FOXM1通過調(diào)節(jié)KIF20A介導巨噬細胞M2極化對食管鱗狀細胞癌細胞的作用

王玉萍 劉約瑟 張玉珂 李登科 王玲玲

(河南省中醫(yī)院(河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院)腫瘤內(nèi)科一區(qū),河南 鄭州 450000)

食管癌是全球第六大常見的癌癥相關(guān)死亡原因。由于缺乏針對性的早期診斷和治療方法,食管癌患者5年存活率仍然很低(9.0%～27.1%)〔1〕。全球約50%的食管癌病例發(fā)生在中國,絕大多數(shù)病例(>90%)的組織病理學形式為食管鱗狀細胞癌(ESCC)〔2〕。巨噬細胞是參與宿主免疫系統(tǒng)最豐富的腫瘤基質(zhì)細胞。巨噬細胞極化受到來自腫瘤細胞各種微環(huán)境信號的調(diào)節(jié)。腫瘤細胞也會分泌大量細胞因子來誘導腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAM)的極化〔3〕。研究顯示,高水平M2巨噬細胞浸潤與ESCC患者預后不良有關(guān),靶向抑制巨噬細胞M2極化在治療ESCC方面具有重要意義〔4〕。FOXM1是Forkhead box(Fox)轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,在ESCC患者癌組織標本中表達升高,是ESCC治療的一個很有前途的治療靶點〔5〕。另有證據(jù)顯示,Kinesin家族成員20A(KIF20A)在ESCC患者癌組織標本中表達升高,且其高表達與患者總生存率和免疫浸潤密切相關(guān)〔6〕。此外,FOXM1可通過靶向調(diào)控KIF20A的表達促進卵巢癌細胞增殖和侵襲能力〔7〕。然而,關(guān)于FOXM1和KIF20A 在ESCC中的具體作用機制及其對ESCC相關(guān)TAM的影響尚不明確。本研究旨在探究FOXM1是否通過KIF20A調(diào)控 TAM向M2表型轉(zhuǎn)化,從而在ESCC細胞中發(fā)揮作用,以期明確ESCC發(fā)生發(fā)展分子機制。

1 材料與方法

1.1主要材料 正常食管上皮細胞(Het-1A)和人食管鱗狀細胞癌細胞(KYSE70)購自美國ATCC;人急性單核細胞白血病細胞(THP-1)購自武漢普諾賽生命科技有限公司;siRNA對照(si-NC)、FOXM1特異性siRNA(si-FOXM1)、KIF20A過表達載體(oe-KIF20A)、過表達載體對照(oe-NC)、KIF20A的3′-UTR端的野生型(KIF20A-WT)和突變型(KIF20A-MUT)的合成與構(gòu)建均由云舟生物科技(廣州)有限公司完成;轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自美國賽默飛公司;熒光素酶報告基因檢測試劑盒和EdU檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;ChIP 試劑盒購自美國CST;2xSYBR Green qPCR MasterMix購自美國Bimake;FOXM1、KIF20A、Arg-1和白細胞介素(IL)-10抗體均購自英國Abcam公司;E-鈣黏蛋白(cadherin)、N-cadherin和GAPDH抗體購自美國GeneTex;佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)購自美國Sigma;CCK-8試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染分組 在37 ℃、5% CO2環(huán)境下,Het-1A細胞、KYSE70細胞和THP-1細胞用含10% 胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。將KYSE70細胞接種于6孔板,控制細胞密度為每孔1×106個,分為空白對照組(不進行轉(zhuǎn)染)、si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-FOXM1組(轉(zhuǎn)染si-FOXM1)、si-NC+oe-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC和oe-NC)、si-FOXM1+oe-NC組(轉(zhuǎn)染si-FOXM1和oe-NC)、si-NC+oe-KIF20A組(轉(zhuǎn)染si-NC和oe-KIF20A)、si-FOXM1+oe-KIF20A組(轉(zhuǎn)染si-FOXM1和oe-KIF20A),轉(zhuǎn)染操作依據(jù)LipofectamineTM2000說明書步驟。

1.3FOXM1對KIF20A的靶向調(diào)控檢測 采用生物信息學網(wǎng)站JASPAR和Consite預測FOXM1和KIF20A結(jié)合位點。構(gòu)建熒光素酶報告質(zhì)粒:KIF20A野生型(KIF20A-WT)和突變型(KIF20A-MUT)。分別將KIF20A-WT+si-NC、KIF20A-MUT+si-NC、KIF20A-WT+si-FOXM1和KIF20A-MUT+si-FOXM1轉(zhuǎn)染至KYSE70細胞中。依據(jù)熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書步驟,進行檢測熒光素酶活性檢測。

