氯沙坦通過IRE1-TRAF2-ASK1-JNK信號(hào)通路調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移

于文會(huì) 張巖 臧亞茹 段書眾

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1藥學(xué)部,河北 承德 067000;2腎臟內(nèi)科)

心血管疾病是糖尿病患者死亡和發(fā)病的主要原因,尤其是動(dòng)脈粥樣硬化,因糖尿病患者的血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)受損而引發(fā)〔1〕。高血糖可促進(jìn)VSMCs增殖和遷移并抑制其凋亡,導(dǎo)致VSMCs在血管內(nèi)膜中積累,引起動(dòng)脈粥樣硬化斑塊在血管內(nèi)壁的沉積,并誘導(dǎo)內(nèi)膜增厚、血管重塑〔2〕。因此防止高糖誘導(dǎo)的VSMCs遷移、增殖并提高凋亡,可能是糖尿病性血管病有希望的治療方案。氯沙坦(LT)是一種血管緊張素受體阻滯劑,除了降低血壓外,它還具有多種公認(rèn)的治療效果如抗炎、抗纖維化等〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)LT可以抑制VSMCs中血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖〔4〕,但能否改善VSMCs受損尚不可知。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路參與調(diào)控VSMCs表型轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)分化、凋亡,從而參與動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、動(dòng)脈瘤及血管鈣化形成〔5〕,因此內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制被認(rèn)為是治療血管性疾病的靶點(diǎn),而肌醇需求酶(IRE)1-腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TRAF)2-凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ASK)1-c-Jun N末端激酶(JNK)信號(hào)通路是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)揮作用的主要信號(hào)通路〔6〕。本研究旨在探討LT能否通過IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)的VSMCs增殖、凋亡和遷移。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物來源 廣州中醫(yī)藥大學(xué)提供雄性、清潔級(jí)Sprague-Dawley大鼠,5周齡,體質(zhì)量118～125 g,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(粵)2019-0047。所有程序按照醫(yī)院動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)制定的指南進(jìn)行,且該指南符合ARRIVE動(dòng)物研究指南。

1.2主要材料、儀器 LT(武漢浩榮生物科技有限公司);細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK)-8(北京索萊寶科技有限公司);Transwell小室(Corning公司);IRE1α激動(dòng)劑-毒胡蘿卜素(TG,Santa Cruz公司);膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(AnnexinV-FITC/PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(欣博盛生物科技有限公司);Abcam公司提供IRE1、TRAF2、磷酸化(p)-ASK1、ASK1、p-JNK、JNK一抗。FACS Calibur流式細(xì)胞儀(BD公司);熒光顯微鏡(Olympus公司);BIO-RAD 680型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)伯樂公司)。

1.3細(xì)胞分離及鑒定 首先將戊巴比妥鈉麻醉大鼠,然后脫頸處死大鼠,分離出整個(gè)胸主動(dòng)脈,之后縱向切開胸主動(dòng)脈,用無菌彎頭鑷子去除內(nèi)皮細(xì)胞,小心剝離血管外膜,將主動(dòng)脈組織切成1 mm3小塊,加入膠原酶在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中消化主動(dòng)脈組織,之后細(xì)胞利用胰蛋白酶消化并進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng),并通過α-平滑肌動(dòng)蛋白(SMA)抗體免疫熒光鑒定VSMCs,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4細(xì)胞分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期VSMCs,并分組為:空白組、高糖組,同時(shí)在高糖組的基礎(chǔ)上設(shè)置高糖+LT組、高糖+TG組、高糖+LT+TG組。其中空白組未經(jīng)任何處理;高糖組采用25 mmol/L葡萄糖處理〔7〕;高糖+TG組采用25 mmol/L葡萄糖處理前0.5 h先加入0.2 nmol/L IRE1α激動(dòng)劑-TG處理〔8〕;高糖+LT組采用25 mmol/L葡萄糖處理前0.5 h先加入10 μmol/L LT處理〔9〕;高糖+LT+TG組采用25 mmol/L葡萄糖處理前0.5 h先加入10 μmol/L LT、0.2 nmol/L TG處理。

