基于HIF-1α/VEGF通路探討土家族麝針療法“活血生新”干預(yù)缺血性腦卒中大鼠的作用機(jī)制

余秀 涂星,3 陳嘉碧 袁麗君 李三宇 陳通華 李鴻 張鈺

(湖北民族大學(xué) 1風(fēng)濕性疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 恩施 445000;2醫(yī)學(xué)部;3武陵山中藥材檢驗(yàn)檢測(cè)中心)

缺血性腦卒中臨床表現(xiàn)為猝然昏仆、人事不知、口眼歪斜、語(yǔ)言不利等〔1～3〕。缺血性腦卒中作為世界第二死因與第一致殘?jiān)?其致死率僅次于缺血性心臟病,給個(gè)人和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)〔4〕。

土家族麝針療法是土家族民間流傳甚久的一種常用治療方法,用于穿刺癤腫膿皰、針刺穴位、局部放血等〔5〕。前期研究表明〔6～8〕,土家族麝針療法對(duì)缺血性腦卒中大鼠的血液循環(huán)具有較好的改善作用,可以促進(jìn)缺血性腦卒中大鼠的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能的改善,其通過(guò)調(diào)節(jié)血清、血漿中的細(xì)胞因子可以改善腦部缺血的狀態(tài),從而減少缺血對(duì)腦部的損傷,達(dá)到腦保護(hù)的作用,其作用機(jī)制可能與麝針具有芳香化濁、通筋脈、行氣滯、散瘀血作用有關(guān)。

在缺血性腦卒中早期,缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α可促使細(xì)胞凋亡,在后期則促使細(xì)胞增殖,因此HIF-1α可能屬于雙向調(diào)節(jié)因子。HIF-1α磷酸化后可激活血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等抗凋亡基因,一方面促進(jìn)微血管和側(cè)支循環(huán)的形成,增加腦血流量,同時(shí)刺激神經(jīng)元細(xì)胞增殖、分化等,起到腦保護(hù)作用〔9〕。VEGF具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、誘發(fā)血管形成及增加血管通透性的功能,在缺氧條件下,VEGF作為HIF-1α的靶基因之一,被HIF-1α誘導(dǎo)而轉(zhuǎn)錄激活〔10,11〕。

缺血性腦卒中在損傷機(jī)制與缺血缺氧的情況下,泛素會(huì)被HIF-1α激活上調(diào)HIF-1α,進(jìn)而促進(jìn)了VEGF的表達(dá)釋放,導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖分裂與VEGF受體(VEGFR)2結(jié)合,使Src蛋白過(guò)度釋放,進(jìn)而導(dǎo)致一氧化氮合酶(NOS)的釋放改變,從而使血管的通透性和血管的新生增強(qiáng),達(dá)到改善缺血性腦卒中的目的。因此,調(diào)控HIF-1α/VEGF通路可能促進(jìn)缺血性腦卒中的康復(fù)。但土家族麝針療法治療缺血性腦卒中大鼠的作用機(jī)制是否與HIF-1α/VEGF通路表達(dá)有關(guān),未見相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)研究HIF-1α/VEGF通路探討土家族麝針療法干預(yù)缺血性腦卒中模型(MACO)大鼠的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD雄性大鼠80只,5～7周齡,體質(zhì)量(200±20)g,購(gòu)于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào):SCXK(鄂)2015-0001。飼養(yǎng)環(huán)境溫度(22±2)℃,濕度50%～70%,12 h/12 h光暗體系。

1.2藥品及試劑 土家族麝針(實(shí)驗(yàn)室自制,專利號(hào):201720035406.2);水合氯醛(CP,批號(hào):150307,廣州化學(xué)試劑廠);大鼠蛋白激酶A ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司);通用型二抗試劑盒、β-actin抗體、山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG(北京中杉生物試劑公司);VEGFR2一抗(美國(guó) Abcam),電化學(xué)發(fā)光(ECL)超敏發(fā)光試劑盒(美國(guó)Thermo);酪氨酸蛋白激酶家族成員(Src)抗體(Cell Signaling Technology公司);其他試劑均為分析純。

1.3主要儀器 Western印跡電泳及轉(zhuǎn)膜裝置(國(guó)Bio-Rad公司);TU-1901紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);酶標(biāo)定量測(cè)定儀(德國(guó)Thermo公司);PELAMB DABIO 20雙光束紫外分光光度計(jì)(美國(guó)PerkinElmer公司);5810R 高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司);TS-Ⅰ型搖床(江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1缺血性腦卒中大鼠模型的制備及篩選 根據(jù)文獻(xiàn)〔6～8〕,取80只SD大鼠,隨機(jī)分成模型組(n=60),假手術(shù)組(n=20)。水合氯醛以3 ml/kg劑量麻醉后大鼠,頸部正中縱行切口切開皮膚,依次分離肌肉及皮下組織,暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈,結(jié)扎頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈,經(jīng)切口插入制備好的栓線,經(jīng)過(guò)頸總動(dòng)脈分叉處、頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)入顱底至較細(xì)的大腦前動(dòng)脈,阻斷頸內(nèi)動(dòng)脈、大腦前動(dòng)脈及大腦后動(dòng)脈血流供應(yīng),固定線栓后逐層縫合皮膚,回籠飼養(yǎng)。假手術(shù)組僅給予假手術(shù)而不進(jìn)行線栓栓塞及結(jié)扎。按照 Zea-longa 5級(jí)評(píng)分法〔12〕對(duì)造模大鼠進(jìn)行評(píng)分,選取評(píng)分為 1～3 分的造模大鼠作為成功的模型大鼠。最后大鼠造模組共成功45只,假手術(shù)組成功15只。

