火刃針對肩周炎家兔模型局部組織形態(tài)學和抗氧化能力及TGF-β1/Smad的影響

蘇婷 粟勝勇 蔡慧倩 王瓊瀟 謝彩云 王甜 黃琳 楊翔宇

(1廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,廣西 南寧 530022;2廣西中醫(yī)藥防治醫(yī)學分子生物重點實驗室)

肩周炎是中老年人常見的肌肉骨骼疾病,常在50歲左右多發(fā),其誘因為關(guān)節(jié)內(nèi)外逐漸粘連,以肩部疼痛和肩部運動障礙為主要特征,對患者的日常生活產(chǎn)生重大影響〔1〕。目前其具體發(fā)病機制尚不明,西醫(yī)認為該病的產(chǎn)生是組織退行性炎癥病變、慢性勞損等造成的肩周軟組織損傷,進而誘發(fā)無菌性炎癥反應(yīng),造成關(guān)節(jié)、組織粘連,引發(fā)疼痛、關(guān)節(jié)活動受限〔2〕?，F(xiàn)在臨床以保守治療為主,對肩周炎疾病的治療常采用消炎、封閉等西醫(yī)藥物口服或注射的方式治療,起到了短期內(nèi)減輕疼痛的效果〔3,4〕,但是長期藥物口服或注射應(yīng)用副作用較大,可能會導(dǎo)致嚴重的不良事件。隨著近年來計算機的廣泛使用和伏案工作者的增加,目前本病的發(fā)生率正逐漸升高〔5〕,因此,加強對本病的防治,尋找一種長期有效、安全且對老年人消耗小的治療方式是非常重要的。臨床上運用祖國醫(yī)學治療本病,較多采取針灸、拔罐、火針、刃針等治療方法,取得較好的臨床療效,但仍存在不能完全松解粘連及肩關(guān)節(jié)活動度受限等不足〔6〕?；鹑嗅樈Y(jié)合了火針“溫通”和刃針“松解”的作用,對肩周炎具有良好的鎮(zhèn)痛和松解粘連作用〔7〕,但其機制尚未清楚。本研究擬采用肩周炎兔動物模型,通過火刃針干預(yù),觀察肩關(guān)節(jié)組織形態(tài)學的影響,通過檢測氧化應(yīng)激反應(yīng)中抗氧化能力及轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子(Smad)含量,探索火刃針療法對肩周炎干預(yù)作用的可能機制,為火刃針臨床治療肩周炎提供方案和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組 5.0～5.5月齡雄性體健新西蘭兔32只,體質(zhì)量2 200～2 700 g,購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司,批號SCXK(湘)2019-0015,在廣西中醫(yī)藥防治醫(yī)學分子生物重點實驗室喂養(yǎng),飼養(yǎng)環(huán)境設(shè)置為恒溫26 ℃,相對濕度50%～75%。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后按照隨機數(shù)字表法隨機分為:空白組、模型組、藥物組和火刃針組4組,每組均8只。所有實驗程序中對動物處置遵守科技部《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。

1.2主要儀器及試劑 0.40 mm×40 mm一次性刃針數(shù)枚(馬鞍山邦德醫(yī)療器械有限公司),實驗兔臺,醫(yī)用無菌紗布(北京漢章),離心機(德國Eppendorf,型號:Centrifuge 5415D),光學顯微鏡(日本OLYMPUS,型號:BX43),石蠟切片機(德國萊卡,型號:RM2016),生物安全柜(廣州瑞智凈化設(shè)備有限公司,型號:SW.TFG-15),水平搖床(江蘇太倉市實驗設(shè)備廠,型號ZD-9556),組織攤片機(浙江省金華市華海有限公司,型號:TPJ-A)。

