miR-630靶向Slug信號通路影響人腎癌細(xì)胞株侵襲、遷移的作用

孫偉 張煒 付橋 胡志 徐律 褚浩 王瀟

(武漢市第三醫(yī)院泌尿外科,湖北 武漢 430000)

腎癌是我國常見的一種泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤。4.4/10.0萬是腎癌在全球范圍內(nèi)的年齡標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率,且近年來我國腎癌發(fā)病率和死亡率逐年上升,已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題〔1,2〕。目前腎癌的放化療效果均不佳,根治性腎切除手術(shù)僅針對局限性腎癌有效,晚期腎癌患者雖可采用藥物靶向治療,但因腎癌惡性程度高、進(jìn)展速度快、治療復(fù)雜性高等特點(diǎn)導(dǎo)致治療總體預(yù)后差、療效不佳且死亡率高,同時腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移嚴(yán)重威脅患者生命健康〔3,4〕。因此探索更高效的分子靶向治療藥物和腎癌侵襲轉(zhuǎn)移分子標(biāo)記對于腎癌的治療具有重要意義。惡性腫瘤常伴隨上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,在腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中發(fā)揮重要作用〔5〕。鋅指轉(zhuǎn)錄因子Slug是一種具有鋅指結(jié)構(gòu)的上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)錄因子,作為E-鈣黏蛋白(cadherin)的抑制因子參與調(diào)控癌細(xì)胞侵襲和遷移〔6〕,研究發(fā)現(xiàn)藥物治療后下調(diào)Slug信號通路可抑制腎癌細(xì)胞侵襲和遷移〔7〕。微小核糖核酸(miR)-630參與調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展,據(jù)報道,miR-630過表達(dá)對食管癌細(xì)胞的侵襲和遷移有抑制作用〔8〕。然而又有研究指出,miR-630在腎癌中發(fā)揮促癌作用,抑制miR-630表達(dá)可抑制腎癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移〔9〕,且有臨床研究表明,miR-630在腎癌組織中的表達(dá)顯著高于正常組織,高表達(dá)miR-630與腎癌患者預(yù)后不良密切相關(guān)〔10〕。miR-630靶向Slug可抑制甲狀腺癌細(xì)胞侵襲能力〔11〕。但miR-630對腎癌細(xì)胞發(fā)展的影響是否與Slug信號通路相關(guān)還不明確。故本研究以腎癌ACHN細(xì)胞株為研究對象,對miR-630在腎癌ACHN細(xì)胞中的作用和靶點(diǎn)Slug信號通路進(jìn)行了系統(tǒng)的分析和研究,旨在為腎癌臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與試劑 人腎癌細(xì)胞株ACHN,上海雅吉生物科技有限公司;攜帶miR-630 inhibitor(序列:5′-ACCUUCCCUGGUACAGAAUACU-3′)慢病毒、攜帶miR-630抑制劑陰性對照慢病毒(NC inhibitor,序列:5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′)、miR-630 mimics陰性對照(NC mimics,正義鏈5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,反義鏈5′-ACGUG ACACGUUCGGAGAATT-3′)、攜帶miR-630模擬物(miR-630 mimics,序列:正義鏈5′-AGUAUUCUGUACCAGGGAAGGU-3′,反義鏈5′-ACGUGACACG UUCGGAGAATT-3′)慢病毒、野生型和突變型Slug-3′非翻譯區(qū)(UTR)報告基因質(zhì)粒(野生型pMIR-Report-Luc-Slug、突變型pMIR-Report-Luc-Slug),伊萊博生物科技(上海)有限公司;小鼠抗人E-cadherin(C1817)、N-cadherin(17-3904M)、Vimentin(ab97046)、Slug(ab27568)、磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體(ab8245,一抗)、兔抗小鼠E-cadherin(ab76055)、N-cadherin(ab280375)、Vimentin(ab92547)、Slug(ab78105)、GAPDH辣根過氧化物酶標(biāo)記多克隆抗體(LS-C66774,二抗),上海信帆生物科技有限公司;總RNA提取試劑盒(批號:15596026),美國Thermo;二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(69-97682),武漢默沙克生物科技有限公司;E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Slug、miR-630和GAPDH聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物,圣克魯斯生物技術(shù)(上海)有限公司;侵襲小室(Transwell)板、基質(zhì)膠(北京萌壯科技有限公司,生產(chǎn)批號:3421、356234);結(jié)晶紫(美國AMRESCO,生產(chǎn)批號:0528-500G);雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(RG027),上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2儀器 XSP-GX8F熒光顯微鏡(上海光學(xué)儀器六廠);CKX53倒置顯微鏡(日本奧林巴斯);TG-16W型離心機(jī)(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司);JY02G型凝膠成像儀(北京海富達(dá)科技有限公司);GT100型熒光定量PCR儀(北京同洲維普科技有限公司);Quantity One4.5.6軟件(美國Bio-Rad公司);ImageJ軟件(美國國立衛(wèi)生研究院);EnVision型多功能酶標(biāo)儀(英國珀金埃爾默)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)傳代、轉(zhuǎn)染及分組 人腎癌ACHN細(xì)胞株在杜氏改良培養(yǎng)液(DMEM)培養(yǎng),培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清。細(xì)胞保存在含有5%CO2的37 ℃潮濕氣氛中。將對數(shù)期ACHN細(xì)胞接種到24孔板,待其達(dá)到80%融合時,分別轉(zhuǎn)染pGFP-hsa-NC inhibitor慢病毒、pGFP-hsa-miR-630 mimics慢病毒和pGFP-hsa-miR-630 inhibitor慢病毒,依次記為陰性對照組、過表達(dá)組、低表達(dá)組,以未轉(zhuǎn)染的ACHN細(xì)胞作為正常組,具體操作步驟依據(jù)慢病毒轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后48 h,各組ACHN細(xì)胞在熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.4Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞侵襲能力 轉(zhuǎn)染后的各組ACHN細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h,采用Transwell法檢測腎癌細(xì)胞株ACHN侵襲活性。細(xì)胞消化后,6 000 r/min(離心有效半徑為7 cm)離心5 min,用不含胎牛血清的DMEM重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個/ml,將100 μl細(xì)胞懸液置于預(yù)鋪基質(zhì)膠的Transwell小室上室,下室中添加含10%胎牛血清的培養(yǎng)基500 μl。孵育48 h后,細(xì)胞用4%多聚甲醛固定,再用0.5%結(jié)晶紫染色20 min,最后在倒置顯微鏡下計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.5劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞遷移能力 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h,采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞遷移活性。標(biāo)記筆在6孔板背后每隔0.5 cm畫一道橫線,每孔至少穿過5條線。每孔加入約1×106個細(xì)胞。24 h后使用10 μl槍頭在單層細(xì)胞上劃痕,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖掉劃下的細(xì)胞,加無血清RPMI1640培養(yǎng)液,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)。在0、48 h時倒置顯微鏡拍照,應(yīng)用Quantity One4.5.6軟件分析各組劃痕間距。

