miR-27b對心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞自噬、心肌能量代謝及PPARα信號的作用機(jī)制

陳運(yùn)起 吳鐘偉 趙圣吉 李堪董 王敢 鐘江華

(1海南西部中心醫(yī)院心血管內(nèi)科,海南 儋州 571700;2中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院心血管內(nèi)科)

相關(guān)報(bào)道顯示,心力衰竭患者5年死亡率約高達(dá)50%〔1〕。心肌細(xì)胞能量代謝紊亂在該病中發(fā)揮著重要作用。正常情況下,心臟活動(dòng)所需能量幾乎完全靠有氧代謝提供,葡萄糖和脂肪酸等物質(zhì)是心肌細(xì)胞代謝的重要能量底物,其中60%～80%的心肌能量供應(yīng)來自脂肪代謝。心力衰竭過程中,微循環(huán)障礙導(dǎo)致心肌缺血、缺氧,脂肪酸氧化受損,能量代謝從優(yōu)先利用脂肪酸為主轉(zhuǎn)變?yōu)閮?yōu)先利用葡萄糖的無氧酵解,從而導(dǎo)致三磷酸腺苷(ATP)產(chǎn)生減少,以糖酵解為主的供能模式明顯增加乳酸產(chǎn)生,使脂肪酸利用減少,造成脂質(zhì)在心臟沉積,加重心肌損害,同時(shí)線粒體生物合成減少,ATP生成下降,導(dǎo)致心肌細(xì)胞自噬紊亂,從而增加心肌細(xì)胞凋亡,加之心力衰竭時(shí)線粒體生物合成減少,能量生成進(jìn)一步下降,心功能繼之惡化,因此又加速了心力衰竭進(jìn)程〔2～4〕。磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)具有調(diào)控細(xì)胞能量代謝作用,主要通過調(diào)控其下游因子過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)α促進(jìn)能量產(chǎn)生,維持細(xì)胞能量平衡〔5〕。心肌細(xì)胞中的PPARα呈現(xiàn)高表達(dá),其與多種心血管疾病聯(lián)系密切〔6～7〕。另外研究發(fā)現(xiàn)〔8〕,AMPK/PPARα通路參與心肌代謝過程,并對心力衰竭具有一定保護(hù)作用。目前,關(guān)于心力衰竭如何有效治療已成為心血管疾病研究者的研究重點(diǎn),因此,尋找一種安全有效的治療方法至關(guān)重要。miR-27b是miRNAs家族成員之一,與多種腫瘤及心臟相關(guān)疾病的產(chǎn)生及發(fā)展聯(lián)系密切。研究發(fā)現(xiàn)〔9〕,在心肌炎中,沉默miR-27b表達(dá)后可抑制心肌細(xì)胞凋亡。但目前miR-27b與心力衰竭的相關(guān)研究較少,具體機(jī)制尚不明確,因此本實(shí)驗(yàn)研究miR-27b對心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞自噬、心肌能量代謝及PPARα信號的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級SD健康雄性大鼠40只,體質(zhì)量200～300 g,購于北京維通達(dá)生物技術(shù)有限公司〔許可證號:SYXK(京)2019-0428〕,于醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)飼養(yǎng)1 w。本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(批號:Y2019-009-14)。

1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 miR-27b拮抗劑及陰性對照(上海吉瑪制藥技術(shù)公司),蘇木素-伊紅(HE)和Masson染色液(南昌雨露實(shí)驗(yàn)器材有限公司),miR-27b、AMPK、PPARα引物合成(北京雷根生物技術(shù)公司),TUNEL工作液(北京嘉美諾斯生物科技公司),微管相關(guān)輕鏈蛋白(LC)3Ⅱ、LC3Ⅰ、自噬相關(guān)蛋白(Beclin)-1、組織蛋白酶(Cath)D一抗(上海信裕生物工程有限公司),羊抗兔二抗(北京百奧萊博科技公司)。