1.4染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)-PCR實驗檢測FOXM1對KIF20A 轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用 甲醛固定KYSE70細胞,依次進行裂解、超聲破碎,得到300～800 bp 的DNA片段。依據(jù)ChIP 試劑盒說明書進行后續(xù)實驗操作,分為FOXM1組、Input組和陰性對照IgG組,分別與ProteinA磁珠孵育后,加入FOXM1、Histone H3和IgG一抗。沉淀經(jīng)洗滌后,依次進行解交聯(lián)、蛋白酶消化。收集DNA片段作為實時熒光定量(qRT)-PCR實驗中的模板,以檢測KIF20A的轉(zhuǎn)錄富集。KIF20A上游引物:5′-TTCCTTACGCGGATTGGTAG-3′,下游:5′-AGCCGCAGAGCACAA CTC-3′,內(nèi)參上游引物:5′-CCGCCTCCCTCTTAGC ATAA-3′,下游:5′-CAGGAAATTGCATCTCGGGG-3′。

1.5qRT-PCR檢測FOXM1和KIF20A mRNA表達 采用Trizol法、反轉(zhuǎn)錄法獲得各組細胞cDNA。使用2×SYBR Green qPCR MasterMix試劑盒進行mRNA表達水平檢測:95 ℃、5 min預變性后,95 ℃、15 s,60 ℃、30 s,72 ℃、10 s,共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算FOXM1和KIF20A mRNA表達。FOXM1正向引物:5′-TCCTCCACCCCGAGCAA-3′,反向:5′-CGTGAGCCTCCAGGATTCAG-3′;KIF20A正向引物:5′-TGCTGTCCGATGACGATGTC-3′;反向:5′-AGGTTCTTGCGTACCACAGAC-3′;GAPDH正向引物:5′-CTCCTCCACCTTTGACGCTG-3′,反向:5′-TCCTCTTGTGCTCTTGCTGG-3′。

1.6Western印跡檢測FOXM1、KIF20A、Arg-1、IL-10、E-cadherin和N-cadherin 蛋白表達 收集Het-1A和KYSE70細胞,裂解并收集細胞上清。在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)中加入25 μg蛋白樣品,隨后電轉(zhuǎn)至膜上。封閉非特異性位點后,加入一抗4 ℃孵育過夜:FOXM1抗體(1∶1 000)、KIF20A抗體(1∶2 000)、Arg-1抗體(1∶1 000)、IL-10抗體(1∶1 000)、E-cadherin抗體(1∶2 000)、N-cadherin抗體(1∶2 000)和GAPDH抗體(1∶2 000)。隔天加入特異性二抗(1∶5 000),隨后加入發(fā)光液,在凝膠曝光儀下檢測蛋白條帶。通過ImageJ軟件分析條帶灰度值。

1.7巨噬細胞與KYSE70細胞共培養(yǎng) 將THP-1細胞鋪至6孔板中,待細胞貼壁后,加入100 nmol/L〔8〕PMA繼續(xù)培養(yǎng)48 h,誘導產(chǎn)生M0巨噬細胞。將M0巨噬細胞置于Transwell小室下室,上室接種KYSE70細胞,細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,收集TAM細胞來源培養(yǎng)液(分別命名為TAM、 si-NC+oe-NC+TAM、 si-FOXM1+oe-NC+TAM、 si-NC+oe-KIF20A+TAM和 si-FOXM1+oe-KIF20A+TAM)和TAM細胞,進行后續(xù)實驗操作。

1.8流式細胞術(shù)檢測TAM細胞中CD68+/CD206+細胞率 收集TAM細胞,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗并重懸細胞。在100 μl(1×107個)細胞懸液中加入CD68抗體、CD206抗體,室溫條件下避光孵育40 min。通過流式細胞儀進行檢測。

1.9TAM細胞來源上清液處理KYSE70細胞 收集KYSE70細胞鋪至6孔板中(1×106個/孔),將細胞分為空白對照組、TAM組、si-NC+oe-NC+TAM組、si-FOXM1+oe-NC+TAM組、si-NC+oe-KIF20A+TAM組、si-FOXM1+oe-KIF20A+TAM組,按照分組,向KYSE70細胞中分別加入TAM細胞來源上清液,共孵育48 h。

