miR-576-5p通過(guò)結(jié)合CADM2調(diào)節(jié)胃腺癌DNA損傷和放化療敏感性

裴正浩 王耿澤 夏西超 張虎 王鈞 郝陽(yáng)

(1南陽(yáng)市中心醫(yī)院胃腸外科,河南 南陽(yáng) 473000;2平頂山學(xué)院醫(yī)學(xué)院)

胃腺癌是起源于胃壁表層黏膜上皮細(xì)胞的消化道惡性腫瘤之一,多發(fā)生于胃竇、幽門、賁門等部位〔1〕。早期胃腺癌癥狀不顯,診斷率低,大多數(shù)患者往往在晚期才被診斷出來(lái),錯(cuò)過(guò)了最佳手術(shù)期,治療效果大打折扣〔2〕。目前臨床治療晚期胃腺癌多通過(guò)輔助放化療、分子靶向治療和免疫治療等方式,但因晚期胃腺癌患者多伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和化療抵抗〔3〕,放化療的治療效果較差,因此尋找胃腺癌治療新的分子靶點(diǎn)意義重大。miRNAs是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性小非編碼RNA,被過(guò)往研究證實(shí)可作為胃腺癌治療的有效靶點(diǎn),參與調(diào)控胃腺癌的腫瘤進(jìn)展〔4〕。miR-96-5p在胃腺癌患者血漿和胃腺癌細(xì)胞中過(guò)度表達(dá),miR-96-5p通過(guò)靶向抑制叉形頭轉(zhuǎn)錄因子的O亞型FOXO3表達(dá),顯著促進(jìn)胃腺癌細(xì)胞的體外增殖〔5〕。miR-576-5p作為miRNAs家族的一員,尚不清楚其在胃腺癌細(xì)胞增殖、DNA損傷和耐藥機(jī)制中發(fā)揮的具體作用。調(diào)控細(xì)胞黏附分子(CADM)2是類膜表面糖蛋白,參與維持細(xì)胞黏附、極性和腫瘤抑制等過(guò)程,在膠質(zhì)瘤等實(shí)體瘤中異常表達(dá),并影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等細(xì)胞生命周期〔6〕。有報(bào)道稱,CADM2可受miR-146a等miRNA調(diào)控,抑制腎透明細(xì)胞癌的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲〔7〕。本實(shí)驗(yàn)旨在探究miR-576-5p調(diào)控CADM對(duì)胃腺癌細(xì)胞DNA損傷和化療敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1生物信息學(xué)分析 GSE26595、GSE158662和GSE61741數(shù)據(jù)集下載自GEO數(shù)據(jù)庫(kù),GEO2R軟件分析差異表達(dá)基因。下載TCGA_STAD數(shù)據(jù)矩陣,分析miR-576-5p在胃腺癌組織中的表達(dá)水平?；蚋患治鰉iR-576-5p與細(xì)胞增殖和DNA損傷的關(guān)系。miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)及靶基因分析軟件PITA和microT在線預(yù)測(cè)miR-576-5p的下游靶基因,FDR<0.25時(shí)視為基因顯著性富集。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人胃腺癌細(xì)胞系BGC-823和SGC-7901細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心,酒精消毒超凈臺(tái)后,將含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基放置在超凈臺(tái),將BGC-823和SGC-7901放入培養(yǎng)基中,并加入含1%青霉素和鏈霉素混合物的抗體,將培養(yǎng)置于二氧化碳濃度為5%,溫度為37 ℃的恒溫箱中,每隔48 h更換一次培養(yǎng)液,待細(xì)胞生長(zhǎng)密度接近100%前對(duì)其進(jìn)行消化傳代,按照轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(上海羅氏制藥有限公司)將miR-576-5p質(zhì)粒和對(duì)照miR-NC轉(zhuǎn)染至BGC-823和SGC-7901細(xì)胞中,用G418篩選出穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-NC/miR-576-5p的BGC-823和SGC-7901,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照轉(zhuǎn)染說(shuō)明書,在BGC-823/SGC-7901 miR-576-5p細(xì)胞中轉(zhuǎn)染CADM2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,仍然保持培養(yǎng)箱中二氧化碳濃度為5%,溫度為37 ℃,孵育48 h后做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK8)檢測(cè)細(xì)胞活力 取經(jīng)不同細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組BGC-823和SGC-7901細(xì)胞,按照5×103個(gè)/孔接種于96孔板中,保持每孔中二氧化碳濃度為5%,溫度為37 ℃,培養(yǎng)24 h后加入10 μl的CCK8溶液,使用微孔板酶標(biāo)儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)檢測(cè)各組細(xì)胞在波長(zhǎng)450 nm處的吸光度值,分別于CCK8處理后的5 d內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞中mRNA表達(dá) 采用TRIzol試劑(Invitrogen公司)將BGC-823和SGC-7901細(xì)胞中的總RNA提取出來(lái),逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,使用便攜式qRT-PCR儀(濟(jì)南泰醫(yī)生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行PCR檢測(cè),測(cè)定BGC-823和SGC-7901細(xì)胞中miR-576-5p(以U6作為標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參)和CADM2(以GAPDH作為標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參)的mRNA表達(dá)。miR-576-5p上游引物5′-TTGGGTCAAGAGTCAGAAGTTT-3′,下游:5′-TGGCTTCTACTTGTCCTTTCC-3′;CADM2上游引物5′-ATTTGACCACTGGAGGGAGG-3′,下游:5′-TTCCTTCCCCAGCCCTTTAG-3′;U6上游引物5′-AAAGCAAATCATCGGACGACC-3′,下游:5′-GTACAACACATTGTTTCCTC GGA-3′;GAPDH上游引物5′-ATCATCCCTGCCTCT ACTGG-3′,下游:5′-GTCAGGTCCACCACTGACAC-3′。