無水、95%乙醇(天津市永大化學試劑有限公司),蘇木素染色液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司),0.9%氯化鈉注射液(山東齊都藥業(yè)有限公司),10%水合氯醛溶液(北京雷根生物有限公司),10%甲醛溶液(南昌雨露實驗器材有限公司),復(fù)合碘消毒液(茂名市消毒用品廠有限公司),超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒(北京蘭杰柯科技有限公司),兔TGF-β1酶聯(lián)免疫分析試劑盒、兔Smad1酶聯(lián)免疫分析試劑盒(美國BioTek公司,型號:BioTek ELx800),美洛昔康片(寧夏康亞藥業(yè)有限公司)。

1.3造模方法 參考文獻〔8〕制備肩周炎家兔模型,除空白組外,余家兔取右肩部外側(cè)約 5 cm×5 cm面積剃毛備皮,將家兔保持俯臥位,予兔臺固定其雙側(cè)后肢及左側(cè)前肢,牽引家兔右前肢上臂,固定至水平搖床,頻率定于240次/min,振幅1.5 cm,家兔右肩關(guān)節(jié)持平行搖動,時間持續(xù)3 d(4 h/d,12∶00～16∶00),自制可容納適量冰塊的肩袖帶,于每次機械牽引搖動結(jié)束后,立即外敷于家兔右肩剃毛處,家兔置于兔盒固定,注意冰塊融化,及時更換冰塊,持續(xù)3 d(4 h/d,16∶01～20∶01)。建模3 d后,以右前肢出現(xiàn)“外翻”現(xiàn)象,行走時身體傾斜,右肩臂部運動受限,主動、被動運動時疼痛反應(yīng)明顯,局部軟組織可觸及輕度腫脹,可視及不同程度充血或部分瘀斑時,提示肩周炎家兔模型制備成功。

1.4處理方法 空白組:正常飼養(yǎng),不予造模及其他干預(yù)。模型組:適應(yīng)性飼養(yǎng),不予其他干預(yù),僅用作對照標準。藥物組:美洛昔康片0.4～0.6 mg/kg,每日1次,根據(jù)藥量制備相應(yīng)濃度藥物,灌胃方式給藥持續(xù)至實驗第33天?；鹑嗅樈M:在造模后給予火刃針干預(yù),操作如下:取肩髃、曲池穴(動物比較學方法定位),用龍膽紫在進針點處定位標記,將穴位皮膚毛發(fā)用刀片刮凈,常規(guī)消毒,選0.40 mm×40 mm一次性刃針數(shù)枚,一手持酒精燈,一手持刃針,將刃針針尖移至酒精燈火中,待針尖燒紅,迅速刺入,針尖透過筋節(jié)后迅速出針,每個治療點刺3～4次(每穴進行橫向、縱向松解各1次),出針加壓止血。每周治療3次,于造模后開始治療,共治療12次。

1.5取材 在干預(yù)治療結(jié)束后第33天開始取材,各組家兔用10%水合氯醛(3.5 ml/kg)進行耳緣靜脈注射麻醉,麻醉后,收集腹主動脈血4 ml,3 000 r/min離心20 min,提取上清液,將血清保存于-80 ℃冰箱。采血后用空氣栓塞法處死各組實驗兔,右側(cè)患肩迅速進行剝離脫皮,逐步取下肱二頭肌、 岡上肌、岡下肌及大圓肌,大小均約2 cm×2 cm,冰塊上放置肌肉組織,使用0.9%氯化鈉注射液洗滌,濾紙拭干后稱重,放入勻漿管中,按重量(g):體積(ml)=1∶9加入9倍體積勻漿介質(zhì)(pH7.4,0.01 mol/L Tris-HCl,1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)-2NA,0.01 mol/L 蔗糖),冰水浴條件下,即刻用眼科小剪剪碎組織塊,然后機器勻漿30 s,之后用離心機離心(2 500 r/15 min)。取上清,盡快低溫保存待測。取相同位置大小約2 cm×2 cm×0.3 cm的患側(cè)肱二頭肌肌腱、肩關(guān)節(jié)滑膜囊,組織塊置于冰塊上,冰冷生理鹽水水中漂洗,放入10%甲醛溶液固定,自來水沖洗24 h,脫水、透明、包埋、切片,常溫保存。

