基于PPARγ/LXRα/ABCA1信號(hào)通路探討芪黃疽愈方對(duì)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響及其作用機(jī)制

張欣 葛建立 蘇坤 張敏妹 張靜 何建明 馬云龍 孫云朝 楚信強(qiáng)

(1河北省中醫(yī)院,河北 石家莊 050001;2石家莊市中醫(yī)院;3北京東直門醫(yī)院)

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)作為心、腦血管及周圍血管疾病的關(guān)鍵病理基礎(chǔ),是近年來中老年患者致死、致殘的主要疾病之一。AS以動(dòng)脈壁脂質(zhì)沉積、細(xì)胞死亡和斑塊纖維化為特征,而脂質(zhì)代謝紊亂是AS發(fā)生、發(fā)展的重要因素。膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)〔1〕是將體內(nèi)異常代謝的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟代謝轉(zhuǎn)化成膽汁,并通過腸道排出體外的過程。由此可見,肝臟在膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)中起重要意義,加強(qiáng)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)并提高肝臟對(duì)脂質(zhì)的正常代謝能夠改善AS的進(jìn)展。筆者通過前期的臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)芪黃疽愈方能夠改善下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥患者臨床癥狀〔2,3〕,且能夠調(diào)節(jié)動(dòng)脈硬化閉塞癥(ASO)大鼠脂質(zhì)代謝紊亂,降低血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)水平,升高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平,且有效促進(jìn)SR-BⅠ蛋白表達(dá)〔4～6〕,但脂質(zhì)在肝臟中的代謝機(jī)制尚不明確,推測(cè)其可能與肝臟內(nèi)膽固醇代謝相關(guān)。本研究以高脂飲食喂飼的ApoE-/-小鼠及同品系同周齡C57BL/6小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,探討芪黃疽愈方是否能夠影響動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成,通過過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)γ-肝X受體(LXR)α-三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體(ABC)A1通路促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn),改善肝臟脂質(zhì)代謝紊亂,從而達(dá)到抑制AS進(jìn)展的目的。

1 材料與方法

1.1材料 7周齡SPF級(jí)雄性 ApoE-/-小鼠68只〔動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2019-0009〕和25只同品系、同周齡雄性C57BL/6小鼠〔動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京) 2016-0006〕,體質(zhì)量18～20 g,均購自北京維通利華有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房不銹鋼籠喂飼,每籠5只,動(dòng)物房溫度(24±1)℃,相對(duì)濕度50%～70%,明暗周期12/12 h,每周換水3次,換墊料2次。實(shí)驗(yàn)操作流程嚴(yán)格遵循河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的相關(guān)法規(guī)和各項(xiàng)規(guī)定,并通過河北省中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理審查。

1.2藥物與試劑 中藥:芪黃疽愈方神威配方顆粒劑由紅花、雞血藤、海藻、浙貝母、鬼箭羽、土鱉蟲、延胡索、黃芪、黃精、牛膝組成,由神威藥業(yè)生產(chǎn),河北省中醫(yī)院中藥房機(jī)器調(diào)配;阿托伐他汀鈣片(立普妥),由輝瑞藥業(yè)有限公司生產(chǎn),國藥準(zhǔn)字 H20051408,產(chǎn)品批號(hào):CG7011。

1.3試劑與儀器 蘇木素染色液、分化液、返藍(lán)液、伊紅染液(河北博海生物工程開發(fā)有限公司);中性樹膠(中杉金橋);二甲苯、無水乙醇、95%乙醇(天津市永大化學(xué)試劑有限公司);石蠟(上海華靈康復(fù)器械廠);油紅O染色液(武漢塞維爾生物科技有限公司);異丙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);OCT冰凍切片包埋劑(櫻花,貨號(hào)4583);PPARγ一抗(武漢三鷹公司,貨號(hào)16643-1-AP);LXRα一抗(武漢三鷹公司,貨號(hào)14351-1-AP);ABCA1一抗(武漢博士德,貨號(hào)BA1541-2);Trizol(ambion,貨號(hào)175805);氯仿(天津市科密歐,貨號(hào)20161107);異丙醇(天津市永大,貨號(hào)20160108);無水乙醇(天津市永大,貨號(hào)20180606);DEP水(北京索萊寶,貨號(hào)E174);HiFiScript gDNARemoval cDNA Syntheris Kit(康維世紀(jì),貨號(hào)60530)ChemoHS qPCR Mix(None ROX,莫納生物,貨號(hào)140449)。