1.5Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中的蛋白表達(dá) 收集2×106個(gè)未經(jīng)處理的BGC-823和SGC-7901細(xì)胞,用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)洗滌細(xì)胞3次,將各組細(xì)胞裂解后以二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定上清液中的蛋白濃度。將各組細(xì)胞凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜封閉2 h,緩沖液洗滌3次后,加入CADM2和磷酸化組蛋白H2AX(γH2AX)一抗于4 ℃條件下孵育16～18 h,緩沖液洗滌3次后,加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫下孵育1 h,緩沖液沖洗后用超敏化學(xué)發(fā)光液顯影,ImageJ軟件分析CADM2和γH2AX蛋白灰度值。

1.6射線照射和免疫熒光 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BGC-823和SGC-7901細(xì)胞,更換新鮮培養(yǎng)基后,將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含賴氨酸的蓋玻片上,第2天按照國(guó)家次級(jí)標(biāo)準(zhǔn)劑量學(xué)實(shí)驗(yàn)室γ射線照射標(biāo)準(zhǔn)對(duì)BGC-823和SGC-7901細(xì)胞進(jìn)行照射,劑量分別為0、2、4、5 Gy。

1.7雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn) 構(gòu)建野生型及突變型CADM2報(bào)告基因,按照上述轉(zhuǎn)染步驟將miR-576-5p模擬物轉(zhuǎn)染至BGC-823和SGC-7901細(xì)胞中,48 h后按照雙熒光素酶試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)說(shuō)明書操作,以測(cè)定各組細(xì)胞熒光素酶活性,驗(yàn)證miR-576-5p和CADM2的調(diào)控關(guān)系。

1.8裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn) 將購(gòu)買的18只無(wú)胸腺裸鼠飼養(yǎng)于裝備有空氣過(guò)濾裝置的飼養(yǎng)籠中,保持28 ℃的恒溫條件,維持相對(duì)濕度在40%左右,給予充足光照、飼料及潔凈的水源,定期對(duì)飼養(yǎng)籠進(jìn)行滅菌處理。將穩(wěn)定表達(dá)miR-576-5p的BGC-823細(xì)胞消化高速離心后,PBS重懸后調(diào)整細(xì)胞密度為1×107個(gè)/ml。采用容量為1 ml的注射器將BGC-823細(xì)胞懸液沿裸鼠皮下進(jìn)針后前行至腋下,每只裸鼠分別注射100 μl細(xì)胞懸液,待觀察到皮下腫塊形成后表明裸鼠成瘤模型構(gòu)建成功,分別在成瘤后0～14 d時(shí)采用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤最長(zhǎng)直徑和最短直徑,腫瘤體積=(最長(zhǎng)直徑×最短直徑2)/2,成瘤2 w后處死裸鼠,分離腫瘤組織,并稱重。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Graphpad Prism8軟件繪制圖表,SPSS22.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、單因素方差分析及受試者工作特征(ROC)曲線。