1.6HE染色 取組織常規(guī)石蠟包埋后切片(厚3～5 μm),二甲苯脫蠟、透明,無水乙醇中浸泡,洗脫出二甲苯,再置于95%乙醇中浸泡,使之水化,蘇木素染色、分化與反藍,伊紅染液5 min調(diào)色后進行梯度脫水,用二甲苯脫水后的組織切片透明,并使用中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察照相,分析。

1.7抗氧化能力相關(guān)檢測 SOD 活性測定采用黃嘌呤氧法;T-AOC 測定采用氧化劑還原法。

1.8TGF-β1/Smad檢測 兔TGF-β1水平、兔Smad1用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)雙抗體夾心法測定,按試劑盒說明書步驟操作。

1.9統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0軟件進行方差分析及LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組滑膜組織形態(tài)學比較 空白組:滑膜表層細胞一般為1層,皺襞處2～3層;深層結(jié)締組織疏松,基本未見毛細血管,無明顯炎細胞浸潤。模型組:滑膜組織增厚,表層細胞一般為2層,部分位置3～5層;毛細血管增多,中度炎細胞浸潤。藥物組:滑膜表層細胞一般為2～3層;深層結(jié)締組織疏松,有少量毛細血管,但數(shù)量比模型組減少,少量炎細胞浸潤?；鹑嗅樈M:滑膜表層細胞一般為1～2層;深層結(jié)締組織疏松,有少量毛細血管,但數(shù)量比模型組減少,無明顯炎細胞浸潤。見圖1。

圖1 各組滑膜組織形態(tài)(HE染色,×100)

2.2各組肌腱組織形態(tài)學比較 空白組:肌腱腱纖維排列整齊,結(jié)構(gòu)清晰;外膜被由一層上皮細胞組成的結(jié)締組織包裹,無炎細胞浸潤。模型組:整體組織結(jié)構(gòu)紊亂,腱纖維排列不整齊,斷裂;外膜被由5～6層上皮細胞組成的結(jié)締組織包裹,結(jié)締組織疏松,有少量炎細胞浸潤。藥物組:整體組織結(jié)構(gòu)略顯紊亂,腱纖維排列少量斷裂;外膜被由3～4層上皮細胞組成的結(jié)締組織包裹,結(jié)締組織疏松,偶見炎細胞浸潤?；鹑嗅樈M:整體組織結(jié)構(gòu)基本空白,腱纖維排列較整齊;外膜被由2層上皮細胞組成的結(jié)締組織包裹,結(jié)締組織較致密,未見炎細胞浸潤。見圖2。

圖2 各組肌腱組織(HE染色,×100)

2.3各組血清和肌肉 SOD含量 造模后,與空白組比較,模型組血清及各肌肉組織中SOD含量明顯降低(P<0.01)。與模型組比較,藥物組及火刃針組血清和各肌肉SOD含量有不同程度的升高,差異顯著(P<0.01)。火刃針組與藥物組血清和各肌肉組織SOD含量相比差異顯著(P<0.01)。見表1。

表1 各組血清和肌肉SOD水平比較

2.4各組血清和肌肉T-AOC含量 造模后,模型組血清及各肌肉組織中T-AOC含量較空白組顯著減少(P<0.01)。藥物組血清和肱二頭肌、岡上肌及大圓肌T-AOC含量與模型組相比差異顯著(P<0.05,P<0.01),藥物組岡下肌中T-AOC含量較模型組有升高趨勢,但無顯著性差異(P>0.05)?；鹑嗅樈M較模型組血清和各肌肉組織T-AOC含量明顯上升(P<0.01)。與藥物組相比,火刃針組血清、肱二頭肌、岡下肌及大圓肌T-AOC水平明顯升高(P<0.01)。見表2。

表2 各組血清和肌肉T-AOC水平比較

2.5各組血清和肌肉TGF-β1比較 造模后,與空白組相比,模型組血清和各肌肉組織中TGF-β1含量明顯增高(P<0.01)。藥物組及火刃針組血清和各肌肉組織的TGF-β1含量較模型組顯著降低(P<0.01)。與藥物組相比,火刃針組血清和各肌肉組織的TGF-β1含量差異顯著(P<0.01)。見表3。