1.5CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 以5×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種VSMCs并在96孔板中培養(yǎng),分別孵育48 h以刺激細(xì)胞增殖。隨后加入10 μl CCK-8試劑,將細(xì)胞在37 ℃下進(jìn)一步孵育2 h,測(cè)量每組樣品在450 nm波長(zhǎng)處的光密度(OD)值評(píng)估細(xì)胞增殖。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將各組細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后離心,洗滌細(xì)胞兩次,然后重新懸浮在500 μl結(jié)合緩沖液中,在室溫下于黑暗中加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC和5 μl PI溶液,染色15 min,通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。

1.7劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移率 VSMCs(1.5×105/孔)接種在6孔板中,然后使用200 μl無菌移液器吸頭進(jìn)行刮擦,磷酸鹽緩沖液(PBS)用于去除損傷的細(xì)胞,該時(shí)間點(diǎn)設(shè)置為0 h。各組VSMCs連續(xù)培養(yǎng)24 h。在0 h和24 h拍攝每個(gè)樣品照片,用ImageJ測(cè)量0、24 h的劃痕寬度評(píng)估VSMCs遷移率;遷移率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.8Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 將預(yù)處理的各組細(xì)胞(1×105/孔)接種到無血清DMEM的上室中,下室補(bǔ)充有20%胎牛血清(FBS)的DMEM。孵育12 h后,遷移到下室的VSMCs用4%甲醛固定20 min,結(jié)晶紫染色。然后隨機(jī)選取5個(gè)視野,在200倍光鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.9Western印跡檢測(cè)IRE1-TRAF2-ASK1-JNK相關(guān)蛋白表達(dá)水平 收集所有細(xì)胞,用緩沖液于冰上裂解,然后測(cè)定總蛋白濃度,用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)從每個(gè)樣品中分離10 μg總蛋白,之后轉(zhuǎn)膜、封閉,將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上并與IRE1、TRAF2、p-ASK1、ASK1、p-JNK、JNK、β-actin一抗孵育過夜。然后使用二抗孵育并使其可視化,ImageJ軟件分析蛋白表達(dá)水平。

1.10統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行方差分析,兩兩比較行SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1VSMCs鑒定 通過VSMCs特異性標(biāo)志物-α-SMA染色進(jìn)行鑒定,胞質(zhì)內(nèi)可見大量熒光,α-SMA抗體呈陽性,見圖1。

圖1 VSMCs鑒定(×200)

2.2LT對(duì)各組VSMCs增殖的影響 各組VSMCs增殖率比較:高糖組較空白組、高糖+TG組較高糖組、高糖+LT+TG組較高糖+LT組均明顯升高(P<0.05);高糖+LT組較高糖組、高糖+LT+TG組較高糖+TG組均明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞增殖、凋亡率、遷移率、遷移、IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路蛋白表達(dá)的影響

2.3LT對(duì)各組細(xì)胞凋亡的影響 各組細(xì)胞凋亡率比較:高糖+LT+TG組較高糖+LT組明顯降低(P<0.05);高糖+LT組較高糖組、高糖+LT+TG組較高糖+TG組均明顯升高(P<0.05)。見表1、圖2。

圖2 各組細(xì)胞凋亡變化

2.4LT對(duì)各組細(xì)胞遷移率的影響 各組細(xì)胞遷移率比較:高糖組較空白組、高糖+TG組較高糖組、高糖+LT+TG組較高糖+LT組均明顯升高(P<0.05);高糖+LT組較高糖組、高糖+LT+TG組較高糖+TG組均明顯降低(P<0.05)。見表1、圖3。

圖3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移(×100)

2.5LT對(duì)各組細(xì)胞遷移數(shù)目的影響 各組細(xì)胞遷移數(shù)比較:高糖組較空白組、高糖+TG組較高糖組、高糖+LT+TG組較高糖+LT組均明顯增加(P<0.05);高糖+LT組較高糖組、高糖+LT+TG組較高糖+TG組均明顯減少(P<0.05)。見表1、圖4。

圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移數(shù)(結(jié)晶紫染色,×200)