2 結(jié) 果

2.1miR-576-5p在胃腺癌的表達(dá) GEO R分析GSE26595和GSE61741的差異表達(dá)基因,其中GSE26595有21個(gè)上調(diào)基因,GSE61741有94個(gè)。對(duì)上調(diào)表達(dá)基因取交集,發(fā)現(xiàn)在hsa-miR-432、hsa-miR-576-5p、hsa-miR-224、hsa-miR-1246等4個(gè)共同上調(diào)的差異miRNA中,miR-576-5p在胃腺癌中沒(méi)有被研究過(guò)。TCGA_STAD數(shù)據(jù)結(jié)果顯示,miR-576-5p在腫瘤組織表達(dá)(4.01±0.72)顯著高于癌旁組織(1.54±0.46;P<0.05)。ROC曲線表明,miR-576-5p對(duì)于胃腺癌的診斷有較高的臨床價(jià)值〔曲線下面積(AUC)0.742,敏感度70.75%,特異性71.74%,95%CI:0.699～0.782,P<0.05〕。以miR-576-5p表達(dá)水平的四分位數(shù)分組,將TCGA中胃腺癌患者分為低四分之一和高四分之三兩組,GSEA分析發(fā)現(xiàn)調(diào)控細(xì)胞增殖和DNA損傷相關(guān)基因集富集在miR-576-5p高表達(dá)組,表明miR-576-5p表達(dá)水平與細(xì)胞增殖和DNA損傷有關(guān)(FDR<0.25),見(jiàn)圖1。

圖1 miR-576-5p在胃腺癌中高表達(dá),與胃腺癌DNA損傷和細(xì)胞增殖有關(guān)

2.2miR-576-5p在體內(nèi)外促進(jìn)胃腺癌細(xì)胞增殖 向胃腺癌BGC-823和SGC-7901細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-576-5p模擬物,qRT-PCR結(jié)果表明,與miR-NC組(0.97±0.08、1.00±0.10)相比,miR-576-5p組miR-576-5p表達(dá)(5.08±0.56、5.32±0.05)顯著上調(diào)(P<0.05)。CCK8檢測(cè)細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn),與miR-NC組相比,miR-576-5p組細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)(P<0.05),見(jiàn)表1。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,miR-576-5p過(guò)表達(dá)顯著誘導(dǎo)了胃腺癌BGC-823細(xì)胞的體內(nèi)生長(zhǎng),腫瘤體積顯著增加(P<0.05),見(jiàn)表2。成瘤2 w后,miR-576-5p組腫瘤質(zhì)量〔(0.31±0.05)g〕顯著大于miR-NC組〔(0.24±0.03)g;P<0.05〕。qRT-PCR檢測(cè)腫瘤組織中miR-576-5p的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-576-5p在miR-576-5p過(guò)表達(dá)的腫瘤組織中(4.22±0.41)較miR-NC組(1.01±0.09)顯著上調(diào)(P<0.05)。

表1 兩組BGC-823和SGC-7901細(xì)胞活力比較

表2 兩組不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤體積變化

2.3miR-576-5p抑制胃腺癌細(xì)胞DNA損傷 免疫熒光法檢測(cè)γ射線照射的胃腺癌BGC-823和SGC-7901細(xì)胞中γH2AX焦點(diǎn)形成情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著照射劑量的增加,γH2AX焦點(diǎn)數(shù)量顯著減少(P<0.05)。Western印跡結(jié)果表明,與miR-NC組相比,miR-576-5p組γH2AX蛋白表達(dá)顯著下調(diào),且呈照射劑量依賴性,見(jiàn)圖2、圖3。

1～2:miR-NC組、miR-576-5p組

圖3 兩組不同劑量照射下γH2AX焦點(diǎn)數(shù)量(×4,雙向電泳凝膠染色法)

2.4miR-576-5p抑制胃腺癌細(xì)胞對(duì)多柔比星的化療敏感性 將不同濃度(0、0.001、0.010、0.100、1.000、10.000 μg/ml)的多柔比星處理胃腺癌BGC-823和SGC-7901細(xì)胞,CCK8檢測(cè)細(xì)胞活力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與miR-NC組相比,miR-576-5p劑量依賴性抑制細(xì)胞活力(P<0.05),見(jiàn)表3。