1.10CCK-8檢測細胞活力 收集KYSE70細胞鋪至96孔板(1×104個/孔),組別同1.9。細胞培養(yǎng)48 h后加入1/10體積CCK-8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)2 h。通過酶標儀檢測各孔450 nmol/L處的光密度(OD)值。細胞活力(%)=(實驗組OD值-空白組OD值)/(空白對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.115-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(EdU)檢測細胞增殖能力 收集KYSE70細胞鋪至96孔板(4×103個/孔)。細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h。向每孔細胞中加入5 μmol EdU溶液,培養(yǎng)2 h后,棄去培養(yǎng)基上清,加入4%多聚甲醛固定細胞。使用 TritonX-100裂解細胞10 min,隨后加入Alexa Fluor 647標記的Azide探針工作液,避光共孵育30 min;甲醇和PBS清洗細胞后,加入DAPI染液共孵育15 min,最后在熒光倒置顯微鏡下拍照記錄。

1.12Transwell實驗檢測KYSE70細胞遷移和侵襲 無血清培養(yǎng)基重懸KYSE70細胞,取細胞懸液鋪至Transwell上室(5×104個/室);吸取600 μl完全培養(yǎng)基加至Transwell下室。細胞培養(yǎng)24 h后,使用4%多聚甲醛固定小室中細胞,隨后加入結(jié)晶紫染色液染色15 min,遷移結(jié)果在顯微鏡下觀察。侵襲實驗中所用Transwell小室提前用濃度為20%基質(zhì)膠包被,其余實驗步驟與遷移實驗相同。

1.13統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1Het-1A和KYSE70細胞中FOXM1和KIF20A表達 與Het-1A組相比,KYSE70組細胞中FOXM1和KIF20A mRNA表達、FOXM1和KIF20A 蛋白表達均明顯升高(P<0.001),見圖1、表1。

圖1 Western印跡檢測Het-1A和KYSE70細胞中FOXM1和KIF20A蛋白表達

表1 Het-1A和KYSE70細胞中FOXM1和KIF20A mRNA和蛋白表達

2.2FOXM1介導KIF20A表達 與空白對照組相比,si-NC組KYSE70細胞中FOXM1和KIF20A表達無顯著差異(P>0.05);與si-NC組比較,si-FOXM1組FOXM1和KIF20A表達均明顯降低,KIF20A-WT熒光素酶活性明顯降低,KIF20A啟動子區(qū)域mRNA擴增明顯降低(P<0.05,P<0.001),見圖2、表2、表3。

圖2 Western印跡檢測KYSE70細胞中FOXM1和KIF20A 蛋白表達

表2 空白對照組、si-NC組、si-FOXM1組細胞中FOXM1和KIF20A mRNA和蛋白表達

表3 FOXM1介導KIF20A的表達

2.3KYSE70細胞FOXM1/KIF20A軸對M2型巨噬細胞產(chǎn)生的影響 與空白對照組相比,si-NC+oe-NC組KYSE70細胞中FOXM1和KIF20A 蛋白表達無顯著差異(P>0.05);與si-NC+oe-NC組比較,si-FOXM1+oe-NC組明顯降低(P<0.05),si-NC+oe-KIF20A組細胞中KIF20A 蛋白表達明顯升高(P<0.05),而FOXM1蛋白表達無顯著差異(P>0.05);與si-FOXM1+oe-NC組比較,si-FOXM1+oe-KIF20A組KYSE70細胞中KIF20A 蛋白表達明顯升高(P<0.05),而FOXM1蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見圖3、表4。

1～5:空白對照組、si-NC+oe-NC組、si-FOXM1+oe-NC組、si-NC+oe-KIF20A組、si-FOXM1+oe-KIF20A組;同5圖

表4 各組細胞中FOXM1和KIF20A 蛋白表達

與空白對照組比較,si-NC+oe-NC組TAM細胞中CD68+/CD206+細胞率、Arg-1和IL-10蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與si-NC+oe-NC組比較,si-FOXM1+oe-NC組均明顯降低(P<0.05),si-NC+oe-KIF20A組均明顯升高(P<0.05);與si-FOXM1+oe-NC組相比,si-FOXM1+oe-KIF20A組均明顯升高(P<0.05),見表4、圖4、圖5。

