薯蕷皂苷對(duì)放射性腸黏膜炎癥損傷小鼠的保護(hù)作用

孔凡國(guó) 彭濤 刁興元 許昌芹

(1濟(jì)南市人民醫(yī)院消化內(nèi)科,山東 濟(jì)南 271100;2山東省立醫(yī)院消化內(nèi)科)

在2011年,癌癥是經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)國(guó)家的主要死因,也是發(fā)展中國(guó)家的第二大死因〔1〕。放療是各種惡性腫瘤和嚴(yán)重疾病的重要治療方式,尤其是鱗狀細(xì)胞癌〔2〕。技術(shù)創(chuàng)新使局部輻射幾乎可以傳遞到身體的任何部位〔3〕。但是,正常組織毒性仍然是臨床放射治療中最重要的劑量限制因素,且輻射對(duì)哺乳動(dòng)物的生物學(xué)效應(yīng)是劑量依賴(lài)性和累積性的〔4〕,這些不利的副作用,例如放射誘導(dǎo)的造血和胃腸道功能障礙甚至死亡,降低了患者的生活質(zhì)量并限制了他們的放射治療〔5〕。薯蕷皂苷是一種類(lèi)固醇皂甙,是六味地黃湯和地心血康等中成藥的有效成分〔6,7〕。《神農(nóng)本草經(jīng)》記載:“薯蕷香甜,平平,具有減少內(nèi)臟損傷,增強(qiáng)供血不足的特點(diǎn)”,還可以祛邪除熱,補(bǔ)氣養(yǎng)血,促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)。此外,薯蕷皂苷可以增加聽(tīng)覺(jué)和視覺(jué)的敏感性,并延長(zhǎng)預(yù)期壽命〔8〕。近年來(lái)的一些研究表明,薯蕷皂苷可以通過(guò)調(diào)節(jié)多個(gè)靶點(diǎn)和信號(hào)通路來(lái)保護(hù)肝臟,腎臟,大腦和胃腸道損傷,并調(diào)節(jié)包括糖尿病,骨質(zhì)疏松,肥胖和高尿酸血癥在內(nèi)的代謝疾病。此外,薯蕷皂苷對(duì)炎癥和細(xì)胞凋亡具有有效的作用〔9,10〕。然而,薯蕷皂苷在放射誘導(dǎo)的腸黏膜損傷中發(fā)揮何作用尚不清楚。本研究旨在探究薯蕷皂苷對(duì)放射性腸黏膜炎癥損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性BALB/c小鼠(7～8周齡)獲自新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。將小鼠飼養(yǎng)在特定的無(wú)病原體,溫度(23±1)℃,相對(duì)濕度(55±5)%,并進(jìn)行12 h的明暗循環(huán)(從06∶00到18∶00點(diǎn)亮)的房間的籠子中,4只/籠。所有實(shí)驗(yàn)遵照新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2輻射暴露和實(shí)驗(yàn)方案 小鼠以1.2 Gy/min的吸收劑量率接受一次7.5 Gy的全身X射線照射(RS2000輻照器;Rad Source Technologies,Inc.,Suwanee,GA,美國(guó)),并不斷循環(huán)新鮮空氣避免在輻射室中產(chǎn)生缺氧狀況。將小鼠保存在帶孔的塑料瓶中以進(jìn)行單獨(dú)照射。

小鼠隨機(jī)分為4組,每組10只,即正常對(duì)照(Con,不進(jìn)行放射)組,X射線照射造模(RT)組,RT+150 mg/kg薯蕷皂苷和RT+300 mg/kg薯蕷皂苷組〔均進(jìn)行腹部照射,且第0天均灌胃一次相應(yīng)劑量薯蕷皂苷(Sigma Aldrich,USA,純度≥93%)。Con組及RT組以相同方式灌胃生理鹽水。通過(guò)直接心室穿刺獲得血液樣本,并在腹部照射后第3天收集小腸,實(shí)驗(yàn)獨(dú)立進(jìn)行了3次。并連續(xù)稱(chēng)量小鼠照射后16 d的體質(zhì)量和食物攝入量。

1.3組織病理學(xué) 輻射后72 h,收集腸道組織,將組織固定在0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)中的4%多聚甲醛中,包埋在石蠟中,切成4 μm厚的切片,進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色。使用Chiu等〔11〕定義的組織學(xué)損傷量表,以盲法評(píng)估和分級(jí)黏膜損傷,炎癥和充血/出血。黏膜損傷根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)從0～5分級(jí):0級(jí),正常黏膜絨毛;1級(jí),絨毛頂端的上皮下出現(xiàn)格魯恩哈根間隙,常伴有毛細(xì)血管充血;2級(jí),上皮下間隙的擴(kuò)張,并從固有層適度抬升上皮層;3級(jí),大量的上皮向下舉起絨毛的側(cè)面,可能有一些裸露的尖端;4級(jí),裸露的絨毛,帶有固有層和擴(kuò)張的毛細(xì)血管,可能是固有層的細(xì)胞增多;5級(jí),固有層的消化和崩解,出血和潰瘍。各個(gè)變化的得分總和構(gòu)成輻射損傷得分(RIS)。