1.3分組、模型建立及干預(yù) 40只大鼠隨機(jī)分為健康組、模型組、miR-27b-NC組及miR-27b組,每組10只。除健康組外,其余3組建立心力衰竭模型:戊巴比妥鈉麻醉后備皮,暴露腹腔并游離出主動(dòng)脈,在主動(dòng)脈旁置入7號針后,用絲線分離出主動(dòng)脈與7號針,結(jié)扎后拔出針,縮窄65%左右的腹主動(dòng)脈,縫合。術(shù)后予青霉素腹腔注射5 d,預(yù)防感染。造模期間意外死亡3只大鼠,模型組、miR-27b-NC組及miR-27b組為每組9只大鼠。建模成功標(biāo)準(zhǔn)見病理檢查結(jié)果。大鼠建模成功24 h后,健康組、模型組大鼠均于腹主動(dòng)脈注射5 μl生理鹽水,miR-27b-NC組及miR-27b組于腹主動(dòng)脈分別注射5 μl(20 nmol/L)拮抗劑陰性對照、5 μl(20 nmol/L)miR-27b拮抗劑,1次/d,共4 w。

1.4取材 建模2 w后,每組取3只大鼠,采用磷酸鹽緩沖液(PBS)經(jīng)腹主動(dòng)脈灌流,取大鼠心臟組織標(biāo)本,縱向切取左室0.3～0.5 cm的心肌組織,于液氮中保存。將剩余部分心肌組織于多聚甲醛中固定,后行HE染色及Masson染色觀察病理學(xué)形態(tài)。治療結(jié)束后,麻醉大鼠,暴露心臟,采集心尖部血液5 ml,置于-80 ℃冰箱中待檢,后按照上述方法取大鼠心肌組織備用。

1.5HE及Masson染色觀察心肌組織病理形態(tài)及纖維化 取各組于多聚甲醛中固定的心肌組織,石蠟包埋、切片,行HE和Masson染色,顯微鏡下觀察心肌組織病理學(xué)改變和膠原纖維化情況。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測miR-27b、AMPK、PPARα mRNA指標(biāo)水平 取各組心肌組織,剪碎、研磨、離心后,Trizol提取總RNA。根據(jù)cDNA 第一鏈合成試劑盒說明,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。PCR條件:預(yù)變性95 ℃,1 min;94 ℃,30 s;54 ℃,30 s;72 ℃,1 min。共40個(gè)循,72 ℃ 5 min,以β-actin作為內(nèi)參?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量=2-ΔΔCt。引物序列:miR-27b正向:5′-GGGGTTCACAGTGGCTAAG-3′,反向:5′-CAGTGCG TGTCGTGGAGT-3′(118 bp);AMPK正向:5′-TCGACAGAAGA TTCGGAGCC-3′,反向:5′-CTTGGAGTTCGAAAAG TCCGT-3′(166 bp);PPARα正向:5′-AAGCCATCTTCACGATGCTG-3′,反向:5′-TCAGAGGTCCCTGAACAGTG-3′(117 bp),β-actin正向:5′-GCGAGAA GATGACCCAGAT-3′,反向:5′-CCAGTGGTACGGCCAGAGG-3′(528 bp)。

1.7ELISA法檢測心肌細(xì)胞能量代謝指標(biāo) 取各組大鼠心尖部血液2 ml,2 000 r/min離心15 min,取上清,于-80 ℃冰箱中待檢。采用ELISA檢測血清N末端B型腦鈉肽前體(NT-proBNP)和游離脂肪酸 (FFA)水平。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑盒說明書。

1.8TUNEL檢測心肌細(xì)胞凋亡 取各組心肌組織石蠟切片,根據(jù)TUNEL試劑盒說明處理,鏡下觀察并拍攝圖片,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,鏡下觀察并計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞。