1.4儀器 生物安全柜(廣州瑞智凈化設(shè)備有限公司,SW.TFG-15);光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS,BX43);石蠟切片機(jī)(德國萊卡,RM2016);電腦生物組織攤烤片機(jī)(浙江省科迪,KD-T);電熱恒溫水浴鍋(天津泰斯特,DK-98-11);照相機(jī)(佳能,D70);低溫高速離心機(jī)(Eppendorf公司,centrifuge5417R型);超純水儀(北京康銘泰克科技發(fā)展有限公司);蛋白濃度定量?jī)x(Eppendorf公司,22331 hamburg型);電泳儀(北京六一公司,DYCZ-24DN型);半干轉(zhuǎn)膜儀系統(tǒng)(ATTO公司,WSE-4040型);轉(zhuǎn)移脫色搖床(海門其林貝爾儀器制造有限公司,TS-8型);移液器(Eppendorf公司,10 μl/20 μl/200 μl/1 000 μl);CFX Manager實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)儀96孔(美國Bio-Rad公司);PCR八連管美國Axygen公司(批號(hào):KBSW1);微量核酸分光光度計(jì)ND-1000 美國Thermo Scientific公司;分析儀器(Tanon 公司,Tanon1600型)。

1.5動(dòng)物分組與造模 動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后,ApoE-/-小鼠更換為高脂飼料,C57BL/6J小鼠繼續(xù)普通對(duì)照飼料喂養(yǎng),自由采食攝水,1 w后分組給藥。68只ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為模型組24只,中藥組22只,對(duì)照組22只。25只C57BL/6小鼠作為空白對(duì)照組。

1.6給藥方法 空白組:給予0.9%氯化鈉溶液(0.2 ml/20 g小鼠)灌胃,1次/d,連續(xù)12 w,自由飲水。模型組:給予0.9%氯化鈉溶液(0.2 ml/20 g小鼠)灌胃,1次/d,連續(xù)12 w,自由飲水。中藥組:芪黃疽愈方顆粒與生理鹽水配比為質(zhì)量濃度0.54 g/ml的水溶液,置于4 ℃冰箱冷藏備用,給予中藥液(0.2 ml/20 g小鼠)灌胃,1次/d,連續(xù)12 w,自由飲水。對(duì)照組:阿托伐他汀鈣片26 mg研磨成細(xì)末,以100 ml生理鹽水調(diào)成配比為質(zhì)量濃度0.26 mg/ml的懸混液,每次搖晃混合均勻后予小鼠(0.2 ml/20 g小鼠)灌胃,1次/d,連續(xù)12 w,自由飲水。于12 w時(shí),隨機(jī)從空白組、模型組各取小鼠3只,麻醉處死后,取腹主動(dòng)脈行蘇木素-伊紅(HE)切片后可見空白組腹主動(dòng)脈管壁未見斑塊,模型組腹主動(dòng)脈管腔多發(fā)斑塊,證實(shí)造模成功。

1.7標(biāo)本采集及處理方法 實(shí)驗(yàn)過程中,因灌胃操作模型組死亡2只,中藥組死亡2只,實(shí)驗(yàn)結(jié)束前,空白組、對(duì)照組隨機(jī)各2只用于實(shí)驗(yàn)預(yù)操作。12 w后,4%水合氯醛溶液(0.2 ml/20 g)腹腔麻醉處死小鼠,取小鼠自主動(dòng)脈弓至髂動(dòng)脈分叉處主動(dòng)脈,一部分置于凍存管中,于-80 ℃冰箱凍存,一部分置于10%甲醛保存,以備檢測(cè)。取出肝臟組織,肝左葉-20 ℃保存,制備冰凍切片,行油紅O染色;肝右葉4%多聚甲醛溶液固定,制備石蠟切片,進(jìn)行HE染色;剩余部分組織置于凍存管中,-80 ℃保存,待行Western印跡、PCR檢測(cè)。