A:KYSE70細胞與M0巨噬細胞共培養(yǎng);B:流式細胞術(shù)檢測TAM細胞中CD68+/CD206+細胞

圖5 Western印跡檢測TAM細胞中Arg-1和IL-10蛋白表達

2.4FOXM1/KIF20A軸通過M2巨噬細胞對KYSE70細胞增殖的影響 與空白對照組相比,TAM組KYSE70細胞活力和EdU陽性細胞數(shù)明顯升高(P<0.05);TAM組和si-NC+oe-NC+TAM組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與si-NC+oe-NC+TAM組相比,si-FOXM1+oe-NC+TAM組均明顯降低(P<0.05),而si-NC+oe-KIF20A+TAM組均明顯升高(P<0.05);與si-FOXM1+oe-NC+TAM組相比,si-FOXM1+oe-KIF20A+TAM組均明顯升高(P<0.05),見圖6、表5。

圖6 EdU實驗檢測KYSE70細胞增殖(×200)

表5 FOXM1/KIF20A軸通過M2巨噬細胞對KYSE70細胞增殖的影響

2.5FOXM1/KIF20A軸通過M2巨噬細胞對KYSE70細胞遷移和侵襲的影響 與空白對照組相比,TAM組KYSE70細胞遷移和侵襲數(shù)明顯升高(P<0.05);TAM組和si-NC+oe-NC+TAM組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與si-NC+oe-NC+TAM組相比,si-FOXM1+oe-NC+TAM組KYSE70均明顯降低(P<0.05),而si-NC+oe-KIF20A+TAM組明顯升高(P<0.05);與si-FOXM1+oe-NC+TAM組相比,si-FOXM1+oe-KIF20A+TAM組明顯升高(P<0.05),見表6、圖7。

圖7 FOXM1/KIF20A軸通過M2巨噬細胞對KYSE70細胞遷移和侵襲的影響(結(jié)晶紫染色,×200)

表6 FOXM1/KIF20A軸通過M2巨噬細胞對KYSE70細胞增殖的影響

2.6FOXM1/KIF20A軸通過M2巨噬細胞對KYSE70細胞EMT的影響 與空白對照組比較,TAM組KYSE70細胞N-cadherin蛋白表達顯著升高,而E-cadherin蛋白表達顯著降低(P<0.05);TAM組和si-NC+oe-NC+TAM組比較無顯著差異(P>0.05);與si-NC+oe-NC+TAM組比較,si-FOXM1+oe-NC+TAM組N-cadherin蛋白表達顯著降低,E-cadherin蛋白表達明顯升高(P<0.05),而si-NC+oe-KIF20A+TAM組KYSE70細胞N-cadherin蛋白表達顯著升高,E-cadherin蛋白顯著表達降低(P<0.05);與si-FOXM1+oe-NC+TAM組相比,si-FOXM1+oe-KIF20A+TAM組KYSE70細胞N-cadherin蛋白表達顯著升高,E-cadherin蛋白表達顯著降低(P<0.05),見圖8、表7。

1～6:空白對照組、TAM組、si-NC+oe-NC+TAM組、si-FOXM1+oe-NC+TAM組、si-NC+oe-KIF20A+TAM組、si-FOXM1+oe-KIF20A+TAM組

表7 FOXM1/KIF20A軸通過M2巨噬細胞對KYSE70細胞EMT的影響

3 討 論

腫瘤微環(huán)境是一個高度異質(zhì)的生態(tài)系統(tǒng),由多種細胞成分組成,包括浸潤的淋巴細胞、成纖維細胞和內(nèi)皮細胞。在這些不同的細胞類型中,浸潤性TAM引起了人們的極大關(guān)注,因為其是許多癌癥類型中的一個不良預后因素〔9〕。TAM可誘導腫瘤微環(huán)境中的血管生成,抑制抗腫瘤免疫,直接刺激腫瘤細胞增殖。TAM還參與癌癥干細胞生態(tài)位和轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成,以促進腫瘤進展〔10〕。然而,關(guān)于TAM與ESCC的關(guān)系還需要進一步探究。