1.9免疫印跡檢測自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin-1、CathD表達(dá) 取各組心肌組織剪碎后研磨,裂解液裂解,勻漿機(jī)勻漿,離心5 min,3 000 r/min,離心半徑為2 cm,取上清,辛可寧酸(BCA)法測定蛋白總濃度,將蛋白煮沸后取20 μl蛋白進(jìn)行電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,脫脂奶粉封閉2 h,加入LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin-1、CathD一抗(1∶500) 孵育過夜,PBS清洗,加入羊抗兔二抗(1∶1 000)孵育2 h,PBS清洗,增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色,凝膠成像儀中觀察并攝像,以 ImageJ 分析各組蛋白相對表達(dá)。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q法或t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1HE染色及Masson染色觀察結(jié)果 HE染色:健康組心肌細(xì)胞形態(tài)正常,結(jié)構(gòu)清晰;模型組與miR-27b-NC組心肌細(xì)胞水腫并有大量炎性細(xì)胞浸潤,此外產(chǎn)生大量成纖維細(xì)胞;miR-27b組與模型組相比,成纖維細(xì)胞增生及炎性細(xì)胞浸潤減少。Masson染色:膠原纖維呈現(xiàn)藍(lán)紫色,心肌細(xì)胞及肌纖維呈現(xiàn)紅色。健康組心肌組織結(jié)構(gòu)正常,心腔附近有少量膠原纖維;模型組與miR-27b-NC組膠原纖維顯著增加;與模型組相比,miR-27b組膠原纖維增生有所減少,見圖1。上述結(jié)果提示建模成功。

圖1 各組心肌組織病理

2.2各組心肌細(xì)胞凋亡比較 健康組細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色染色,邊界清晰。模型組與miR-27b-NC組可見大量棕色染色,細(xì)胞核固縮;與模型組相比,miR-27b組深染棕色細(xì)胞核減少,見圖2。

2.3各組心肌組織中miR-27b、AMPK、PPARα mRNA表達(dá)比較 與健康組相比,其余3組心肌組織中miR-27b表達(dá)顯著升高,AMPK mRNA、PPARα mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05);模型組與miR-27b-NC組心肌組織中miR-27b、AMPK mRNA、PPARα mRNA表達(dá)對比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);與模型組和miR-27b-NC組相比,miR-27b組心肌組織中miR-27b表達(dá)顯著降低,AMPK、PPARα mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05),見表1。

表1 各組miR-27b、AMPK、PPARα mRNA表達(dá)及NT-proBNP、FFA水平對比

2.4各組細(xì)胞能量代謝指標(biāo)比較 與健康組相比,其余3組血清中NT-proBNP、FFA水平顯著升高(P<0.05);模型組與miR-27b-NC組血清中NT-proBNP、FFA水平對比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);與模型組和miR-27b-NC組相比,miR-27b組NT-proBNP、FFA水平顯著降低(P<0.05),見表1。

2.5各組心肌組織中LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin-1、CathD蛋白表達(dá)比較 與健康組相比,其余3組心肌組織中LC3Ⅰ水平顯著降低,LC3Ⅱ、Beclin-1、CathD水平顯著升高(P<0.05);模型組與miR-27b-NC組心肌組織中LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin-1、CathD水平對比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);與模型組和miR-27b-NC組相比,miR-27b組心肌組織中LC3Ⅰ水平顯著升高,LC3Ⅱ、Beclin-1、CathD水平顯著降低(P<0.05),見表2、圖3。

表2 各組LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin-1、CathD蛋白表達(dá)比較

圖3 各組LC3Ⅱ、Ⅰ、Beclin-1、CathD蛋白表達(dá)