1.4TUNEL分析 輻射后72 h,收集腸道組織,使用TUNEL測(cè)定法評(píng)估凋亡程度。使用凋亡檢測(cè)試劑盒(TdT-Fragel TM DNA片段檢測(cè)試劑盒,QIA33,Calbiochem,美國(guó))檢測(cè)DNA片段化。下面列出的所有試劑來(lái)自試劑盒,并按照制造商的說(shuō)明進(jìn)行制備。將5 μm厚的腸段在二甲苯中脫蠟并通過(guò)梯度酒精進(jìn)行水合;將它們與20 mg/ml蛋白酶K孵育20 min,并在TBST中沖洗;將切片與平衡緩沖液孵育10～30 min,用TBST沖洗;在37 ℃的濕潤(rùn)環(huán)境中將切片與TdT酶孵育90 min;隨后在室溫下放入預(yù)熱的清洗緩沖液中10 min,并與封閉緩沖液一起孵育30 min。使用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)標(biāo)記,甲基綠進(jìn)行反染,將切片脫水并固定計(jì)數(shù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞,以TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞/100個(gè)腸絨毛細(xì)胞比例作為凋亡指數(shù),盲法在10個(gè)隨機(jī)選擇的區(qū)域中使用NIS Elements BR3.1(日本尼康)軟件分析TUNEL陽(yáng)性信號(hào)。

1.5Western印跡 輻射72 h后,將小鼠處死,收集腸組織。從腸組織提取的蛋白質(zhì)通過(guò)二喹啉甲酸(BCA)分析(Beyotime,中國(guó))進(jìn)行定量。蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后,將蛋白電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,經(jīng)封閉后,室溫分別孵育一抗抗Claudin-1(ab5694),抗ZO-1(ac5784)1.5 h,TBST洗膜3次后,室溫孵育1∶2 000稀釋的二抗〔辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的免疫球蛋白(Ig)G,#7076,Cell Signaling Technology,美國(guó)〕45 min,TBST洗膜3次后,利用增強(qiáng)的電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(#P0018AS,碧云天,上海)對(duì)目的條帶顯影,以β-actin(#AF0003,碧云天,上海)為內(nèi)參,采用AlphaView軟件測(cè)量目的條帶的光密度。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)分析 根據(jù)制造商的說(shuō)明,使用TRIzol試劑(美國(guó),Invitrogen)從腸組織中分離總RNA。使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)物(Promega,美國(guó))。使用ABI 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(美國(guó)Applied Biosystems)進(jìn)行qPCR。引物序列如下:IL-1β:上游引物:5′-GCAACTGTTCCTGAACTCA-3′,下游:5′-CTCGGAG CCTGTAGTGCAG-3′,TNF-α:上游引物:5′-GCCTCTTCTCATTCCTGCTT-3′,下游:5′-CACTTGGTGGTTTGCTACGA-3′,GAPDH:上游引物:5′-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3′,下游:5′-GCTCCTGGAAGATGG-TGATGG-3′。qPCR變性條件下于94 ℃ 2 min,94 ℃ 15 s,62 ℃ 40 s 40個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCt比較法確定每個(gè)靶基因的相對(duì)表達(dá),并針對(duì)GAPDH進(jìn)行歸一化。每個(gè)樣品重復(fù)3次,并在3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中重復(fù)。

1.7抗氧化狀態(tài)的生化分析 將冷凍的腸組織勻漿。將勻漿物過(guò)濾并使用冷凍離心機(jī)在4 ℃下離心,將上清液等分裝在-20 ℃下冷凍,直至用于生化分析。使用Lowry等〔12〕的方法測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)含量。根據(jù)Draper等〔13〕的方法,測(cè)定了丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism6軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1薯蕷皂苷對(duì)放射性腸損傷臨床癥狀的影響 與Con組比較,RT組輻射誘發(fā)的體質(zhì)量和食物攝入量在輻射后2～16 d均顯著下降(P<0.001);4～16 d與RT組比較,RT+150 mg/kg和300 mg/kg薯蕷皂苷組體質(zhì)量和食物攝入量均顯著上升,以RT+300 mg/kg薯蕷皂苷組最為顯著(P<0.05)。見(jiàn)表1、表2。

表1 各組體質(zhì)量變化比較

表2 各組食物攝入量變化比較

2.2薯蕷皂苷對(duì)放射性腸損傷的組織病理學(xué)和腸道細(xì)胞凋亡的影響 放射治療組表現(xiàn)為腸道絨毛縮短,絨毛上皮缺失,多處糜爛,炎性細(xì)胞浸潤(rùn),壞死和腸壁出血;然而經(jīng)150和300 mg/kg薯蕷皂苷處理后,放射誘導(dǎo)的腸黏膜損傷明顯改善。與Con組比較,RT組腸黏膜組織學(xué)評(píng)分明顯增加,而薯蕷皂苷明顯降低了放射誘導(dǎo)的腸黏膜組織學(xué)評(píng)分(P<0.01)。除此之外,還采用TUNEL分析方法檢測(cè)了腸道細(xì)胞的凋亡程度,結(jié)果顯示,與Con組比較,RT組腸道細(xì)胞凋亡率明顯增加,而經(jīng)150和300 mg/kg薯蕷皂苷處理后凋亡率明顯降低,以300 mg/kg薯蕷皂苷處理組最為顯著(P<0.01,P<0.001)。見(jiàn)圖1、表3。

