姜黃素對非酒精性脂肪肝細胞模型鐵負荷的影響

呂琨 李嬋 謝萍

(武漢市第三醫(yī)院 武漢大學附屬同仁醫(yī)院中醫(yī)科,湖北 武漢 430060)

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是指排除酒精和其他明顯肝損傷因素導致的全身代謝性疾病,其特征為肝細胞內(nèi)脂肪的過度沉積〔1〕。NAFLD是世界范圍內(nèi)最常見的慢性肝病,在普通人口中的發(fā)病率為25%左右,隨著人們生活水平的提高,其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢〔2〕。NAFLD的病因復雜,目前尚未完全明確,其中“二重打擊”學說被普遍接受,肝細胞中脂質過度沉積為第一重打擊,氧化應激、內(nèi)質網(wǎng)應激和炎癥等因素引起非酒精性脂肪肝肝炎為第二重打擊〔3〕。目前針對NAFLD的治療主要為改善生活方式,適當體能鍛煉,控制飲食等,仍沒有針對其發(fā)病機制的特效藥物,因此尋找治療NAFLD的特效藥物具有重要意義〔4〕。

鐵是人體中含量最高的微量元素,參與多種機體生命活動,維持體內(nèi)鐵的平衡對人體健康具有重要意義〔5〕。研究表明,鐵超載與NAFLD之間具有密切關聯(lián),NAFLD患者常常出現(xiàn)輕、中度的肝臟鐵超載〔6〕,沈潔等〔7〕發(fā)現(xiàn),高鐵負荷會加重NAFLD的進展,Salaye等〔8〕發(fā)現(xiàn),限制小鼠的鐵攝入可以減輕小鼠NAFLD的炎癥反應。

姜黃素是一種多酚類物質,主要存在于姜科植物中〔9〕。研究表明,姜黃素對如代謝紊亂、肥胖、炎癥、肝臟疾病和惡性腫瘤等多種慢性病具有較好的治療效果〔10,11〕。體內(nèi)外研究顯示姜黃素可以干預NAFLD多個病理進程的環(huán)節(jié),通過抗氧化應激和炎癥反應,發(fā)揮治療NAFLD的作用〔12〕。但姜黃素是否通過調(diào)節(jié)機體鐵負荷途徑改善NAFLD的病程,還有待研究。本研究用姜黃素干預游離脂肪酸誘導的大鼠肝細胞構建的NAFLD細胞模型,同時給予Fe2+刺激,探究姜黃素與鐵負荷在治療NAFLD方面的關系,為NAFLD的臨床治療建立一定的基礎。

1 材料與方法

1.1細胞與試劑 大鼠肝細胞BRL-3A來源于中國科學院上海細胞庫,胎牛血清(天津灝洋生物制品科技有限責任公司);磷酸鹽緩沖液(PBS)、0.25% 胰蛋白酶(北京雷根生物技術有限公司);油酸、棕櫚酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);牛血清白蛋白(BSA)-V、放射免疫沉淀(RIPA)法(強)組織細胞快速裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);飽和油紅O染色液(上海遠慕生物科技有限公司);甲醛、1,2-丙二醇(上海麥克林生化科技有限公司);CCK-8(貝博生物);三酰甘油(TG)測試盒(南京建成生物工程研究所);Trizol(美國ambion公司);qPCR試劑盒(美國KAPA Biosystems公司);蛋白質Marker(美國Helix公司);大鼠鐵蛋白酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、抗體鐵調(diào)素(Hepcidin)、膜鐵轉運蛋白(Fpn)-1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、山羊抗兔二抗(武漢貝茵萊生物科技有限公司)。

1.2細胞培養(yǎng)及傳代 將BRL-3A大鼠肝細胞培養(yǎng)于10% 滅活胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基中,37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)。用培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度至1×105個/ml,24 h后換入含0.1%胎牛血清的培養(yǎng)液中,培養(yǎng)24 h。按1∶3比例傳代培養(yǎng),待細胞呈對數(shù)生長時開始實驗。

1.3非酒精性脂肪肝病模型構建及鑒定 將大鼠肝細胞以5×105個/ml接種于6孔板,每孔1 ml,分為正常組和模型組,每組3孔。待細胞貼壁后,正常組加入含1% BSA的無血清培養(yǎng)基,模型組加入1 mmol/L游離脂肪酸(油酸和棕櫚酸2∶1),培養(yǎng)24 h。油紅O染色進行模型鑒定。倒掉培養(yǎng)液,PBS漂洗后用10%甲醛固定10 min,PBS漂洗2次,加入預熱的油紅O染液,65 ℃恒溫箱中染色30 min,80%丙二醇分化1 min,顯微鏡下觀察背景至無色為止,PBS漂洗3 次后鏡檢。

