梔子醇提物下調(diào)lncRNA MALAT1影響帕金森病模型細(xì)胞增殖和凋亡

叢向陽(yáng) 向艷麗 陳靜

(威海市立第三醫(yī)院 1藥劑科,山東 威海 264200;2公共衛(wèi)生科;3西藥房)

帕金森病(PD)是影響中老年人健康的第二大神經(jīng)性神經(jīng)退行性疾病,以大腦黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的逐漸喪失,繼而引發(fā)運(yùn)動(dòng)功能障礙及一系列非運(yùn)動(dòng)癥狀為特征〔1〕。雖然多巴胺激動(dòng)劑、單胺氧化酶B抑制劑可緩解PD的運(yùn)動(dòng)癥狀,但并不能阻止疾病進(jìn)展或逆轉(zhuǎn)神經(jīng)退行性變,且長(zhǎng)期服用具有較大的副作用〔2〕。梔子為茜草科植物梔子的干燥成熟果實(shí),除用作天然黃色染料外,其還具有抗氧化、降血糖、抑制炎癥、抗抑郁、改善睡眠質(zhì)量等多種生物活性〔3〕。梔子醇提物可降低PD小鼠的爬桿時(shí)間,具有較好的多巴胺能神經(jīng)元保護(hù)作用〔4〕。近年來(lái),長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)在神經(jīng)發(fā)育、再生和神經(jīng)退行性疾病過(guò)程中的作用已成為研究熱點(diǎn)。有研究指出lncRNA肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(MALAT)1在PD模型小鼠腦組織中表達(dá)增加并誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔5〕。然而,梔子醇提物是否通過(guò)調(diào)控lncRNA MALAT1表達(dá)進(jìn)而對(duì)PD神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用并不清楚。本研究以1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)處理人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH細(xì)胞構(gòu)建PD細(xì)胞模型〔6〕,探討梔子醇提物對(duì)PD模型細(xì)胞活力、凋亡的影響,分析其潛在作用機(jī)制,以期為開(kāi)發(fā)梔子醇提物用于防治PD提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和主要試劑 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SK-N-SH購(gòu)于武漢普諾賽生命科技公司;MPP+購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;MALAT1小干擾RNA(si-MALAT1)、小干擾RNA陰性對(duì)照(si-NC)、空載體質(zhì)粒(pcDNA)、MALAT1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-MALAT1)由廣州復(fù)能基因公司提供;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)購(gòu)于日本同仁公司;膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海鈺博生物公司;山羊抗兔IgG二抗及兔抗人B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2抗體、兔抗人Bcl相關(guān)X蛋白(Bax)抗體、兔抗人磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體購(gòu)于上海碧云天生物公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix購(gòu)于美國(guó)ABI公司。

1.2梔子醇提物制備 參照張奇昌等〔4〕實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行,將2 kg梔子干燥果實(shí)粉碎,60%乙醇冷浸,收集提取液,負(fù)壓抽濾除去雜質(zhì),減壓濃縮后,冷凍干燥得到梔子醇提物。

1.3實(shí)驗(yàn)分組 用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液在37 ℃、含5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)SK-N-SH細(xì)胞。以正常培養(yǎng)的SK-N-SH細(xì)胞作為對(duì)照組;用3 mmol/L的MPP+處理SK-N-SH細(xì)胞18 h作為PD細(xì)胞模型〔6〕,記為模型組;用濃度分別為25、50、100 μg/ml的梔子醇提物預(yù)處理4 h后再用3 mmol/L的MPP+處理,依次記為實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組。利用Lipofectamine2000將si-NC、si-MALAT1分別轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細(xì)胞后再用3 mmol/L的MPP+處理依次記為si-NC組、si-MALAT1組。利用Lipofectamine2000將pcDNA、pcDNA-MALAT1分別轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細(xì)胞后用100 μg/ml的梔子醇提物預(yù)處理4 h及3 mmol/L的MPP+處理依次記為實(shí)驗(yàn)3+pcDNA組、實(shí)驗(yàn)3+pcDNA-MALAT1組。