1.8檢測(cè)指標(biāo) (1)一般狀態(tài):觀察大鼠一般狀態(tài),包括精神狀態(tài)、毛色、活動(dòng)靈敏度、飲食、飲水及體質(zhì)量。(2)HE染色、油紅O染色觀察小鼠主動(dòng)脈病理變化:(1)HE染色。包埋、切片:小鼠主動(dòng)脈組織經(jīng)固定后,切取約15 mm長的管腔,放入包埋盒,依次脫水、浸蠟,包埋,制成石蠟塊,使用切片機(jī)切5 μm厚石蠟切片;入二甲苯脫蠟,蘇木素染色,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片;通過光學(xué)顯微鏡觀察,選取目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行拍照。(2)油紅O染色。將小鼠主動(dòng)脈血管周圍脂肪組織用鑷子盡可能去除后,置于固定液固定24 h,后將組織從固定液中取出,PBS浸洗2次。再次摘除血管外周脂肪并用解剖剪沿著血管壁小心將血管縱向剖開。將剪好的血管用自來水稍洗5 s,血管先浸入60%異丙醇3 s再浸入油紅O染色液中37 ℃染色60 min后取出,用鑷子取出血管浸入60%異丙醇分化,分化至管腔內(nèi)脂肪斑塊呈橘紅色或鮮紅色,其他部位近無色,后用蒸餾水洗終止分化。將血管取出,濾紙吸去多余水分平鋪放在刻度尺上,選擇光線良好處,調(diào)整焦距曝光度,拍照。并應(yīng)用Image-Pro Plus進(jìn)行圖像處理。(3)HE染色、油紅O染色觀察肝臟組織病理學(xué)形態(tài)變化:①HE染色。將小鼠主動(dòng)脈、肝臟組織分別從4%多聚甲醛固定液中取出脫水,用石蠟包埋之后在組織切片機(jī)上作5 μm連續(xù)切片,然后常規(guī)HE染色,樹膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠主動(dòng)脈、肝臟組織病理學(xué)變化情況并拍照。②油紅O染色。切片機(jī)預(yù)冷,OTC 固定液固定肝組織小塊15 min,切片厚度 10～15 μm,進(jìn)行常規(guī)油紅O染色,水溶性樹膠封片,顯微鏡下觀察肝臟脂滴分布情況并采圖。(4)Western印跡檢測(cè)PPARγ、LXRα、ABCA1蛋白表達(dá):①將待測(cè)樣品分別稱重,剪碎后于液氮中研磨至細(xì)粉末狀,分裝于離心管中,加入RIPA裂解液,充分混勻,4 ℃冰箱過夜裂解。4 ℃下,12 000 r/min離心10 min,取上清備用,測(cè)定蛋白濃度。制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)膠板,根據(jù)蛋白定量結(jié)果,加入相應(yīng)體積的總蛋白樣品與4倍蛋白質(zhì)上樣緩沖液,輕輕混合,95 ℃變性10 min后室溫平衡。恒壓電泳,將凝膠上分離到的蛋白條帶通過半干轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)膜方法(轉(zhuǎn)膜時(shí)間PPARγ:38 min;LXRα:34 min;ABCA1:130 min)轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜固相支持物上,采用封閉2 h后依次與一抗(PPARγ為1∶800;LXRα為1∶800;ABCA1為1∶500)孵育過夜,洗滌后放入二抗(山羊抗兔) 孵育 90 min,曝光顯色后掃描處理,所得條帶吸光度值分別與對(duì)應(yīng)內(nèi)參計(jì)算比值獲得相對(duì)吸光度值,用Tanon Gis軟件測(cè)定條帶灰度值。(5)RT-PCR 檢測(cè)PPARγ、LXRα、ABCA1mRNA表達(dá):設(shè)計(jì)引物序列(5′-3′):PPARγ上游:GTTGATTTCTCCAGCATTTC,產(chǎn)物長度:119 bp,下游:TTGATCGCACTTTGGTATT;LXRα上游:GCCTCAATGCCTGATGTTTCTC,產(chǎn)物長度158 bp,下游:GCTGACTCCAACCCTATCCCTAA;ABCA1上游:CCCCTTGAACCTCACTAAAC,下游CCACATAATTGCACATATCCC,產(chǎn)物長度233 bp。取肝臟組織50 mg研磨成粉狀,根據(jù)PCR試劑盒說明書操作提取肝臟總RNA,DEPC水稀釋后,微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定 RNA 的濃度及純度。用RT KIT試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,用RT-PCR儀擴(kuò)增PCR(反應(yīng)體系總體積為:20 μl反應(yīng)體系加入ChemoHS qPCR Mix 10 μl,上游引物(10 μmol/L)、下游引物〔(10 μmol/L)各0.4 μl,cDNA 100 ng,RNase-Free ddH2O 20 μl〕,以GAPDH /β-actin作為內(nèi)參基因,2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1小鼠一般狀態(tài) 空白組皮毛水潤光澤,精神狀態(tài)良好,活躍,飲食飲水正常;模型組精神萎靡,皮毛晦暗,倦怠懶動(dòng),飲食差,飲水正常;與模型組相比,中藥組及對(duì)照組給藥后各癥狀均有不同程度改善。

2.2各組主動(dòng)脈HE、油紅O染色結(jié)果 空白組主動(dòng)脈切片未見AS斑塊,主動(dòng)脈大體標(biāo)本未見明顯紅染脂質(zhì);與空白組相比,模型組主動(dòng)脈切片可見斑塊,大體標(biāo)本可見明顯紅染脂質(zhì);與模型組相比,中藥組及對(duì)照組動(dòng)脈切片中AS斑塊面積較小,大體標(biāo)本中紅染脂質(zhì)面積較小,見圖1。