圖1 薯蕷皂苷對(duì)放射性腸損傷的組織病理學(xué)和腸道細(xì)胞凋亡的影響(×40)

表3 薯蕷皂苷對(duì)放射性腸損傷的組織病理學(xué)和腸道細(xì)胞凋亡的影響

2.3薯蕷皂苷對(duì)放射誘導(dǎo)的腸組織中Claudin-1和ZO-1蛋白表達(dá)的影響 與Con組比較,RT組腸組織中Claudin-1和ZO-1蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.001),而經(jīng)150和300 mg/kg薯蕷皂苷處理后,放射誘導(dǎo)的腸組織中Claudin-1和ZO-1蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.01,P<0.001),以300 mg/kg薯蕷皂苷處理組最為顯著。見(jiàn)圖2、表4。

1～4:Con組、RT組、RT+150 mg/kg薯蕷皂苷組、RT+300 mg/kg薯蕷皂苷組

表4 薯蕷皂苷對(duì)放射誘導(dǎo)的腸組織中Claudin-1和ZO-1蛋白表達(dá)、SOD、MDA水平和IL-1β、TNF-α mRNA水平的影響

2.4薯蕷皂苷對(duì)放射誘導(dǎo)的腸組織中SOD、MDA水平和IL-1β、TNF-α mRNA水平的影響 與Con組比較,RT組腸組織中SOD水平顯著降低;而經(jīng)150 mg/kg和300 mg/kg薯蕷皂苷處理后,放射誘導(dǎo)的腸組織中SOD明顯升高,以RT+300 mg/kg薯蕷皂苷組最為顯著(P<0.01,P<0.001);MDA水平變化與SOD相反。RT組腸組織中IL-1β、TNF-α mRNA水平較Con組明顯升高,150 mg/kg和300 mg/kg薯蕷皂苷處理明顯逆轉(zhuǎn)了放射誘導(dǎo)的IL-1β、TNF-α mRNA水平升高(P<0.01,P<0.001)。見(jiàn)表4。

3 討 論

放射療法是治療骨盆腔或腹部癌癥患者的主要方法之一〔14,15〕。腸黏膜炎癥損傷是放射療法治療腹部癌的最常見(jiàn)副作用,小腸對(duì)放射誘發(fā)的損害的敏感性是放射療法處方劑量的限制因素。放射治療引起的腸炎并伴有各種臨床癥狀,降低了患者的生活質(zhì)量,并增加了治療費(fèi)用和社會(huì)醫(yī)療費(fèi)用〔16,17〕。目前尚沒(méi)有廣泛使用的方法來(lái)減少輻射誘發(fā)的腸炎的發(fā)生或減輕其嚴(yán)重性。本研究發(fā)現(xiàn),在放療時(shí),給予薯蕷皂苷可顯著減輕放療引起的腸炎的臨床癥狀,包括食物攝入減少和體質(zhì)量減輕。這些作用可以通過(guò)減少細(xì)胞死亡,氧化應(yīng)激和炎癥來(lái)解釋。

輻射消除癌細(xì)胞的機(jī)制涉及體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和癌細(xì)胞DNA結(jié)構(gòu)的破壞,從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡〔18〕。但是,在臨床實(shí)踐中,這種現(xiàn)象不僅發(fā)生在癌細(xì)胞中,而且在受放射線影響的正常組織中也發(fā)生。預(yù)防正常組織中的DNA損傷和隨后的細(xì)胞死亡可以減少輻射的副作用。有研究〔16〕發(fā)現(xiàn),射線照射會(huì)引起腸上皮屏障功能受損,因此在本研究中采用蛋白質(zhì)免疫印跡方法分析了小腸中緊密連接分子Claudin-1和ZO-1蛋白水平,以評(píng)估了腸屏障功能,結(jié)果說(shuō)明薯蕷皂苷能改善輻射誘導(dǎo)的腸上皮屏障受損。

輻射后發(fā)生的炎癥可通過(guò)一系列過(guò)程誘導(dǎo),包括ROS,DNA損傷,脂質(zhì)過(guò)氧化和凋亡。盡管炎癥對(duì)于解決體內(nèi)各種類(lèi)型的損傷是必需的,但是放射后發(fā)生的炎癥會(huì)引起各種臨床癥狀,持續(xù)的炎癥可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的后果,例如癌癥。因此,盡早解決炎癥通常是有益的。

綜上,放療時(shí)薯蕷皂苷治療通過(guò)減少組織損傷,細(xì)胞死亡,氧化應(yīng)激和炎癥降低了輻射誘發(fā)的腸黏膜炎癥損傷。因此,薯蕷皂苷對(duì)輻射引起的腸黏膜炎癥損傷具有輻射防護(hù)作用。