表3 兩組BGC-823和SGC-7901細(xì)胞對(duì)多柔比星的化療敏感性比較

2.5miR-576-5p能夠結(jié)合CADM2,且抑制其表達(dá) PITA和microT在線預(yù)測(cè)MiR-576-5p的靶基因,并與GSE158662數(shù)據(jù)中胃腺癌表達(dá)下調(diào)的基因取交集(圖4),CADM2、TOX、PRKACB、AK4、LRRC17、ERO1B、LIFR 7個(gè)基因表達(dá)下調(diào)(LogFC分別為-1.03、-1.31、-1.66、-1.80、-2.06、-2.32、-2.68)。下載TCGA_STAD數(shù)據(jù),進(jìn)一步對(duì)這7個(gè)基因分析,發(fā)現(xiàn)CADM2與細(xì)胞增殖和DNA損傷均相關(guān)(CADM2中位數(shù)分組)(圖5)。miR-576-5p靶向并結(jié)合CADM2(圖6)。與miR-NC組相比,miR-576-5p組CADM-WT-3′UTR(0.52±0.04)顯著低于miR-NC組(1.01±0.09;P<0.05),CADM2-MT-3′UTR(1.00±0.11、1.01±1.00)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。與miR-NC組BGC-823、SGC-7901 mRN(1.01±0.08、1.00±0.09)相比,miR-576-5p過(guò)表達(dá)顯著抑制了CADM2 mRNA(0.32±0.05、0.34±0.03)和蛋白表達(dá)(P<0.05),見(jiàn)圖7。

圖4 PITA和microT在線預(yù)測(cè)MiR-576-5p的靶基因,并與GSE158662數(shù)據(jù)中胃腺癌表達(dá)下調(diào)的基因取交集

圖5 基因富集分析miR-576-5p與細(xì)胞增殖和DNA損傷的關(guān)系

圖6 miR-576-5p靶向并結(jié)合CADM2

1～3:miR-NC組、miR-576-5p組、miR-576-5p+CADM2組

2.6miR-576-5p通過(guò)靶向結(jié)合CADM2促進(jìn)胃腺癌細(xì)胞增殖 miR-576-5p過(guò)表達(dá)的BGC-823和SGC-7901細(xì)胞中轉(zhuǎn)染CADM2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,Western印跡檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與miR-NC組相比,miR-576-5p組CADM2表達(dá)顯著下調(diào),而與miR-576-5p組相比,miR-576-5p+CADM2組CADM2表達(dá)上調(diào),見(jiàn)圖7。CCK8檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與miR-NC組相比,miR-576-5p組細(xì)胞活性顯著增強(qiáng),而與miR-576-5p組相比,miR-576-5p+CADM2組細(xì)胞活性顯著被抑制(P<0.05),見(jiàn)表4。

表4 3組BGC-823和SGC-7901細(xì)胞活性比較

3 討 論

胃腺癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)、最致命的惡性腫瘤之一,現(xiàn)階段治療胃腺癌的重要手段為放射治療、化學(xué)治療、分子治療等,而腫瘤細(xì)胞的化療敏感性降低是導(dǎo)致化療失敗的最主要原因〔8〕。隨著對(duì)胃腺癌的不斷探究,越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn),DNA損傷是引發(fā)胃腺癌等癌癥的重要因素〔9,10〕。當(dāng)DNA的雙螺旋分子結(jié)構(gòu)被破壞,DNA雙鏈斷裂,缺少完整的互補(bǔ)鏈作為修復(fù)模板,導(dǎo)致基因組穩(wěn)定性降低,最終引發(fā)癌癥〔11〕。然而對(duì)于腫瘤細(xì)胞而言,腫瘤細(xì)胞的DNA損傷可使其細(xì)胞損傷修復(fù)能力顯著增強(qiáng),進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),胃腺癌的DNA損傷和化療敏感性的改變與細(xì)胞內(nèi)miR-576-5p的異常表達(dá)有關(guān),miR-576-5p通過(guò)靶向結(jié)合CADM2,抑制胃腺癌細(xì)胞DNA損傷,增強(qiáng)化療抵抗性,促進(jìn)細(xì)胞增殖,加速胃腺癌的惡性進(jìn)展。