圖1 各組主動(dòng)脈

2.3各組肝臟HE、油紅O染色結(jié)果 小鼠肝臟切片可見空白組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常,細(xì)胞核位于細(xì)胞中央,細(xì)胞沿中央靜脈為中心向四周放射排列,未見脂肪變性;油紅O未見紅染脂質(zhì);與空白組比較,模型組肝細(xì)胞排列紊亂,胞內(nèi)可見形態(tài)不同、大小不等、數(shù)量不一的脂滴空泡,油紅O切片可見大量紅染脂質(zhì)。與模型組比較,對(duì)照組、中藥組肝臟病變程度減輕,肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)大部分清晰可見,脂滴數(shù)量減少,油紅O紅染脂質(zhì)明顯減少,其中空白組肝臟油紅O陽性細(xì)胞面積為(39.72±15.52)μm2,模型組為(2 624.32±96.28)μm2,中藥組為(287.92±45.57)μm2,對(duì)照組為(1 343.32±133.20)μm2,見圖2。

圖2 各組肝臟組織病理(×100)

2.4Western印跡檢測(cè)肝臟PPARγ、LXRα、ABCA1蛋白表達(dá) 與空白組相比,模型組PPARγ、LXRα、ABCA1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05);與模型組相比,中藥組以上指標(biāo)顯著升高(P<0.05),見圖3、表1。

表1 各組肝臟PPARγ、LXRα、ABCA1蛋白和mRNA表達(dá)

圖3 各組肝臟PPARγ、LXRα、ABCA1蛋白表達(dá)

2.5PCR檢測(cè)肝臟PPARγ、LXRα、ABCA1 mRNA表達(dá) 與空白組相比,模型組PPARγ、LXRα、ABCA1 mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05);與模型組相比,中藥組以上指標(biāo)顯著升高(P<0.05),見表1、圖4。

圖4 PCR檢測(cè)肝臟PPARγ、LXRα、ABCA1 mRNA表達(dá)

3 討 論

AS 主要是巨噬細(xì)胞和動(dòng)脈壁平滑肌細(xì)胞過多的膽固醇累積導(dǎo)致細(xì)胞泡沫化,促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)過量膽固醇流出是預(yù)防和治療AS的有效策略〔7,8〕。RCT既可以減少脂質(zhì)在體內(nèi)的堆積、維持膽固醇的體內(nèi)平衡,還能夠抑制動(dòng)脈管壁的脂質(zhì)沉積,改善血管壁重構(gòu)〔9〕,而肝臟作為人體最重要的脂質(zhì)代謝器官,在RCT過程中起重要作用,因此通過調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝及RCT,改善AS脂質(zhì)沉積具有重要臨床意義。

PPARγ為PPAR家族一員,主要分布于肝臟和脂肪組織中,且可通過各種途徑介導(dǎo)膽固醇的流出,對(duì)膽固醇代謝發(fā)揮重要作用〔10,11〕。LXR作為體內(nèi)脂質(zhì)平衡穩(wěn)定的主要調(diào)節(jié)器,是PPARγ的直接靶基因〔12〕,能夠通過控制 ABCA1、ABCG1 和 CETP 調(diào)節(jié)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn),使得膽固醇能夠從外周進(jìn)入肝臟,并在肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)化為膽汁酸最終排出體外〔13〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,芪黃疽愈方調(diào)節(jié)PPARγ/LXRα/ABCA1信號(hào)通路,可能與改善肝臟脂質(zhì)代謝、促進(jìn)RCT有關(guān)。

中醫(yī)中“膏粱”“脂膏”的闡述及其特性與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的血脂具有極高一致性。若膏脂在體內(nèi)的輸布運(yùn)化紊亂,則久之成濁,病從中生〔14〕。AS患者其病因多為痰中有瘀,瘀中有痰,痰瘀互結(jié),留于經(jīng)絡(luò),日久成為癥積,阻礙氣機(jī)運(yùn)行而發(fā)病,因此“癥積阻絡(luò)”為其核心病機(jī)。芪黃疽愈方以“消癥通絡(luò)”〔15〕為治療大法,化癥積,通經(jīng)絡(luò),諸癥悉除。

綜上,芪黃疽愈方能夠改善小鼠動(dòng)脈硬化及肝臟的脂質(zhì)沉積程度,其作用機(jī)制可能是通過PPARγ/LXRα/ABCA1信號(hào)通路,調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝,促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn),延緩動(dòng)脈硬化進(jìn)展。