利用CRISPR/Cas9構(gòu)建敲除小鼠模型研究PPP2R3A基因?qū)π呐K功能的影響

李潔 崔曉花 梁媛 李小鳳 宋貴波

(1昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科,云南 昆明 650032;2云南省檢驗醫(yī)學(xué)重點實驗室;3云南省醫(yī)學(xué)檢驗臨床醫(yī)學(xué)研究中心)

蛋白磷酸酶(PP)2以前稱為 PP2A,是一種重要的絲氨酸(Ser)/蘇氨酸(Thr)蛋白磷酸酶。PP2調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和信號傳導(dǎo)中的各個磷酸化反應(yīng),因而在細(xì)胞增殖、分化、凋亡中起重要作用,并與腫瘤和神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生相關(guān)〔1〕。PP2全酶由一個65 kD的結(jié)構(gòu)亞基A(PR65)、一個36 kD的催化亞基C和一個調(diào)節(jié)亞基B組成。調(diào)節(jié)亞基B包括至少26種結(jié)構(gòu)與功能各不相同的成員,可分為4個家族:B(PR55)、B′(PR61)、B″(PR72/PR130)及B?(PR93/PR110)。PPP2R3A即蛋白磷酸2調(diào)節(jié)亞基B″家族α亞型(PP2A-B″α)〔2〕。

以上研究表明,PPP2R3A參與心臟的發(fā)育。PR72 和 PR130 是PPP2R3A的兩種不同轉(zhuǎn)錄本。同源性比對發(fā)現(xiàn)它們在人、小鼠、大鼠和斑馬魚中是高度保守的〔3〕。當(dāng)敲除PR130或PR72基因后,斑馬魚出現(xiàn)了心臟發(fā)育缺陷,表現(xiàn)為心肌細(xì)胞減少、心肌細(xì)胞凋亡增加、心室擴大和心臟功能下降(射血面積減少和射血分?jǐn)?shù)縮短)〔3,4〕PPP2R3A定位于心肌細(xì)胞的 Z 線和 M 線,并在缺血性心力衰竭患者心肌樣本中表達(dá)升高〔5〕。簡而言之,PPP2R3A缺失會影響心臟發(fā)育,導(dǎo)致心臟疾病的發(fā)生。然而,PPP2R3A參與心臟發(fā)育異常的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未完全清楚。大部分的蛋白都是和分子伴侶作用或是與其他蛋白質(zhì)形成復(fù)合物來表征其功能,而PPP2R3A也不例外。在前期研究中,本課題組已通過酵母雙雜交篩選出與PPP2R3A潛在作用的19種蛋白〔6〕,本研究擬以CRISPR/Cas9技術(shù)敲除C57BL/6小鼠中PPP2R3A基因,以揭示該基因及其互作蛋白在心臟發(fā)育中的影響,并為機制研究提供信息。

1 材料和方法

1.1C57BL/6-PPP2R3A小鼠模型的構(gòu)建 基因敲除小鼠(雄性3只和雌性2只)的構(gòu)建委托廣州賽業(yè)生物科技有限公司完成,簡述如下:根據(jù)Gebank上報道的小鼠PPP2R3A序列3號外顯子設(shè)計sgRNA靶向序列,并以此為依據(jù)合成一對引物(gRNA1:CCGGCTGGGGACTACTTGGAAGG,gRNA2: GATCTGTTCATGGTTACTGCAGG)進(jìn)行重組質(zhì)粒構(gòu)建。待體外轉(zhuǎn)錄為RNA后,與Cas9 mRNA一起原核顯微注射獲得測序鑒定陽性的F0代陽性小鼠;F0代陽性小鼠與野生型小鼠進(jìn)行交配,獲得聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和測序鑒定陽性的F1代雜合子鼠。

1.2敲除小鼠基因型鑒定 剪取出生1 w新生小鼠尾巴,加入消化液后進(jìn)行小鼠基因組DNA提取,具體提取方法按試劑盒說明書進(jìn)行。取1.5 μl基因組DNA進(jìn)行PCR和Sanger測序以鑒定小鼠基因型。鑒定后,基因PPP2R3A缺失型小鼠為KO組,野生型C57BL/6小鼠為WT組(雄性3只,雌性2只)。PCR引物跨越靶位點,序列為:PPP2R3A上游引物:5′-CATTCCCTAGAAACATGCTTACTGCC-3和PPP2R3A下游:5′-AACCTGTGCTTAACGCCAG AGC-3′。PCR條件為94 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃ 30 s,60 ℃ 35 s,72 ℃ 35 s,72 ℃ 5 min,共35個循環(huán)。測序引物為PCR下游。

1.3敲除小鼠的有效性驗證 蘇木素-伊紅(HE)染色:通過頸椎脫臼法處死小鼠,取出心臟并切成厚度約0.5 cm的組織塊,浸入4%多聚甲醛液中固定后依次放入由低到高濃度乙醇(50%、70%、80%、95%和100%)中逐漸脫去組織中的水分,再將組織塊置于二甲苯中透明后浸蠟包埋,隨后放入冰凍切片機箱內(nèi)切片,切片切出后利用該組織切片與載玻片的溫差立即貼片并烘干后進(jìn)行HE染色,光鏡下觀察。熒光定量PCR(qPCR):取心臟組織勻漿后提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄后以qPCR進(jìn)行PPP2R3A表達(dá)檢測。引物序列為PPP2R3A上游引物:5′-GACATCTTTGCGAAGGGACC-3′;下游:5′-GACTTCAG CCTCTTCTTAAACCG-3′;磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)部對照。Western印跡:將心臟組織放入RIPA緩沖液中冰上勻漿,4 ℃離心15 min以除去不溶性物質(zhì)。使用二喹啉甲酸(BCA)TM蛋白質(zhì)測定試劑盒對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量后放入-80 ℃冰箱中下凍存?zhèn)溆谩５鞍讟悠吠ㄟ^8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白,隨后轉(zhuǎn)移到0.45 μm的聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脫脂奶粉在Tris鹽酸緩沖液吐溫(TBST)中室溫封膜2 h。用稀釋的一抗(兔抗鼠PPP2R3A 1∶500稀釋)在4 ℃孵育膜過夜后添加二抗(羊抗兔IgG 1∶1 000稀釋),室溫孵育1.5 h后觀察蛋白。選用β-actin(1∶1 000稀釋)作為內(nèi)部對照。