1.4CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力 將各組細(xì)胞以1×104個(gè)/孔密度接種96孔板,每孔加入10 μl的CCK-8試劑,進(jìn)一步孵育4 h后,分光光度法吸光度測(cè)量各孔在450 nm處光密度(OD)值。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次,隨后用結(jié)合緩沖液調(diào)整密度為1×106個(gè)/ml細(xì)胞懸液。采用Annexin Ⅴ-FITC和PI進(jìn)行染色,流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

1.6Western印跡檢測(cè)Bax和Bcl-2蛋白表達(dá) RIPA裂解液提取各組細(xì)胞蛋白質(zhì),隨后進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后,然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂牛奶封閉膜,將膜與兔抗Bax、Bcl-2或GAPDH抗體孵育過(guò)夜,然后用山羊抗兔二抗孵育膜2 h。化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)條帶,以內(nèi)參和目的蛋白灰度值比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)lncRNA MALAT1表達(dá) 用Trizol試劑從各組細(xì)胞中提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),使用SYBR Premix master mix進(jìn)行RT-qPCR。以GAPDH為內(nèi)源對(duì)照,2-ΔΔCt方法計(jì)算lncRNA MALAT1相對(duì)表達(dá)水平。MALAT1上游引物5′-TGCG AGTTGTTCTCCGTCTA-3′,下游5′-TATCTGCGGTT TCCTCAAGC-3′;GAPDH上游引物5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′,下游5′-AAGTGGTCGTTGAGG GCAATG-3′。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1梔子醇提物對(duì)PD模型細(xì)胞活性的影響 與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05);與模型組比較,實(shí)驗(yàn)2、實(shí)驗(yàn)3組細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05)。且實(shí)驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)2、實(shí)驗(yàn)3組兩兩比較細(xì)胞活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 梔子醇提物對(duì)PD模型細(xì)胞活性、凋亡、MALAT1表達(dá)的影響

2.2梔子醇提物對(duì)PD模型凋亡的影響 與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)、凋亡率顯著升高,Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05);與模型組比較,實(shí)驗(yàn)2、實(shí)驗(yàn)3組細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)、凋亡率顯著降低,Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。且實(shí)驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)2、實(shí)驗(yàn)3組間各項(xiàng)指標(biāo)兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖1、圖2。

圖1 梔子醇提物對(duì)PD模型細(xì)胞凋亡的影響

1～9:對(duì)照組、模型組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組、si-NC組、si-MALAT1組、實(shí)驗(yàn)3+pcDNA組、實(shí)驗(yàn)3+pcDNA-MALAT1組

2.3梔子醇提物對(duì)PD模型細(xì)胞MALAT1表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞中MALAT1表達(dá)顯著升高(P<0.05);與模型組比較,實(shí)驗(yàn)2、實(shí)驗(yàn)3組細(xì)胞MALAT1表達(dá)顯著降低(P<0.05)。且實(shí)驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)2、實(shí)驗(yàn)3組間MALAT1表達(dá)兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

2.4抑制MALAT1表達(dá)對(duì)PD模型細(xì)胞活性及凋亡的影響 與si-NC組比較,si-MALAT1組細(xì)胞中MALAT1表達(dá)水平顯著降低,Bcl-2蛋白表達(dá)和細(xì)胞活力顯著升高,Bax蛋白表達(dá)和凋亡率顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2、圖3、表2。

圖3 抑制MALAT1對(duì)PD模型凋亡率的影響

表2 抑制MALAT1對(duì)PD模型細(xì)胞活性及凋亡蛋白的影響

2.5過(guò)表達(dá)MALAT1對(duì)梔子醇提物處理的PD模型細(xì)胞活性的影響 與實(shí)驗(yàn)3+pcDNA組比較,實(shí)驗(yàn)3+pcDNA-MALAT1組細(xì)胞中MALAT1表達(dá)顯著升高,細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 過(guò)表達(dá)MALAT1對(duì)梔子醇提物處理的PD模型組細(xì)胞活性、凋亡率及凋亡蛋白的影響

2.6過(guò)表達(dá)MALAT1對(duì)梔子醇提物處理的PD模型細(xì)胞凋亡的影響 與實(shí)驗(yàn)3+pcDNA組比較,實(shí)驗(yàn)3+pcDNA-MALAT1組細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)和凋亡率顯著升高,Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表3、圖4。