1.4篩選姜黃素作用濃度 收集細胞懸液,接種到96孔板中,過夜培養(yǎng)使細胞貼壁。分別加入0.00、1.25、5.00、10.00、25.00、50.00 μmol/L的姜黃素刺激2 h后,再構建大鼠肝細胞NAFLD模型;收集細胞上清,按照ELISA試劑盒說明書繪制標準曲線并測定細胞內(nèi)鐵蛋白的含量。根據(jù)測定的細胞鐵蛋白含量,選擇合適的姜黃素作用濃度進行后續(xù)實驗。

1.5實驗分組 實驗共分5組:正常組、模型組、姜黃素組、Fe2+組、姜黃素+Fe2+組。正常組肝細胞正常培養(yǎng);模型組構建NAFLD模型;姜黃素組姜黃素預刺激大鼠肝細胞2 h,再構建NAFLD模型;Fe2+組構建NAFLD模型的同時加入硫酸亞鐵銨共同作用24 h;姜黃素+Fe2+組姜黃素預刺激大鼠肝細胞2 h,再構建NAFLD模型同時加入硫酸亞鐵銨共同作用24 h。游離脂肪酸濃度為1 mmol/L;硫酸亞鐵銨的濃度為0.25 mmol/L,姜黃素的濃度為1.4中篩選出的濃度。

1.6CCK-8檢測細胞存活率 大鼠肝細胞接種到96孔板,3×103個細胞/孔,每孔100 μl,置 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,使細胞貼壁。按照不同分組處理細胞,培養(yǎng)24 h后,向每孔加入10 μl CCK8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,在酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm處測量各孔的吸光值。

1.7磷酸甘油氧化酶法檢測TG含量 各組肝細胞干預24 h后,勻漿,按體積比1∶100的比例加入樣品和工作液,37 ℃孵育10 min,用酶標儀于505 nm處測定TG的吸光度,用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。

1.8qPCR檢測Hepcidin和Fpn-1的mRNA表達 Trizol法提取細胞總RNA,測定RNA的濃度及純度,將RNA按照Takara反轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄合成cDNA,進行PCR擴增。擴增體系:SYBR FAST qPCR Master Mix 10 μl;上、下游引物各0.5 μl;cDNA模板1 μl;雙蒸水(ddH2O)8 μl。反應程序:95 ℃預變性3 min,95 ℃變性5 s,56 ℃退火10 s,72 ℃延伸25 s,40個循環(huán)。引物序列(5′-3′):Hepcidin正向:GCCTGTCTCCTGCTTCTCC,反向:AGTTGGTGTCTCGCTTCCTT;Fpn-1正向:CATTGGCTGTGGTTTCATT,反向:TCAAGTTCACGGATGTTAGAG;GAPDH正向:CAAGTTCAACGGCACAG,反向:CCAGTAGACTCCACGACAT。上述引物由武漢天一華煜基因科技有限公司合成。以GAPDH為內(nèi)參,2-ΔΔCt計算相對表達量。

1.9Western印跡檢測Hepcidin和Fpn-1蛋白表達水平 取出細胞吸去培養(yǎng)基,預冷的PBS洗滌2次,每1×106個細胞加入裂解液(含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑)200 μl,4 ℃充分裂解細胞,將細胞刮入1.5 ml EP管中,4 ℃ 11 500 r/min離心10 min,取上清進行蛋白質定量。每孔上樣量為20 μg蛋白。將各組樣品于12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),電轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。5 %脫脂奶粉室溫封閉4 ℃過夜,按照1∶1 000的稀釋比例稀釋兔抗Hepcidin、Fpn-1、GAPDH,抗體加入封閉液中稀釋到所需濃度,室溫孵育1 h,洗膜3次后,按照1∶10 000稀釋辣根過氧化酶(HRP)標記的二抗,室溫孵育1 h。洗膜3次后,將膜放置在暗室中,取適量電化學發(fā)光(ECL)液A和B等量混勻,加在膜的正面與之充分接觸。然后將膜置于全自動化學發(fā)光分析儀中檢測,通過TANON GIS軟件讀取相關條帶灰度值。

1.10統(tǒng)計學分析 用GraphPad Prism8.0進行統(tǒng)計學分析和作圖,組間比較采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1NAFLD模型鑒定 如圖1所示,正常組細胞未見脂滴聚集,油紅O染色后未被染上顏色,而模型組細胞可見明顯的脂滴聚集,脂滴被染成紅色,與正常組差異明顯,表明NAFLD模型構建成功。

圖1 兩組肝細胞(油紅O染色,×200)

2.2姜黃素最佳作用濃度的篩選 姜黃素濃度為0.00、1.25、5.00、10.00、25.00 μmol/L時,細胞內(nèi)鐵含量分別為(297.32±2.02)、(252.89±4.00)、(212.34±4.20)、(173.13±0.62)、(130.01±2.76)pg/ml,鐵含量隨著姜黃素濃度的升高而降低,而姜黃素濃度為50 μmol/L時鐵含量為〔(154.41±1.86)pg/ml〕較25 μmol/L時有所升高,姜黃素濃度為25 μmol/L時,鐵含量最低,因此本研究選擇姜黃素的最佳作用濃度為25 μmol/L。