1.4G蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控因子(RGS)19表達(dá)檢測 免疫組織化學(xué)染色(直接熒光法):心臟組織的石蠟切片常規(guī)脫蠟后用酶消化處理后水化,用0.01 mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)洗5 min,冷風(fēng)吹干,放入濕盒中滴加經(jīng)稀釋的熒光抗體(1∶2 000,PA5-23210),置于37 ℃孵育60 min,PBS沖洗后用50%甘油緩沖液封片,熒光顯微鏡下檢查。Western印跡:蛋白質(zhì)樣品通過SDS-PAGE分離,然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉1 h后,將膜與靶蛋白通過其特異性一抗和辣根過氧化物酶綴合的二抗進(jìn)行檢測。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行獨立樣本t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1CRISPR/Cas9微注射法成功建立PPP2R3A敲除小鼠模型 為了構(gòu)建PPP2R3A基因敲除小鼠模型,設(shè)計了靶向PPP2R3A序列3號外顯子翻譯起始密碼子的sgRNAs,并將sgRNA及Cas9 mRNA一起顯微注射到小鼠胚胎中;所選擇的小鼠系擁有一個113 bp的缺失突變,發(fā)現(xiàn)113 bp的差異足以區(qū)分WT組和KO組PCR產(chǎn)物。Sanger測序證實了基因PPP2R3A的敲除。見圖1～3。

圖1 生成KO小鼠的CRISPR/Cas9靶向策略:靶向位點用黑色箭頭表示

圖2 PPP2R3A WT和F1代雜合子KO小鼠的PCR基因分型

圖3 KO小鼠基因組 DNA的測序鑒定

2.2敲除小鼠心臟組織中PPP2R3A表達(dá)降低 從胚胎發(fā)育到成年,PPP2R3A在人類心臟中都有強烈表達(dá),這表明PPP2R3A可能在它們的成熟和功能中發(fā)揮重要作用。與WT組相比,KO組心臟組織中PPP2R3A mRNA及蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見表1、圖4。

表1 兩組RGS19蛋白相關(guān)表達(dá)、PPP2R3 mRNA及蛋白相對表達(dá)比較

圖4 Western印跡檢測兩組心臟組織中PPP2R3A、RGS19蛋白相對表達(dá)

2.3參與心臟發(fā)育的調(diào)節(jié)蛋白RGS19在心肌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào) 蛋白RGS19廣泛表達(dá)于正常的心肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi),呈均勻的棕褐色;但在PPP2R3A蛋白表達(dá)受損的心肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi),RGS19表達(dá)量增高,顏色變深,局部呈灶狀分布。與WT組相比,KO組心肌細(xì)胞RGS19蛋白水平顯著上調(diào)(P<0.05)。見表1、圖4、圖5。

圖5 兩組心臟組織及心肌細(xì)胞RGS19蛋白表達(dá)(×200)

2.4PPP2R3A敲除引起心臟組織病理變化 HE染色顯示,KO組心肌細(xì)胞肥大,排列紊亂,而WT組未見明顯變化。見圖5。表明在PPP2R3A敲除突變體中,PPP2R3A蛋白表達(dá)受損引起心臟組織病理學(xué)變化。

3 討 論

本研究觀察到敲除PPP2R3A后,小鼠心臟組織出現(xiàn)心肌細(xì)胞肥大,排列紊亂等形態(tài)學(xué)異常。心肌細(xì)胞這種病理改變可能是因為PPP2R3A基因的敲除可以抑制心肌細(xì)胞增殖并輕度增加心肌細(xì)胞的早期凋亡〔6〕。本研究還觀察到PPP2R3A缺失后,受損的心肌細(xì)胞內(nèi)RGS19表達(dá)上調(diào),與過表達(dá)RGS1轉(zhuǎn)基因小鼠觀察到的結(jié)果相似(室間隔缺損和室壁變薄)〔7〕。此外,有研究報道了RGS19可通過滅活Galpha(o)亞基,進(jìn)而抑制散亂蛋白(Dsh或Dvl)磷酸化、β-連環(huán)蛋白(catenin)聚集和Wnt應(yīng)答基因轉(zhuǎn)錄,從而阻斷小鼠F9畸胎瘤細(xì)胞中Wnt/β-catenin通路誘導(dǎo)的細(xì)胞分化〔8〕。表明RGS19影響心臟發(fā)育并對心臟功能產(chǎn)生負(fù)面影響。本課題組前期已成功構(gòu)建人心肌細(xì)胞cDNA文庫,通過酵母雙雜交篩選及陽性克隆鑒定、測序比對,發(fā)現(xiàn)PPP2R3A與參與調(diào)控心臟發(fā)育的Wnt信號通路靶向調(diào)節(jié)蛋白RGS19存在體外相互作用〔4〕。由此本文推測PPP2R3A可能通過RGS19調(diào)控Wnt通路影響心臟發(fā)育和功能,將來本研究會繼續(xù)闡明PPP2R3A與RGS19是如何通過Wnt/β-catenin 信號通路影響心臟發(fā)育和功能的機制,為心臟疾病的診療及心臟再生策略提供新的思路和方向。