1.6實(shí)時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測miR-630表達(dá)及Slug、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin mRNA表達(dá) 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h,提取其總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件:95 ℃,8 min;95 ℃,8 s;63 ℃,15 s;72 ℃,15 s;40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt計算待測基因的相對表達(dá)量〔12〕。引物序列:miR-630上游引物5′-AACTTAACATCATGCTACCT-3′,下游5′-TATAGTTAAGAACTACCTT-3′;Slug上游引物5′-CCTGGTTGCTTCAAGGACAC-3′,下游5′-TCCATGCT CTTGCAGCTCTC-3′;E-cadherin上游引物5′-TTAAACTCCTGGCCTCAAGCAATC-3′,下游5′-TCCTAT CTTGGGCAAAGCAACTG-3′;N-cadherin上游引物5′-GTGCCATTAGCCAAGGGAATTCAGC-3′,下游5′-GCGTTCCTGTTCCACTCATAGGAGG-3′;Vimentin上游引物5′-TTGAACGCAAAGTGGAATC-3′,下游5′-AGGTCAGGCTTGGAAACA-3′;GAPDH上游引物5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′,下游5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。

1.7Western印跡法檢測各組Slug、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá) 細(xì)胞用冷PBS洗滌,在哺乳動物蛋白提取試劑RIPA緩沖液中溶解,并添加蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物。用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白濃度進(jìn)行定量,10 μg/μl為蛋白終濃度。每組4 μl蛋白加到上樣孔中進(jìn)行電泳,轉(zhuǎn)膜,加入一抗(小鼠抗人Slug、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、GAPDH單克隆抗體稀釋倍數(shù)分別為1∶500、1∶500、1∶1 000、1∶1 000、1∶500),4 ℃孵育過夜,室溫下孵育兔抗小鼠E-cadherin、Slug、N-cadherin、Vimentin、GAPDH二抗(稀釋倍數(shù)分別為:1∶500、1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶500)后,顯影反應(yīng),采用凝膠成像儀拍照,ImageJ軟件分析蛋白印跡灰度值。