3 討 論

心肌細(xì)胞自噬在心力衰竭中發(fā)揮重要作用,心肌細(xì)胞自噬的形成與降解發(fā)生異常,使自噬體異常堆積,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔10〕。自噬主要由細(xì)胞內(nèi)缺氧、應(yīng)激等因素誘發(fā)。自噬本是機(jī)體的正常生理應(yīng)激反應(yīng),但在多種疾病發(fā)展中,細(xì)胞異常自噬發(fā)揮了重要作用。研究顯示〔11〕,自噬會(huì)減少心肌細(xì)胞數(shù)量,促進(jìn)心力衰竭發(fā)展。LC3Ⅰ、Ⅱ、Beclin-1 和CathD是與細(xì)胞自噬密切相關(guān)的蛋白。Beclin-1 和 CathD在正常細(xì)胞中表達(dá)量極低,而在發(fā)生自噬的細(xì)胞中表達(dá)量明顯增高;LC3Ⅰ、Ⅱ是LC3的兩種類型,在自噬發(fā)生后,LC3Ⅰ與相關(guān)蛋白結(jié)合后形成LC3Ⅱ,可反應(yīng)自噬的活性。miR-27b與自噬具有密切的聯(lián)系。研究表明〔12〕,抑制miR-27b可降低心肌細(xì)胞凋亡率。另外〔13〕,miR-27b與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡過程有關(guān)。且在張韓等〔14〕研究中已經(jīng)證明,沉默miR-27b表達(dá)后,通過抑制B細(xì)胞淋巴瘤基因(Bcl)-2腺病毒E/B19 kD相互作用蛋白(BNIP3)水平,激活Wnt/β-連環(huán)蛋白(catenin)通路,抑制自噬過程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示低表達(dá)的miR-27b具有抑制心肌細(xì)胞凋亡及自噬的作用。

心肌正常的能量代謝是心臟功能穩(wěn)定的基礎(chǔ)。在心力衰竭產(chǎn)生后,心肌組織能量代謝發(fā)生紊亂,導(dǎo)致心肌的能量供應(yīng)不足。正常心肌活動(dòng)是由FA和葡萄糖氧化代謝產(chǎn)生的ATP供能,其中FA是心肌能量代謝的主要來源;心力衰竭時(shí)FA氧化降低,血清FFA水平明顯升高,FFA能損傷線粒體功能和呼吸鏈,抑制ATP的生成,使心肌細(xì)胞的能量產(chǎn)生和利用均出現(xiàn)障礙,加劇了心功能的惡化〔15〕。NT-proBNP參與心室重構(gòu)過程,是心力衰竭的診斷指標(biāo)。研究提示〔16〕,異常高表達(dá)的NT-proBNP水平提示心肌損傷嚴(yán)重,心肌能量代謝差。PPARα是AMPK通路的下游靶分子,對維持心肌能量代謝平衡具有一定作用。AMPK通過上調(diào)PPARα表達(dá)增加心肌線粒體脂肪酶活性,促進(jìn)ATP產(chǎn)生,加強(qiáng)FFA氧化代謝及利用率,改善心力衰竭〔17〕。心肌能量需求中FFA占據(jù)70%左右,葡萄糖占據(jù)近30%,心力衰竭產(chǎn)生后會(huì)導(dǎo)致葡萄糖代謝增加,FFA的利用減少,影響線粒體功能,抑制糖酵解,導(dǎo)致心肌能量不足發(fā)生重構(gòu),促進(jìn)心功能的惡化〔18〕。何遠(yuǎn)利等〔19〕研究提示,心力衰竭寧合劑通過調(diào)控AMPK/PPARα通路,抑制FFA水平表達(dá),改善心力衰竭大鼠心肌能量代謝。沈林園〔20〕研究結(jié)果提示,抑制miR-27b水平后,能量代謝水平標(biāo)記基因AMPK的表達(dá)量也顯著降低,表明miR-23a和miR-27b可以顯著地降低細(xì)胞的能量代謝水平。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述結(jié)論相似,提示抑制miR-27b水平后,通過調(diào)控AMPK/PPARα通路改善心肌能量代謝水平,從而起到保護(hù)心功能的作用。

綜上所述,抑制miR-27b表達(dá)后可抑制心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞自噬,減少心肌細(xì)胞凋亡,同時(shí)通過調(diào)控AMPK/PPARα通路改善心肌能量代謝水平,從而起到心保護(hù)的作用。