巨噬細胞有兩種不同的表型:促炎的M1和抗炎的M2。M1巨噬細胞是由干擾素-γ誘導,而M2巨噬細胞是由IL-4和IL-13誘導〔11〕。據(jù)報道,TAM具有與M2巨噬細胞相似的功能和表型特征。如TAM和M2巨噬細胞在IL-10或Arg1激活后均可發(fā)揮免疫抑制作用和促進血管生成〔12〕。已有證據(jù)顯示,靶向抑制巨噬細胞M0-M2極化和M2巨噬細胞在腫瘤微環(huán)境的募集,對開發(fā)新的預后和治療靶點以優(yōu)化目前的ESCC治療具有重要意義〔13〕。FOXM1是癌癥中的一個重要致癌因子。FOXM1通過直接促進其靶基因的表達或與其他因子相互作用,參與多種癌細胞過程,如細胞周期、衰老、凋亡、遷移、侵襲、氧化應激和耐藥性〔14〕。FOXM1在ESCC中發(fā)揮促腫瘤作用,FOXM1的高表達水平與ECSS患者低生存率和預后不良呈正相關(guān),FOXM1 過表達可促進ESCC細胞的侵襲和遷移,而敲低FOXM1 則產(chǎn)生相反作用〔15〕。Chen等〔16〕研究也證明,FOXM1參與了ESCC細胞關(guān)鍵生物過程的調(diào)控。激活FOXM1信號通路可促進ESCC細胞成瘤、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。此外,Li等〔17〕研究表明,FOXM1還與腫瘤免疫抑制有關(guān)。FOXM1過度表達與浸潤深度和預后相關(guān)。FOXM1可能通過募集FoxP3+Tregs誘導免疫抑制,從而導致腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移〔15〕。FOXM1在TAM募集中具有重要作用。巨噬細胞中FOXM1的表達是肺部炎癥、巨噬細胞進入腫瘤部位和肺部腫瘤生長所必需的〔18〕。本研究結(jié)果顯示,KYSE70細胞中FOXM1表達上調(diào)。敲低KYSE70細胞中FOXM1后,可抑制M0巨噬細胞向M2巨噬細胞分化,抑制巨噬細胞中IL-10和Arg1蛋白表達。KYSE70細胞和M0巨噬細胞共培養(yǎng)上清液si-FOXM1+oe-NC+TAM處理KYSE70細胞,可導致KYSE70細胞活力、增殖、遷移、侵襲和EMT受到抑制,本研究結(jié)果表明KYSE70細胞中FOXM1通過誘導M0巨噬細胞向M2巨噬細胞分化發(fā)揮促腫瘤作用。

KIF20A位于染色體5q31.2上,主要聚集在有絲分裂細胞紡錘體的中心區(qū),參與細胞有絲分裂過程〔19〕。研究發(fā)現(xiàn),KIF20A參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程,如KIF20A在大腸癌組織中表達上調(diào)。KIF20A在促進大腸癌細胞增殖和提高化療耐藥性方面起至關(guān)重要的作用〔20〕;KIF20A的高表達與前列腺癌不良預后有關(guān),靶向KIF20A可以抑制前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲,表明KIF20A可能是前列腺癌患者潛在的預后和治療靶點〔21〕;KIF20A還與腫瘤免疫浸潤密切相關(guān)。KIF20A與巨噬細胞浸潤呈強正相關(guān)〔22〕。研究顯示,KIF20A在食管癌組織中表達上調(diào),KIF20A的高表達是食管癌患者的不良預后因素〔23〕。KIF20A還與ESCC免疫浸潤密切相關(guān)〔6〕。本研究結(jié)果顯示,KYSE70細胞中FOXM1可介導KIF20A的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。KYSE70細胞中KIF20A表達上調(diào),過表達KYSE70細胞中KIF20A后,可促進M0巨噬細胞向M2巨噬細胞分化,促進巨噬細胞中IL-10和Arg1蛋白表達。KYSE70細胞和M0巨噬細胞共培養(yǎng)上清液si-NC+oe-KIF20A+TAM處理KYSE70細胞,可促進KYSE70細胞活力、增殖、遷移、侵襲和EMT。此外,過表達KIF20A可部分逆轉(zhuǎn)si-FOXM1+oe-NC+TAM對KYSE70細胞的作用。本研究結(jié)果表明,KYSE70細胞中FOXM1/ KIF20A軸通過誘導M0巨噬細胞向M2巨噬細胞分化發(fā)揮促腫瘤作用。

綜上,ESCC細胞中FOXM1通過上調(diào)KIF20A的表達誘導M0巨噬細胞向M2巨噬細胞分化,從而促進ESCC細胞增殖、遷移、侵襲和EMT。本研究結(jié)果為明確ESCC相關(guān)分子機制及開發(fā)新的ESCC治療靶點提供新的科學資料。