2.6LT對(duì)各組細(xì)胞IRE1-TRAF2-ASK1-JNK相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 各組細(xì)胞中IRE1、TRAF2、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK比較:高糖組較空白組、高糖+TG組較高糖組、高糖+LT+TG組較高糖+LT組均明顯增加(P<0.05);高糖+LT組較高糖組、高糖+LT+TG組較高糖+TG組均明顯減少(P<0.05)。見表1、圖5。

1～6:空白組、高糖組、高糖+LT組、高糖+TG組、高糖+LT+TG組

3 討 論

糖尿病性血管病尤其是動(dòng)脈粥樣硬化是糖尿病患者殘疾、死亡的主要原因〔10〕。雖然糖尿病性血管病的發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚,但大多危險(xiǎn)因素集中在血管壁上,特別是VSMCs。VSMCs功能障礙可促進(jìn)斑塊體積的增長(zhǎng),加速細(xì)胞外基質(zhì)的沉積,最終導(dǎo)致內(nèi)瘺血管壁增厚、狹窄〔11〕,故靶向VSMCs可能是治療糖尿病性血管病的新方向。

LT又稱為血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑,價(jià)格低廉,且適用于維持性血液透析患者。在2型糖尿病腎病研究中,LT可以促進(jìn)患者血管內(nèi)皮功能恢復(fù),治療效果較佳,安全性較高〔12〕。隨著糖尿病、高血壓等此類代謝疾病發(fā)病率升高,心血管并發(fā)癥逐漸增多,而血管內(nèi)膜增生機(jī)制參與血管介入治療后再狹窄、冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)以及動(dòng)脈粥樣硬化等心血管并發(fā)癥的病理過程〔13,14〕。因此血管內(nèi)膜增生機(jī)制是血管外科醫(yī)生關(guān)注的問題。據(jù)報(bào)道血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑可有效減少冠狀動(dòng)脈支架置入后繼發(fā)的內(nèi)膜增生〔15〕。應(yīng)用血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑可通過調(diào)控血管平滑肌前體樣細(xì)胞抑制動(dòng)脈損傷患者內(nèi)膜增生〔16〕。但是對(duì)于LT是否能通過抑制VSMCs增殖、遷移,促進(jìn)其凋亡,改善VSMCs受損進(jìn)而抑制血管內(nèi)膜增生,達(dá)到治療糖尿病性血管病目的尚不可知。本研究結(jié)果推測(cè),LT在一定程度上可以抑制VSMCs過度增殖和氧化應(yīng)激損傷,可作為糖尿病性血管病治療的潛在藥物,但其具體機(jī)制尚缺乏研究。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是一種基本的細(xì)胞反應(yīng),會(huì)產(chǎn)生非折疊蛋白反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可導(dǎo)致VSMCs增殖,促進(jìn)血管內(nèi)膜增生、血管重構(gòu),減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以抑制血管內(nèi)膜增生〔17〕。IRE1屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的效應(yīng)蛋白,IRE1α是其中一種亞型,在各個(gè)細(xì)胞中廣泛存在,一旦受到刺激,IRE1α便會(huì)解離進(jìn)而募集TRAF2,之后共同激活A(yù)SK1,形成三聚體,促使JNK的磷酸化,參與細(xì)胞生命活動(dòng)〔18〕。Xue等〔19〕研究發(fā)現(xiàn),激活素A可通過抑制IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路活化來保護(hù)PC12細(xì)胞免受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡和自噬性細(xì)胞死亡。Kim等〔20〕研究證明,LT可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,抑制單側(cè)輸尿管梗阻誘導(dǎo)的腎纖維化,保護(hù)腎臟。本研究結(jié)果提示,IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路的活化可能與高糖誘導(dǎo)的VSMCs損傷有關(guān)。LT可能通過抑制IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路,降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,抑制VSMCs受損。表明LT可抑制VSMCs增殖、遷移,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,與抑制IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路有關(guān)。

綜上,LT可能通過抑制IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路的激活,調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)的VSMCs增殖、遷移和凋亡,可作為糖尿病性血管病治療的潛在藥物。