圖4 過(guò)表達(dá)MALAT1對(duì)梔子醇提物處理的PD模型組細(xì)胞凋亡率影響

3 討 論

梔子的神經(jīng)保護(hù)作用已被廣泛報(bào)道。Zhang等〔7〕研究發(fā)現(xiàn),梔子醇提物可顯著提高腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)含量,抑制乙酰膽堿酯酶(AchE)和一氧化氮合酶(NOS),改善慢性腦缺血模型大鼠學(xué)習(xí)記憶。Zang等〔8〕指出,藏紅花素能增強(qiáng)抗氧化能力,減輕神經(jīng)炎癥,增強(qiáng)了阿爾茨海默病(AD)模型小鼠的記憶和認(rèn)知能力。此外,Yuan等〔9〕證實(shí),梔子苷通過(guò)抑制絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)/核因子(NF)-κB通路可維持血腦屏障完整性,降低腦水腫,抑制促炎因子分泌對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷具有保護(hù)作用。本研究表明,梔子醇提物呈劑量依賴效應(yīng)提高模型細(xì)胞活力,抑制模型細(xì)胞凋亡。促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2之間的平衡在調(diào)控細(xì)胞凋亡中起重要作用,Bax表達(dá)增加可促進(jìn)線粒體膜孔形成,導(dǎo)致細(xì)胞色素c等促凋亡因子釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),進(jìn)而激活半胱天蛋白酶(Caspase)途徑,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,而B(niǎo)cl-2則通過(guò)阻止Bax移位線粒體外膜和構(gòu)象改變具有抗凋亡作用〔10〕。研究證實(shí),MPP+處理可干擾Bax和Bcl-2之間的平衡,促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞凋亡〔11,12〕。本研究發(fā)現(xiàn)模型細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)顯著升高,Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低,而一定劑量梔子醇提物可顯著逆轉(zhuǎn)MPP+引起的Bax和Bcl-2表達(dá)改變。以上研究結(jié)果表明,梔子醇提物可促進(jìn)PD模型細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡,即梔子醇提物具有潛在的PD保護(hù)作用。

研究表明,lncRNA是由長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸組成的RNA轉(zhuǎn)錄本,其在轉(zhuǎn)錄、表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄后水平參與調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)分化、突觸功能等多種生物學(xué)過(guò)程,在PD發(fā)病過(guò)程中具有重要作用〔13〕。研究顯示,癲癇大鼠腦組織中l(wèi)ncRNA MALAT1表達(dá)增加,并具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及神經(jīng)元損傷作用〔14〕。黃連素通過(guò)抑制lncRNA MALAT1表達(dá)影響miR-181c-5p/高遷移率族蛋白(HMG)B1途徑降低腦缺血后的炎癥損傷〔15〕。然而,脊髓損傷、AD等疾病中l(wèi)ncRNA MALAT1表達(dá)降低,過(guò)表達(dá)lncRNA MALAT1可抑制神經(jīng)元凋亡和損傷〔16～18〕。本研究顯示,PD模型細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MALAT1表達(dá)顯著升高,而梔子醇提物呈劑量依賴方式降低PD模型細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MALAT1表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染si-MALAT1進(jìn)行功能驗(yàn)證顯示,抑制lncRNA MALAT1可提高PD模型細(xì)胞活力和Bcl-2蛋白水平,降低細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白表達(dá)水平。進(jìn)一步研究顯示,轉(zhuǎn)染pcDNA-MALAT1過(guò)表達(dá)lncRNA MALAT1可顯著逆轉(zhuǎn)梔子醇提物對(duì)PD模型細(xì)胞活力、凋亡及Bax和Bcl-2蛋白的影響。以上研究結(jié)果表明,抑制lncRNA MALAT1表達(dá)是梔子醇提物對(duì)PD模型細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用的重要途徑。

綜上,梔子醇提物可促進(jìn)PD模型細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡,其機(jī)制與下調(diào)lncRNA MALAT1表達(dá)有關(guān),這豐富了梔子醇提物的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制,為開(kāi)發(fā)梔子醇提物用于防治PD提供理論依據(jù)。