消飲化瘀方調(diào)節(jié)P38MAPK表達(dá)治療慢性心力衰竭大鼠心肌纖維化

王銘 王秀萍 徐建虎

(寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,寧夏 銀川 750004)

慢性心力衰竭(CHF)是指心臟收縮和舒張功能發(fā)生障礙,使體循環(huán)或肺循環(huán)瘀血,從而出現(xiàn)心動(dòng)過速、呼吸困難、下肢水腫為主要表現(xiàn)的一組臨床綜合征〔1〕,是所有心臟疾病自然病程的最終歸宿,具有難以治愈且不可逆的特點(diǎn),成為嚴(yán)重危害患者健康的疑難病癥。心肌彌漫性纖維化是CHF的常見病理學(xué)改變,是心室重構(gòu)的主要原因〔2〕。心肌纖維化主要是由于細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的過量形成和沉淀,從而產(chǎn)生了瘢痕組織,進(jìn)而引起的心肌內(nèi)部結(jié)構(gòu)改變,導(dǎo)致心肌順應(yīng)性降低、心臟舒縮功能受損,長(zhǎng)期的容積或壓力過負(fù)荷最終可引起心力衰竭〔3〕。因此,改善心肌纖維化在防治CHF中起到極為重要的作用〔4,5〕。研究發(fā)現(xiàn)P38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)可以抑制ECM中膠原沉積,在改善心肌纖維化中起著重要作用〔6〕。中醫(yī)認(rèn)為CHF早、中期應(yīng)以瘀血立論,以扶正化瘀施治。課題組通過整理文獻(xiàn)及實(shí)驗(yàn)研究均發(fā)現(xiàn),單純從瘀血立論并不完全符合早期CHF的病機(jī),水飲病邪在其中發(fā)揮重要作用。前期研究結(jié)果表明,溫陽(yáng)消飲法可降低CHF大鼠血管緊張素(Ang)Ⅱ、腫瘤壞死因子(TNF)-α及白細(xì)胞介素(IL)-6,抑制炎癥反應(yīng)〔7〕;可升高CHF大鼠降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP),降低內(nèi)皮素(ET),調(diào)節(jié)心臟舒縮功能〔8〕;可通過磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT)信號(hào)通路抑制心肌細(xì)胞凋亡,防止心肌受損〔9〕,提示早期CHF“從飲論治”的科學(xué)性。同時(shí)選用血府逐瘀膠囊作為對(duì)照組藥物,二組藥物療效相當(dāng),說明水飲和瘀血在CHF早期均發(fā)揮了重要致病作用。因此,在CHF早期單純從瘀論治或從飲論治均是不全面的。所以本課題將“飲瘀致病”作為治療的切入點(diǎn),認(rèn)為CHF早期應(yīng)消飲化瘀,并通過消飲化瘀方干預(yù)CHF大鼠,揭示其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 6～8周齡雄性SD大鼠,SPF級(jí),體質(zhì)量240～260 g,由寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供〔許可證號(hào):SCXK(京)2019-0008〕。

1.2藥物及試劑 消飲化瘀方中藥材均購(gòu)自寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬回醫(yī)中醫(yī)院門診部,經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中藥教研室檢驗(yàn)合格;美托洛爾(阿斯利康藥業(yè)有限公司,批號(hào):H32025391);鹽酸阿霉素(源葉生物公司,批號(hào):S17092)。蘇木素染液(北京百靈威科技有限公司);伊紅染液(源葉生物,R20594);羥脯氨酸(Hyp)、Ⅰ型膠原(ColⅠ)及Ⅲ型膠原(ColⅢ)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒均購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司;P38MAPK抗體(BIOSS,BS0637R);β-actin抗體(Affinity,AF7018);山羊抗鼠的二抗(北京中杉,ZB2305ECL);電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(中杉金橋公司,貨號(hào)sc-2048);HiFiScriptT 快速去除基因組cDNA第一條鏈合成試劑盒(康為試劑,Cat# CW2582M);2*SYBR Mixture 熒光定量試劑盒(北京天根,Cat# FP-205-2)。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器 切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司,RM2016);電泳儀(北京六一公司,DYCZ-24DN);掃描儀(EPSON 公司,V19);熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-RAD,CFX ConnectTM);核酸蛋白定量?jī)x(美國(guó)丹諾爾,DS-11)。

1.4動(dòng)物分組及造模方法 用計(jì)算機(jī)隨機(jī)數(shù)字法將72只SD雄性大鼠分為空白組與A組,A組參考文獻(xiàn)〔10〕采用腹腔注射2 mg/kg鹽酸阿霉素復(fù)制CHF模型,每周2次,共12次。造模成功后將CHF大鼠隨機(jī)分為模型組、消飲化瘀方高、中、低劑量(中藥高、中、低)組、美托洛爾組,各12只。

