáng)可降低細(xì)胞凋亡。

在機(jī)體與病原體接觸之后,細(xì)胞可經(jīng)程序性死亡以減緩病原體在細(xì)胞中的復(fù)制能力提升,且細(xì)胞死亡激發(fā)炎癥反應(yīng),釋放出細(xì)胞膜受損及內(nèi)源性的危險(xiǎn)信號(hào),使得轉(zhuǎn)錄因子激活且引導(dǎo)促炎因子水平,進(jìn)而促使炎癥進(jìn)展〔26〕。炎癥可使氧化應(yīng)激加劇,致使細(xì)胞損傷及凋亡出現(xiàn),在應(yīng)激源顯現(xiàn)時(shí),Nrf2分解且轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核促使抗氧化酶HO-1的水平變化,而HO-1在炎癥刺激及抗氧化刺激的細(xì)胞預(yù)防機(jī)制中能參與炎性因子IL-6、TNF-α等的出現(xiàn),提升HO-1表達(dá)以緩解細(xì)胞凋亡及損傷〔27〕。本研究結(jié)果提示,LncRNA TUG1抑制心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與Nrf2/HO-1信號(hào)通路被激活有關(guān)。

綜上所述,脂多糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中LncRNA TUG1呈高表達(dá),經(jīng)下調(diào)LncRNA TUG1干預(yù)后脂多糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡率下降,凋亡相關(guān)蛋白、氧化應(yīng)激、炎性因子水平得到調(diào)節(jié),其機(jī)制可能與Nrf2/HO-1信號(hào)通路被激活有關(guān),為臨床心肌損傷靶向治療提供了新方向。