多種miRNA表達(dá)失調(diào)被證實(shí)與胃腺癌等惡性腫瘤增殖、遷移、侵襲、凋亡、上皮間細(xì)胞-充質(zhì)轉(zhuǎn)化和耐藥有關(guān)〔12,13〕,Zheng等〔14〕研究發(fā)現(xiàn),M2極化的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞miR-21外泌體可從巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)移至胃腺癌細(xì)胞中,通過(guò)抑制PTEN基因表達(dá),激活PI3K/AKT通路的磷酸化,抑制細(xì)胞凋亡,顯著促進(jìn)胃腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性。此外,也有報(bào)道顯示,miR-21、miR-24和miR-421等miRNA在彌漫性胃腺癌組織中高表達(dá),并成為DNA損傷應(yīng)答的靶基因,通過(guò)調(diào)控APE1等活性氧誘導(dǎo)損傷修復(fù)基因及ATM、ATR和H2AX等DNA損傷識(shí)別基因的表達(dá),影響胃腺癌的DNA損傷過(guò)程〔15〕。本研究結(jié)果與之較為相符,發(fā)現(xiàn)miR-576-5p在胃腺癌中高表達(dá),過(guò)表達(dá)miR-576-5p可通過(guò)抑制DNA損傷,抑制胃腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物多柔比星的敏感性,促進(jìn)胃腺癌細(xì)胞增殖。這可能與miR-576-5p對(duì)DNA損傷標(biāo)志蛋白γH2AX基因的調(diào)控作用有關(guān),miR-576-5p通過(guò)下調(diào)γH2AX的表達(dá),通過(guò)直接修復(fù)、堿基切割修復(fù)和核苷酸剪切修復(fù)等多種途徑保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受化療藥物的DNA損傷效果〔16〕,抑制其化療敏感性,誘導(dǎo)腫瘤進(jìn)展。CADM2最初被認(rèn)為是與肥胖和抑郁、焦慮、雙相情感障礙等精神疾病有關(guān)的基因〔17〕,最新研究發(fā)現(xiàn),CADM2可作為多種miRNA的下游靶點(diǎn),與miRNA分子及多種蛋白和信號(hào)通路結(jié)合,參與影響多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展,在腫瘤中發(fā)揮維持細(xì)胞極性和抑癌的作用〔18〕。如miR-10b與CADM2的3′非翻譯區(qū)結(jié)合,過(guò)表達(dá)miR-10b下調(diào)CADM2的表達(dá),上調(diào)肝細(xì)胞Hep 3B細(xì)胞中FAK的表達(dá),激活A(yù)KT信號(hào)通路,進(jìn)而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞遷移和上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化〔19〕。本研究也發(fā)現(xiàn),CADM2是miR-576-5p的重要下游靶點(diǎn),過(guò)表達(dá)miR-576-5p通過(guò)靶向抑制CADM2表達(dá),抑制胃腺癌細(xì)胞DNA損傷,提高胃腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗性,促進(jìn)胃腺癌細(xì)胞體內(nèi)外增殖。推測(cè)原因可能為,miR-576-5p作為CADM2的上游分子,通過(guò)促進(jìn)CADM2啟動(dòng)子的甲基化,進(jìn)而下調(diào)胃腺癌細(xì)胞內(nèi)CADM2表達(dá),而CADM2作為抑癌基因,通過(guò)破壞腫瘤細(xì)胞內(nèi)分子結(jié)構(gòu)的完整和穩(wěn)定性〔20〕,在胃腺癌細(xì)胞DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮顯著的抑制作用,而miR-576-5p通過(guò)抑制其表達(dá),進(jìn)一步抑制了DNA損傷和對(duì)化療藥物的敏感性。本研究結(jié)果中,CADM2過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-576-5p對(duì)胃腺癌細(xì)胞的促增殖效應(yīng)也進(jìn)一步證實(shí)了這點(diǎn)。

綜上,miR-576-5p通過(guò)結(jié)合CADM2調(diào)節(jié)胃腺癌細(xì)胞DNA損傷和化療敏感性,其機(jī)制是通過(guò)靶向抑制CADM2,抑制γH2AX蛋白表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn),最終發(fā)揮其顯著的促癌效應(yīng),提示miR-576-5p/CADM2調(diào)節(jié)軸在胃腺癌細(xì)胞的DNA損傷和耐藥中發(fā)揮重要作用。