1.5藥物干預(yù) 根據(jù)《中國(guó)藥典》藥物制備的相關(guān)要求,將消飲化瘀方濃縮至含生藥2 g/ml的藥液,給藥劑量按照成人與大鼠體表面積折算,分別給予消飲化瘀方高(28 g/kg)、中(14 g/kg)、低(7 g/kg)及美托洛爾(10 mg/kg)灌胃,空白組和模型組給予等量的生理鹽水,每日1次,連續(xù)4 w。

1.6蘇木素-伊紅(HE)染色觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化 取心肌組織放入4%多聚甲醛固定,經(jīng)沖水、梯度酒精脫水、透明、浸蠟、包埋等步驟后,制成切片,烘片60 ℃ 2 h后進(jìn)行脫蠟、梯度酒精脫水、蘇木素染色、鹽酸酒精分化、伊紅染色、透明、封片。顯微鏡下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化并拍照。

1.7ELISA檢測(cè)心肌組織中Hyp、ColⅠ、ColⅢ含量 用組織勻漿機(jī)將心肌組織勻漿,取上清。按照ELISA試劑盒說明書分別設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)品孔,空白孔及待測(cè)樣品孔。標(biāo)準(zhǔn)品孔加入不同梯度的標(biāo)準(zhǔn)品,待測(cè)樣品孔按照分組依次加入上清液及樣品稀釋液,空白孔不加。37 ℃孵育30 min;洗滌5次。除空白孔外,其余孔均加酶標(biāo)試劑。37 ℃孵育30 min,洗滌5次。加顯色液A、B,37 ℃避光顯色15 min,加終止液。用酶標(biāo)儀測(cè)定測(cè)量各孔的吸光度(OD)值,最后將OD值代入標(biāo)準(zhǔn)品的多項(xiàng)式二次回歸方程,確定最終濃度。

1.8Western印跡檢測(cè)心肌組織P38MAPK蛋白表達(dá) 將心肌組織加入RIPA裂解液,研磨,離心10 min,取上清,測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)蛋白定量的結(jié)果,加入相應(yīng)體積的總蛋白樣品與4×上樣緩沖液,95 ℃變性10 min,室溫平衡。將樣品加入配好的凝膠孔中,50 V進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),后濕轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脫脂奶粉封閉2 h,分別在孵育盒中孵育一抗P38MAPK(1∶800),4 ℃反應(yīng)過夜,用1×PBST洗滌3次,每次10 min。孵育二抗,常溫90 min,用1×PBST洗滌3次,每次10 min。ECL試劑盒曝光膠片,將膠片掃描后,用ImageJ軟件測(cè)定條帶灰度值。以β-actin為內(nèi)參。

1.9實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)心肌組織中P38MAPK mRNA表達(dá)水平 用Trizol提取心肌組織中總RNA,然后將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。引物序列(5′-3′):P38MAPK(106 bp):上游:CTCGGTGTGTGCTGCTT TTGAT,下游:CTCCCTGTAGGTCCTTTTGGCG;β-actin(93 bp):上游:CTGAGAGGGAAATCGTGCGTGA,下游:AGGAAGAGGATGCGGCAGTGGC。預(yù)變形95 ℃,15 min后,95 ℃變性10 s、退火30 s、72 ℃延伸30 s,40個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t法。

2 結(jié) 果

2.1消飲化瘀方對(duì)大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化的影響 HE染色結(jié)果顯示:空白組可見心肌細(xì)胞橫紋清楚,排列整齊,無肌纖維斷裂,胞質(zhì)均勻,表明心肌為正常結(jié)構(gòu);模型組可見心肌細(xì)胞排列紊亂,心肌間質(zhì)水腫,肌纖維斷裂,伴有大量的慢性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),出現(xiàn)明顯的心肌纖維化特征;各治療組與模型組相比,心肌細(xì)胞排列變整齊,無心肌纖維斷裂。見圖1。

圖1 各組心肌組織形態(tài)學(xué)(HE染色,×200)

2.2消飲化瘀方對(duì)心肌組織Hyp、ColⅠ、ColⅢ含量的影響 與空白組相比,模型組Hyp、ColⅠ、ColⅢ含量均明顯升高(P<0.01);與模型組相比,各治療組Hyp、ColⅠ、ColⅢ含量均有所下降,其中除中藥低、中劑量組Hyp,中藥低劑量組ColⅢ療效不明顯外,其他各指標(biāo)均明顯下降(P<0.05,P<0.01)。見表1。

表1 各組Hyp、ColⅠ、ColⅢ型含量 mRNA和蛋白表達(dá)比較

2.3消飲化瘀方對(duì)心肌組織P38MAPK蛋白及mRNA表達(dá)水平的影響 與空白組相比,模型組P38MAPK蛋白及mRNA含量明顯升高(P<0.01);與模型組相比,各治療組P38MAPK蛋白及mRNA含量明顯降低(P<0.05,P<0.01)。見表1、圖2。

