溫潤(rùn)通脈方調(diào)控氧化應(yīng)激水平對(duì)充血性心力衰竭大鼠心肌的保護(hù)作用

賈運(yùn)時(shí) 劉琪 馬秀娟 宋溫婷 付玉娜 陳華

(1石家莊市中醫(yī)院心病二科,河北 石家莊 050051;2河北省人民醫(yī)院)

充血性心力衰竭是由遺傳、能量代謝等多種因素共同參與,導(dǎo)致心臟泵血功能降低、血液運(yùn)行遲滯的一種臨床多發(fā)疾病。主要特征為心排血量降低及血液灌流減少等,故又稱心功能不全〔1,2〕。該病具有高發(fā)病率、高致殘率及高死亡率,且隨著年齡的增加,患病風(fēng)險(xiǎn)也隨之上升,這對(duì)患者的生命健康造成了極大威脅,因此探尋一種有效的防治手段已成為醫(yī)學(xué)界重點(diǎn)關(guān)注的課題之一〔3,4〕。充血性心力衰竭的病因復(fù)雜,目前尚不完全明確,目前已知的主要有心肌重塑、微循環(huán)障礙、趨化因子及神經(jīng)內(nèi)分泌激活和心肌細(xì)胞凋亡等幾個(gè)方面〔5〕。研究表明,氧化應(yīng)激在心血管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能異常中發(fā)揮重要作用,其產(chǎn)生的過(guò)量氧自由基會(huì)對(duì)心肌細(xì)胞膜造成損傷,從而促進(jìn)心室重構(gòu)并造成心肌能量代謝缺陷,最終加重心肌損傷,因此抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)理論上可延緩心力衰竭病情的發(fā)展〔6〕。目前,臨床上治療充血性心力衰竭多為西藥治療,但效果并不理想,存在副作用大、長(zhǎng)期預(yù)后效果欠佳等問(wèn)題,而中醫(yī)作為我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué),其具有完整的理論體系,且安全性高,在心力衰竭方面具有廣闊的發(fā)展前景〔7,8〕。溫潤(rùn)通脈方是由炒白芍、桂枝、茯苓及炙甘草四藥配伍的傳統(tǒng)中藥方劑,其具有補(bǔ)益心陽(yáng)、調(diào)和營(yíng)血、溫通血脈、化陰養(yǎng)血,溫潤(rùn)通脈之效〔9〕。而心力衰竭正是心陽(yáng)不足、虛衰而竭、血行不暢等原因所致,但目前臨床有關(guān)其對(duì)心力衰竭的研究幾近于無(wú),因此本文就溫潤(rùn)通脈方調(diào)控氧化應(yīng)激水平對(duì)充血性心力衰竭大鼠心肌保護(hù)作用進(jìn)行研究探討,為臨床治療缺血性心力衰竭提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 北京億鳴復(fù)興生物科技有限公司提供的60只SPF級(jí)SD大鼠〔合格證書(shū)為:SCXK(京)2018-0006〕,體質(zhì)量250～300 g,單籠喂養(yǎng),室溫生長(zhǎng),無(wú)菌自由進(jìn)食、進(jìn)水2 w,按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2試劑與儀器 參芪益心湯、溫潤(rùn)通脈湯均由醫(yī)院煎劑室提供。硫辛酸(批號(hào):SND-1705)購(gòu)自滁州仕諾達(dá)生物科技有限公司。生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)、大小鼠便攜式彩色多普勒超聲成像儀(型號(hào):MyLab)均購(gòu)自上海玉研科學(xué)儀器有限公司。德國(guó)Eppendorf公司高速冷凍離心機(jī)(型號(hào):5024R)。日本OLYMPUS公司光學(xué)顯微鏡(型號(hào):CX-60)。德國(guó)Leica公司自動(dòng)包埋機(jī)(型號(hào):EG1150)。Sigma-AldrichLLC.公司多聚甲醛(批號(hào):158127)。上海一研生物科技有限公司蘇木素染液(批號(hào):EY-19374)。上海吉至生化科技有限公司伊紅染液(批號(hào):AG1100-100 ml)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(批號(hào):446502)購(gòu)自美國(guó)R&D公司。南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(批號(hào):HBS-ScanX)。放射免疫沉淀測(cè)定(RIPA)裂解液(批號(hào):SY4680)、生理鹽水(YT3740)均購(gòu)自北京伊塔生物科技有限公司。江蘇凱基生物科技發(fā)展有限公司的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒、電化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)試劑盒(批號(hào):KGP113、KGP1123)。超氧化物歧化酶(SOD)抗體(批號(hào):PL0402056)購(gòu)自深圳豪地華拓生物科技有限公司。丙二醛(MDA)抗體(批號(hào):PAB14355)購(gòu)自上海群己生物科技有限公司。GAPDH抗體(批號(hào):10094-MM09-50)購(gòu)自北京義翹神州科技股份有限公司。