1.8雙熒光素酶報告基因檢測驗(yàn)證miR-630是否靶向Slug信號通路 利用TargetScan8.0數(shù)據(jù)庫〔13〕檢測miR-630靶基因。將腎癌細(xì)胞株ACHN接種至96孔板中,待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,將0.1 μg/孔野生型pMIR-Report-Luc-Slug報告基因質(zhì)粒和20 nmol/L miR-630 mimics共轉(zhuǎn)染至腎癌細(xì)胞株ACHN,同樣將0.1 μg/孔突變型pMIR-Report-Luc-Slug報告基因質(zhì)粒和20 nmol/L miR-630 mimics共轉(zhuǎn)染至腎癌細(xì)胞株ACHN。同時分別設(shè)置野生型pMIR-Report-Luc-Slug質(zhì)粒和NC mimics共轉(zhuǎn)染組、突變型pMIR-Report-Luc-Slug質(zhì)粒和NC mimics共轉(zhuǎn)染組為對照。轉(zhuǎn)染48 h后,PBS洗滌細(xì)胞,加入裂解液緩沖液裂解細(xì)胞,多功能酶標(biāo)儀測量熒光強(qiáng)度。結(jié)果以螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶熒光強(qiáng)度的比值表示。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組ACHN細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染成功細(xì)胞在熒光顯微鏡下為綠色熒光,未轉(zhuǎn)染成功細(xì)胞在熒光顯微鏡下無熒光。陰性對照組、過表達(dá)組和低表達(dá)組的轉(zhuǎn)染效率依次為(87.39±17.36)%、(86.11±17.01)%、(85.43±16.98)%,各組間轉(zhuǎn)染效率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 各組腎癌ACHN細(xì)胞株轉(zhuǎn)染后熒光(×200)

2.2各組細(xì)胞侵襲能力 與陰性對照組、正常組比較,過表達(dá)組穿膜細(xì)胞數(shù)量明顯升高(P<0.05);與陰性對照組、正常組和過表達(dá)組比較,低表達(dá)組穿膜細(xì)胞數(shù)量明顯降低(P<0.05)。見圖2、表1。

表1 各組miR-630 mRNA及穿膜細(xì)胞數(shù)、劃痕間距比較

圖2 各組細(xì)胞侵襲能力Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果(結(jié)晶紫染色,×100)

2.3各組ACHN細(xì)胞遷移能力 48 h時,與陰性對照組、正常組比較,過表達(dá)組劃痕間距明顯減小(P<0.05);與正常組、陰性對照組和過表達(dá)組比較,低表達(dá)組劃痕間距明顯增加(P<0.05)。見表1、圖3。

圖3 各組細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)(×100)

2.4各組ACHN細(xì)胞miR-630、Slug、N-cadherin、E-cadherin和Vimentin mRNA表達(dá)比較 與陰性對照組、正常組比較,過表達(dá)組miR-630、Vimentin和N-cadherin mRNA表達(dá)顯著增高,E-cadherin和Slug表達(dá)顯著降低(P<0.05);與陰性對照組、正常組和過表達(dá)組比較,低表達(dá)組miR-630、N-cadherin和Vimentin mRNA表達(dá)顯著降低,E-cadherin和Slug mRNA表達(dá)顯著增高(P<0.05)。見表1、表2。

表2 各組Slug、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin mRNA及蛋白表達(dá)比較

2.5各組ACHN細(xì)胞Slug、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)比較 與陰性對照組和正常組比較,過表達(dá)組Vimentin和N-cadherin蛋白表達(dá)明顯增高,E-cadherin和Slug蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05);與陰性對照組、正常組和過表達(dá)組比較,低表達(dá)組Vimentin和N-cadherin表達(dá)明顯降低,E-cadherin和Slug表達(dá)明顯增高(P<0.05)。見表2、圖4。

圖4 各組Slug、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)