2.3各組肝細胞存活率的比較 與正常組相比,模型組細胞存活率顯著降低(P<0.05);與模型組相比,姜黃素組細胞存活率顯著升高(P<0.05),Fe2+組細胞存活率顯著降低(P<0.05);與Fe2+組相比,姜黃素+Fe2+組細胞存活率顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組肝細胞存活率、TG含量及Hepcidin、Fpn-1 mRNA和蛋白表達水平比較

2.4各組肝細胞TG含量比較 與正常組相比,模型組TG含量顯著升高(P<0.05);與模型組相比,姜黃素組TG含量顯著降低(P<0.05),Fe2+組TG含量顯著升高(P<0.05);與Fe2+組相比,姜黃素+Fe2+組TG含量顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.5各組肝細胞中Hepcidin和Fpn-1 mRNA和蛋白表達水平的比較 與正常組相比,模型組Hepcidin mRNA顯著降低(P<0.05),Fpn-1 mRNA及蛋白表達水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,姜黃素組Hepcidin mRNA及蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),Fpn-1 mRNA及蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),Fe2+組Hepcidin mRNA及蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),Fpn-1 mRNA及蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),Fpn-1蛋白升高,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與Fe2+組相比,姜黃素+Fe2+組Hepcidin mRNA及蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),Fpn-1 mRNA及蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),見表1、圖2。

圖2 各組肝細胞中Hepcidin和Fpn-1蛋白表達

3 討 論

近年來,由于人們生活水平的提高,高脂肪飲食導致的NAFLD的發(fā)病率逐年增加,且越來越趨于年輕化〔2〕。NAFLD的發(fā)病機制復雜,胰島素抵抗、腸道菌群紊亂、脂毒性、內(nèi)質網(wǎng)應激等因素均能促進NAFLD的發(fā)展〔13〕。西醫(yī)治療NAFLD的方式主要有藥物治療、手術治療和肝移植等,針對NAFLD的治療藥物主要包括抗氧化劑、腸道菌群調(diào)節(jié)藥物、護肝藥和胰島素增敏劑等,目前仍無用來治療NAFLD的特效藥〔14〕。游離脂肪酸能夠合成TG,過量的TG會引起肝脂肪變性,因此游離脂肪酸常被用于脂肪變性細胞模型的構建〔15〕。故本研究采用1 mmol/L游離脂肪酸構建NAFLD大鼠肝細胞模型,油紅O染色結果可見模型組大鼠中出現(xiàn)大量脂滴聚集,表明模型構建成功。

姜黃素具有抗炎、抗氧化應激、抗纖維化和抗腫瘤等的作用。研究表明,姜黃素對NAFLD具有保護作用,Yan等〔16〕發(fā)現(xiàn),姜黃素能夠明顯減輕肝脂肪的變性,Lee等〔17〕也發(fā)現(xiàn),姜黃素類似物能夠改善高脂飲食誘導的肥胖小鼠的胰島素抵抗和肝脂肪變性。本研究表明姜黃素對NAFLD大鼠肝細胞具有顯著的保護作用。

鐵是人體內(nèi)不可缺少的微量元素,肝臟是脂質代謝和儲存鐵的主要場所,而NAFLD又同時具有肝臟損傷和脂質過度沉積的特點,因而鐵超載與NAFLD之間有著密切的聯(lián)系〔18〕。Hepcidin是一種主要由肝細胞合成和分泌的抗菌多肽,是調(diào)節(jié)鐵代謝的關鍵因子;Fpn是膜鐵輸出蛋白,能夠將細胞內(nèi)的鐵轉運到血液中,對于細胞間鐵的轉運是必需的;Hepcidin與其受體Fpn結合,誘導Fpn內(nèi)吞繼而被溶酶體降解,從而減少鐵從十二指腸和巨噬細胞進入血液的水平,因此Hepcidin和Fpn對維持機體的鐵穩(wěn)態(tài)具有重要作用〔19,20〕。研究表明,約1/3的NAFLD患者表現(xiàn)出鐵穩(wěn)態(tài)紊亂的跡象,Marmur等〔21〕發(fā)現(xiàn)在NAFLD中血清Hepcidin的水平與鐵含量有關,Chen等〔22〕發(fā)現(xiàn)Hepcidin的過表達能夠加速NAFLD的發(fā)展,Meli等〔23〕發(fā)現(xiàn)飼喂高脂飼料的大鼠血清中Hepcidin的含量增加,而Fpn-1的含量隨之下調(diào)。本研究結果顯示,姜黃素能夠顯著降低鐵蛋白的含量,能夠在升高Hepcidin水平的同時降低Fpn-1的水平,表明姜黃素是通過調(diào)節(jié)鐵負荷來保護NAFLD大鼠肝細胞模型的。

綜上所述,姜黃素對NAFLD大鼠肝細胞模型具有保護作用,這種保護作用是姜黃素通過調(diào)節(jié)細胞中鐵負荷來實現(xiàn)的。