1.3模型制備與分組 選取40只SPF級(jí)SD雄性大鼠,隨機(jī)分為正常(N)組,模型(M)組,參芪益心方(S)組,溫潤(rùn)通脈方(W)組,每組10只。M、S、W組進(jìn)行充血性心力衰竭建模大鼠給予腹腔注射鹽酸阿霉素,共注射6 w,單周注射劑量為3 mg/kg,雙周注射劑量為2 mg/kg,每周注射1次,注射完成后,用彩超測(cè)定計(jì)算出左心指數(shù),當(dāng)左心指數(shù)≤180 ml/(min·kg)時(shí)視為建模成功,N組建模,同期給予同體積生理鹽水。建模成功后,S組灌胃參芪益心湯20 g/kg,W組灌胃溫潤(rùn)通脈湯6 g/kg,1次/d,N組、M組同期灌胃同體積生理鹽水,持續(xù)28 d。

1.4血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定 給藥完成后用生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)測(cè)量各組大鼠心率(HR)、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末期壓(LVEDP)等血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

1.5心肌功能測(cè)定 由電檢科醫(yī)生為各組大鼠做彩色超聲多普勒心動(dòng)圖,測(cè)定左室收縮末期內(nèi)徑(LVSD)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVDD)、室間隔(IVS)、左心室勞損(LVS)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF),各項(xiàng)數(shù)值均經(jīng)計(jì)算機(jī)處理后獲得。

1.6標(biāo)本采集 大鼠眼球取血5 ml,將其放入冷水浴冷卻的酶抑制抗凝管中,搖勻后冷藏2 h,2 500 r/min離心7 min,棄掉上清液,得血漿樣品放入冰箱密封保存,同時(shí)取心肌組織,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后,用4%的多聚甲醛固定96 h,洗滌后在冰箱中密封保存。

1.7心肌組織病理檢測(cè) 心肌組織常規(guī)石蠟包埋、切片,二甲苯脫蠟、梯度乙醇復(fù)水后蘇木素-伊紅(HE)染色,除去多余染液后,用梯度乙醇脫水、二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片處理后光學(xué)顯微鏡進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

1.8血漿SOD、MDA水平測(cè)定 采用ELISA檢測(cè),嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作,配制標(biāo)準(zhǔn)品,然后進(jìn)行溫育30 min、洗滌5次、加酶、再溫育30 min、洗滌5次處理,拍干后在37 ℃下避光顯色15 min,加入終止液終止反應(yīng),立即在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)SOD、MDA吸光度計(jì)算SOD、MDA水平。

1.9心肌組織中SOD、MDA蛋白表達(dá)檢測(cè) 另取20只大鼠,建模后隨機(jī)分為兩組,一組給予灌胃60 mg/kg氧化應(yīng)激抑制劑硫辛酸,記為O組,一組給予硫辛酸聯(lián)合溫潤(rùn)通脈湯,記為T組,免疫印跡法檢測(cè)N、M、S、W、O、T組心肌組織中SOD、MDA蛋白,取心肌組織,清洗、剪碎后置于離心管中,加入RIPA裂解液,于冰上充分裂解10 min,10 000 r/min離心10 min,取上清液用二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白濃度用SDS-PAGE試劑盒進(jìn)行電泳,其步驟為濃縮膠80 V 30 min,分離膠120 V 1 h,將凝膠上蛋白用半干法轉(zhuǎn)移至甲醇活化的聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,120 V轉(zhuǎn)膜1.5 h,在7 ℃、5%BSA 條件下封閉2 h;按說(shuō)明書(shū)用封閉液稀釋一抗(1∶1 000),加入稀釋的SOD、MDA一抗,4 ℃搖床振蕩孵育過(guò)夜后洗膜;加入稀釋的二抗( 1∶5 000),37 ℃輕搖室溫孵育2 h;洗膜后,用電化學(xué)發(fā)光熒光試劑盒測(cè)定,以同一樣本中的GAPDH作為內(nèi)參,計(jì)算比值求得SOD、MDA蛋白的相對(duì)表達(dá)含量。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism8.0進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組血流動(dòng)力學(xué)結(jié)果 與N組相比,M組HR、SBP、DBP、LVSP、LVEDP均顯著升高(P<0.05);與M組比較,S、W組HR、SBP、DBP、LVSP、LVEDP均顯著降低(P<0.05),且W組比S組降低顯著(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 各組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)及血漿SOD、MDA水平比較