2.6miR-630靶向Slug信號通路驗(yàn)證 miRNA靶基因預(yù)測Slug為miR-630潛在靶基因。miR-630與Slug的3′UTR區(qū)堿基互補(bǔ)配對序列見圖5。在轉(zhuǎn)染野生型pMIR-Report-Luc-Slug質(zhì)粒細(xì)胞中,miR-630 mimics組相對熒光強(qiáng)度比NC mimins組明顯低(P<0.001);miR-630 mimics組與NC mimins組相比,轉(zhuǎn)染突變型pMIR-Report-Luc-Slug質(zhì)粒細(xì)胞相對熒光強(qiáng)度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果

圖5 miR-630與其潛在靶基因Slug-3′UTR堿基互補(bǔ)序列

3 討 論

腎癌的發(fā)病誘因包含遺傳易感性或遺傳性疾病、肥胖、吸煙、各種對腎臟有毒的工業(yè)化學(xué)品、藥物和天然或人造放射性〔14〕。目前腎癌手術(shù)治療多選擇根治性腎切除,對于早期患者而言大多可痊愈,但腎癌初始階段很難診斷,通常發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)處于晚期,因此手術(shù)治療具有很大局限性;對于晚期腎癌患者通常使用藥物治療,盡管目前臨床已出現(xiàn)大量靶向藥物,但治療效果有限,5年生存率僅12%,且存在腎功能不全、腎衰竭等后遺癥、治療周期長等問題〔15,16〕。因此探索針對腎癌治療的關(guān)鍵靶點(diǎn),尋找更高效、更特異的藥物對于腎癌的治療至關(guān)重要。

以往癌癥報道顯示,miR-630功能具有多向性,在不同細(xì)胞環(huán)境中發(fā)揮不同作用,王青安子等〔17〕指出,miR-630可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲和遷移,發(fā)揮抑癌作用;但王智宇等〔18〕指出,miR-630可促進(jìn)膀胱尿路上皮癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移,發(fā)揮促癌作用;趙建軍〔19〕指出,miR-630在腎癌組織中表達(dá)水平顯著高于癌旁組織,且在腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN中表達(dá)水平高于腎小管上皮細(xì)胞系,抑制miR-630表達(dá)可抑制腎癌細(xì)胞生長并促進(jìn)其凋亡。本研究結(jié)果證明,miR-630可提高腎癌細(xì)胞侵襲和遷移能力。Cui等〔20〕指出,miR-630過表達(dá)通過激活核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB通路促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移,而Chen等〔21〕指出,miR-489-3p和miR-630協(xié)同作用靶向有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2發(fā)揮抑制腎癌作用,提示miR-630在腎癌中可能參與調(diào)節(jié)多個信號通路,不同信號通路組成網(wǎng)絡(luò)、相互作用,共同調(diào)節(jié)細(xì)胞行為,而本研究中miR-630的促癌作用占主導(dǎo)地位,因此發(fā)揮促癌作用。

上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化在癌癥轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用,研究表明抑制肺癌上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化可抑制癌細(xì)胞遷移、侵襲〔22〕。Slug是E-cadherin的抑制因子,N-cadherin和Vimentin共同調(diào)控惡性腫瘤中上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,miR-630可能是通過靶向調(diào)控Slug促進(jìn)腎癌上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)揮促癌作用。李建新等〔23〕指出,miRNA-3915靶向抑制Slug信號通路可抑制腎癌細(xì)胞侵襲和遷移作用;馮頂威等〔24〕指出,在肺癌中促進(jìn)N-cadherin和Vimentin表達(dá),抑制E-cadherin表達(dá),可促進(jìn)肺癌細(xì)胞上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、促進(jìn)肺癌細(xì)胞遷徙和侵襲。本研究與前述Slug相關(guān)研究結(jié)果相反,與N-cadherin、E-cadherin和Vimentin相關(guān)研究結(jié)果一致。Chen等〔25〕指出,肝癌細(xì)胞中miR-630靶向Slug抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移,本研究結(jié)果與該研究結(jié)果相反,首次證實(shí)miR-630可通過靶向Slug信號通路促進(jìn)腎癌轉(zhuǎn)移。

綜上,miR-630可能通過調(diào)節(jié)Slug信號通路,抑制E-cadherin表達(dá),促進(jìn)N-cadherin和Vimentin表達(dá)發(fā)揮促進(jìn)腎癌細(xì)胞侵襲和遷移作用。本研究初步闡釋了miR-630對人腎癌細(xì)胞株侵襲和遷移的作用和機(jī)制,為臨床治療腎癌分子靶向藥物的研發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。