1.4.2缺血性腦卒中大鼠模型的分組與治療〔6～8〕將造模成功的大鼠隨機(jī)分為麝針組、針刺組、模型組,每組15只,另取假手術(shù)組15只。

1.4.3神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià) 通過(guò)平衡木實(shí)驗(yàn)〔13〕來(lái)檢測(cè)大鼠的運(yùn)動(dòng)功能。平衡木長(zhǎng) 100 cm,寬2 cm,高80 cm,兩端各有一平臺(tái),大鼠放置在平衡木上,觀察120 s,根據(jù)大鼠在平衡木上表現(xiàn)評(píng)分,得分越高說(shuō)明平衡能力越差。于治療前和每個(gè)療程后每組隨機(jī)取6只大鼠測(cè)試。

1.4.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血漿中 HIF-1α、VEGF含量 取備測(cè)血漿,室溫復(fù)溶后采用ELISA檢測(cè)血漿中 HIF-1α、VEGF含量,具體操作按照試劑盒進(jìn)行。

1.4.5Western印跡檢測(cè)海馬組織中VEGFR2和Src蛋白表達(dá) 取備測(cè)蛋白樣品,室溫復(fù)溶后采用Western印跡檢測(cè)VEGFR2和Src蛋含量,具體操作按照試劑盒進(jìn)行。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況 治療前,與假手術(shù)組比較,模型組、麝針組、針刺組運(yùn)動(dòng)功能皆顯著下降且各組間無(wú)明顯差異(P<0.05);經(jīng)過(guò)治療后,隨著療程增加,各造模組平衡木測(cè)試評(píng)分不同程度降低(P<0.05),且麝針組運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)更明顯(P<0.05)。見表1。

表1 不同療程各組平衡木測(cè)試評(píng)分分)

2.2各組血漿中HIF-1α、VEGF的含量 治療前,與假手術(shù)組相比,各造模組血漿中HIF-1α、VEGF含量顯著升高(P<0.05),且各造模組無(wú)顯著差異(P>0.05)。經(jīng)過(guò)3個(gè)療程治療后,各造模組血漿中HIF-1α、VEGF含量較治療前明顯升高(P<0.05);與模型組比較,麝針組及針刺組血漿中HIF-1α、VEGF含量均顯著升高(均P<0.05)。見表2。

表2 各組血漿HIF-1α、VEGF含量及海馬VEGFR2、Src蛋白表達(dá)

2.3海馬組織中VEGFR2、Src蛋白表達(dá)的變化 治療3個(gè)療程后,與假手術(shù)組相比,模型組、針刺組和麝針組VEGFR2、Src蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著升高且各組間差異顯著(P<0.05)。與模型組比較,針刺組和麝針組海馬中VEGFR2蛋白表達(dá)量明顯升高,麝針組Src蛋白表達(dá)量明顯降低(均P<0.05),與針刺組比較,麝針組海馬中VEGFR2蛋白表達(dá)量顯著升高,Src蛋白表達(dá)量明顯降低(均P<0.05)。見表2、圖2。

圖2 各組海馬組織中VEGFR2、Src蛋白表達(dá)

3 討 論

缺血性腦卒中是臨床上常見的腦血管疾病,腦組織作為人體需氧量和需血量最高的器官,一旦由于腦血管狹窄或閉塞使腦血流阻斷而導(dǎo)致一過(guò)性的缺血或者缺氧,就極易引起腦組織缺血缺氧性軟化甚至壞死,進(jìn)而能引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)大量神經(jīng)細(xì)胞損傷,從而出現(xiàn)長(zhǎng)期的神經(jīng)功能障礙〔14～16〕。但現(xiàn)代研究〔17,18〕發(fā)現(xiàn),腦損傷后神經(jīng)功能具有一定自發(fā)恢復(fù)能力,可能與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷早期腦神經(jīng)的可塑性有關(guān)。

缺血性腦卒中大鼠在缺血缺氧的情況下,HIF-1α 表達(dá)隨著腦組織缺氧加重而升高,而HIF-1α可以調(diào)控多個(gè)下游靶基因,其中VEGF作為最有效的血管生成因子之一,可以介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖,導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖分裂與VEGFR2結(jié)合,使Src過(guò)度釋放,進(jìn)而導(dǎo)致NOS的釋放改變,減少腦部因缺血缺氧所致的損傷,起到腦保護(hù)作用,從而達(dá)到改善缺血性腦卒中的目的。

本研究結(jié)果顯示,土家族麝針療法促進(jìn)缺血大鼠運(yùn)動(dòng)功能的康復(fù)、改善腦部血流情況的作用可能是通過(guò)激活HIF-1α/VEGF信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。