2.2各組血漿中SOD、MDA水平 與N組相比,M組血漿中SOD水平顯著降低(P<0.05),MDA水平顯著升高(P<0.05)。S、W組血漿中SOD水平較M組顯著升高(P<0.05),MDA水平顯著降低(P<0.05),W組比S組變化顯著(P<0.05),見(jiàn)表1。

2.3各組心肌功能相關(guān)指標(biāo)結(jié)果 與N組相比,M組LVSD、LVDD、IVS、LVS均顯著升高(P<0.05),LVEF顯著降低(P<0.05);與M組比較,S、W組LVSD、LVDD、IVS、LVS均顯著降低(P<0.05),LVEF顯著升高(P<0.05),且W組變化比S組顯著(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 各組心肌功能相關(guān)指標(biāo)比較

2.4各組心肌組織HE染色結(jié)果 N組心肌組織結(jié)構(gòu)正常且排列整齊,細(xì)胞質(zhì)紋理清晰,細(xì)胞核大小、形態(tài)基本一致,且未見(jiàn)間質(zhì)細(xì)胞增生及明顯壞死、萎縮等現(xiàn)象,而M組心肌組織結(jié)構(gòu)明顯松弛,心肌出現(xiàn)肌漿凝聚、核固縮,且有不同程度的顆粒及空泡變性,可見(jiàn)間質(zhì)面積明顯增大及出血,與M組相比,S、W兩組癥狀明顯改善,心肌組織結(jié)構(gòu)趨向完整,且W組比S組改善明顯,見(jiàn)圖1。

圖1 各組心肌組織(HE染色,×400)

2.5各組心肌組織中SOD、MDA蛋白表達(dá) 與N組相比,M組心肌組織中SOD蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05),MDA蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05);與M組比較,S、W組心肌組織中SOD蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05),MDA蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05),且W組變化比S組顯著(P<0.05),而O組與W組相比無(wú)明顯差異(P>0.05),T組比O組變化明顯(P<0.05),見(jiàn)表3、圖2。

圖2 各組心肌組織中SOD、MDA蛋白表達(dá)

表3 各組心肌組織SOD、MDA蛋白表達(dá)比較

3 討 論

本文結(jié)果說(shuō)明,溫潤(rùn)通脈方可顯著改善充血性心力衰竭大鼠血流動(dòng)力學(xué)。參芪益心方是經(jīng)臨床多年驗(yàn)證的有效治療心力衰竭的中藥方,該方緊扣心力衰竭的病因、病機(jī),加入了人參、黃芪等具有保護(hù)心肌作用的中藥,在活血利水、益氣溫陽(yáng)等方面發(fā)揮重要作用〔10〕。而溫潤(rùn)通脈方中炒白芍養(yǎng)血斂陰、柔肝止痛,桂枝能通經(jīng)脈、助心陽(yáng)、止悸動(dòng),茯苓可寧心安神、益心脾,炙甘草可益氣復(fù)脈、補(bǔ)益心脾,此四方配伍正合仲景“病痰飲者,當(dāng)以溫藥和之”之意〔11〕?，F(xiàn)代研究表明,心力衰竭的基本發(fā)病機(jī)制是血流動(dòng)力超負(fù)荷,導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)微循環(huán)出現(xiàn)紊亂,從而引起血管內(nèi)皮功能受到損傷,進(jìn)而加重局部臟器功能損傷,最終導(dǎo)致衰竭的出現(xiàn)〔12〕。而溫潤(rùn)通脈方可能是通過(guò)降低心肌的自律性,抑制交感神經(jīng)興奮,來(lái)提高心臟做功效率,增加心排血量及心肌供氧,從而抑制神經(jīng)體液細(xì)胞因子激活、抑制血管收縮、抑制醛固酮的分泌,進(jìn)而降低HR及血壓,有效緩解和逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)情況,最終達(dá)到改善血流動(dòng)力學(xué)的目的。董肖等〔13〕研究發(fā)現(xiàn),益氣通脈湯對(duì)慢性心力衰竭有顯著療效,可有效改善血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo),提高心臟供血能力,這與本文結(jié)果類似。