1～6:空白組、模型組、美托洛爾組、中藥低、中、高劑量組

3 討 論

中醫(yī)將CHF歸屬于“心悸”“喘證”“水腫”“支飲”“心水”的范疇,認(rèn)為心陽(yáng)不足,鼓血無力,導(dǎo)致瘀血水飲內(nèi)停是其發(fā)病機(jī)制。2014年《慢性心力衰竭中醫(yī)診療專家共識(shí)》也指出了痰飲和瘀血在CHF中的重要性,提出活血化痰利水的治法〔11〕。消飲化瘀方是根據(jù)《金匱要略》“病痰飲者,當(dāng)以溫藥和之”的治療原則,選用苓桂術(shù)甘湯合葶藶大棗瀉肺湯為主方,加丹參、川芎、葛根組成。丹參、川芎、葛根經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)研究具有抗炎〔12〕、抗纖維化〔13〕、保護(hù)心臟〔14〕等作用,是治療心血管病的常用藥對(duì)。方中桂枝、甘草相伍,還具有溫補(bǔ)心陽(yáng)的作用;丹參除活血之功外,尚有補(bǔ)血之力。故消飲化瘀方溫陽(yáng)補(bǔ)血,消飲化瘀,標(biāo)本兼治,重在治標(biāo),契合CHF早期病機(jī)。

心肌纖維化的主要特征是ECM的過度沉積〔15〕。ColⅠ和ColⅢ是構(gòu)成ECM的主要結(jié)構(gòu)蛋白。ColⅠ約占心肌膠原總量的85%,負(fù)責(zé)建立厚纖維,賦予其抗拉伸強(qiáng)度。ColⅢ占正常心臟膠原蛋白總蛋白的11%,以細(xì)纖維的形式聚集,負(fù)責(zé)基質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的彈性〔10〕。當(dāng)心臟受到病理因素刺激時(shí)會(huì)生成大量的ColⅠ和ColⅢ,形成ECM,ECM過度沉積會(huì)導(dǎo)致心肌間質(zhì)增生,炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肌纖維排列紊亂、斷裂,導(dǎo)致間質(zhì)纖維化,從而引起心臟舒縮功能障礙〔16〕。心臟組織中Hyp含量代表大鼠心臟中膠原總量,反映了心肌纖維化的程度〔17〕。本研究說明,CHF大鼠心臟受到了刺激釋放出大量ColⅠ、ColⅢ,合成ECM,導(dǎo)致心肌中膠原含量過高;消飲化瘀方可以減輕病理因素對(duì)CHF大鼠心臟的刺激,減少ColⅠ、ColⅢ的分泌,使ECM的合成降低,平衡心肌中膠原蛋白的含量,改善CHF大鼠心肌纖維化,但與消飲化瘀方的劑量存在一定的效應(yīng)關(guān)系。

MAPK信號(hào)通路是參與心肌細(xì)胞炎癥、凋亡及間質(zhì)纖維化的匯聚點(diǎn)〔4〕。P38MAPK作為MAPK的主要亞族,參與了心肌纖維化的全過程。P38MAPK可通過影響膠原蛋白的合成及心肌纖維化細(xì)胞的分化調(diào)控心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展〔18〕。相關(guān)研究表明,使用P38抑制劑(SB203580)可明顯改善缺血再灌注導(dǎo)致的心肌損傷〔19〕,減少心肌梗死大鼠的心肌膠原含量〔20〕。羅麗芳等〔21〕研究發(fā)現(xiàn),桃葉珊瑚苷可通過抑制P38MAPK通路來調(diào)控心肌成纖維細(xì)胞的增殖和ECM的生成。肖海等〔22〕研究發(fā)現(xiàn),氧化苦參堿可通過抑制P38MAPK磷酸化,從而抑制TGF-β1誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖的作用及相關(guān)膠原蛋白的表達(dá),改善心肌纖維化。因此P38MAPK可作為治療CHF心肌纖維化的靶點(diǎn)之一。本研究結(jié)果說明,消飲化瘀方可以通過抑制P38MAPK的表達(dá),從而影響ColⅠ、ColⅢ及HYP的合成,改善CHF大鼠心肌纖維化。

同時(shí),本實(shí)驗(yàn)選用腹腔注射阿霉素為造模方法,后期易導(dǎo)致CHF大鼠出現(xiàn)不同程度的心包積液或胸腔積液,符合本次研究“水飲致病”的特點(diǎn)。其次CHF大鼠心臟泵血功能障礙導(dǎo)致體循環(huán)或肺循環(huán)瘀血,符合本次研究“瘀血致病”的特點(diǎn)。但缺點(diǎn)是未對(duì)“飲瘀致病”做一個(gè)量化標(biāo)準(zhǔn),將在后續(xù)的研究中進(jìn)行完善。

綜上,消飲化瘀方對(duì)CHF大鼠防治作用機(jī)制可能與抑制P38MAPK的表達(dá),減少心肌膠原蛋白的合成,改善心肌纖維化有關(guān)。