本研究表明,溫潤(rùn)通脈方具有顯著療效,其可有效改善充血性心力衰竭大鼠的心肌功能,并對(duì)其起到一定保護(hù)作用。本文選擇超聲心動(dòng)圖來(lái)評(píng)價(jià)大鼠的心肌功能,是因?yàn)槠湓谛呐K影像學(xué)中居主導(dǎo)地位,是評(píng)價(jià)心臟結(jié)構(gòu)及功能的重要手段,也是評(píng)估心力衰竭的唯一最有用的檢查工具〔14〕。心力衰竭最主要的特征就是心室功能障礙及神經(jīng)體液調(diào)改變,最終導(dǎo)致心肌功能受損,生存時(shí)間明顯縮短,而心力衰竭并不能根治,只能通過(guò)藥物治療來(lái)達(dá)到緩解癥狀或維持現(xiàn)狀的目的〔15〕。對(duì)于充血性心力衰竭大鼠,溫潤(rùn)通脈方可能是通過(guò)擴(kuò)冠、增加心肌灌流,來(lái)改善心肌舒張及收縮功能、增加心肺壓力感受器敏感性,從而降低外周血管阻力、改善毛細(xì)血管的血液循環(huán)、降低心臟后負(fù)荷,進(jìn)而降低心肌耗氧、抑制血小板聚集、降低心臟做功,最終抑制心室重構(gòu),改善大鼠疾病癥狀。研究發(fā)現(xiàn)〔16〕,養(yǎng)心通脈湯可顯著改善患者心功能,并對(duì)其心肌起到一定保護(hù)作用,這與本文結(jié)果類似。

本研究說(shuō)明,溫潤(rùn)通脈方可顯著抑制氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激是體內(nèi)抗氧化與氧化作用失衡的一種狀態(tài),被認(rèn)為是導(dǎo)致疾病和衰老的一個(gè)重要因素,而SOD及MDA是反映氧化應(yīng)激狀態(tài)的重要指標(biāo)〔17〕。SOD被視為生命科技中最具神奇魔力的酶,是機(jī)體內(nèi)氧自由基的頭號(hào)殺手,可保護(hù)細(xì)胞免受自由基攻擊,而MDA是細(xì)胞膜被氧化后形成的脂質(zhì)過(guò)氧化物,其水平可以用來(lái)評(píng)估體內(nèi)氧化應(yīng)激程度和脂質(zhì)過(guò)氧化損傷程度,在機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化損傷中扮演重要角色〔18〕。心室重構(gòu)是心力衰竭發(fā)生的核心基礎(chǔ),氧化應(yīng)激損傷心肌細(xì)胞膜,從而改變離子通道,加重心肌纖維化及心肌細(xì)胞損傷,促進(jìn)心室重構(gòu)〔19〕。而對(duì)于充血性心力衰竭大鼠,溫潤(rùn)通脈方可能是通過(guò)改善心肌收縮功能及心肌興奮,來(lái)抑制鈣離子的轉(zhuǎn)運(yùn),并改善細(xì)胞膜的流動(dòng)性及通透性,從而有效清除氧自由基、抑制細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化、抑制部分蛋白酶的活性,進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激水平,抑制心肌纖維化及心室重構(gòu),最終有效制止心力衰竭進(jìn)一步惡。王從陽(yáng)等〔20〕研究發(fā)現(xiàn),溫潤(rùn)通脈方可顯著提高SOD活力,降低MDA水平,這說(shuō)明其可顯著抑制氧化應(yīng)激水平,這與本文結(jié)果類似。

綜上所述,溫潤(rùn)通脈方對(duì)充血性心力衰竭大鼠具有顯著療效,可對(duì)心肌起到一定保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制氧化應(yīng)激來(lái)實(shí)現(xiàn)的。