表3 各組血清和肌肉組織TGF-β1水平比較

2.6各組血清和肌肉Smad1比較 造模后,與空白組相比,模型組血清及各肌肉組織Smad1含量明顯升高(P<0.01)。與空白組相比,藥物組及火刃針組血清和各肌肉組織Smad1含量明顯升高(P<0.05,P<0.01)。與模型組相比,火刃針組及藥物組血清和各肌肉組織Smad1含量均降低,有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與藥物組相比,火刃針組血清和肌肉Smad1含量有顯著差異(P<0.01)。見表4。

表4 各組血清和肌肉組織Smad1水平比較

3 討 論

肩周炎是以肩部疼痛及活動受限為主要癥狀的疾病。中醫(yī)認為肩周炎屬于“痹癥”的范疇,又稱“五十肩”“凍結(jié)肩”“漏肩風”等。多緣于人體的肝腎虧虛,肩部復(fù)感風寒濕邪侵襲,氣血不通,局部筋脈受阻,不通則痛或筋脈失養(yǎng)不榮則痛,最終形成本病〔9,10〕?；谏鲜龌A(chǔ),治療本病在于既要溫散寒濕,以祛除外邪,又要松解粘連,通暢氣血運行。張景岳云:“燔針,燒針也,劫刺因火氣而劫散寒邪也”。火針具有溫陽散寒,除濕,通絡(luò)止痛之效,以其無形之熱力激發(fā)人體正氣,通過刺絡(luò)放血還可達到“菀陳則除之”〔11〕。刃針作為刃與針的結(jié)合,在針刺刺激基礎(chǔ)上還具有切割的作用,可起到松解粘連,通絡(luò)止痛作用〔12〕?；疳樑c刃針都具有良好的鎮(zhèn)痛效果,而二者相結(jié)合可針對本病進行雙重作用的治療,火刃針療法是一種特色療法,是火針與刃針的結(jié)合,兼具“熱”與“松”之效〔13〕,較普通刃針具有溫通效應(yīng),對于單純火針多有切割松解作用〔14〕。選擇火刃針療法治療肩周炎可起到有效的鎮(zhèn)痛作用,能有效改善局部“不通則痛”的機體狀態(tài)。

研究發(fā)現(xiàn),肩周炎的發(fā)展進程與氧自由基密切相關(guān)〔15〕。正常情況下,生物體在氧化過程中產(chǎn)生多種自由基,自由基的出現(xiàn)與衰亡處平衡狀態(tài);而在病理進程中,自由基過度形成,就會對DNA、細胞膜、蛋白質(zhì)產(chǎn)生損害,也會對線粒體、脂類及細胞膜等造成影響,導(dǎo)致機體疾病的產(chǎn)生〔16〕。自由基在生命系統(tǒng)中起著雙重作用〔17〕:它們是有氧代謝的有毒副產(chǎn)物,會引起氧化損傷和組織功能障礙,并作為分子信號激活有益的應(yīng)激反應(yīng)。自由基也是人體生命活動中多種生化反應(yīng)的中間代謝產(chǎn)物,是許多疾病發(fā)生的根源。T-AOC和SOD是反映機體抗氧化系統(tǒng)能力的重要指標,T-AOC可檢測機體內(nèi)總體氧化應(yīng)激水平。SOD是在生理和病理條件下抵御氧化應(yīng)激的第一道防線,能催化清除機體代謝產(chǎn)生過量的超氧陰離子自由基,延緩由于自由基侵害而產(chǎn)生的機體衰退現(xiàn)象,提高人體對自由基損傷而誘發(fā)疾病的抵抗力〔18〕。

肩關(guān)節(jié)發(fā)生勞損,可引起局部炎性細胞浸潤,肌腱纖維受到破壞,導(dǎo)致軟組織粘連、纖維化等病理改變〔19〕。在肩周炎纖維化的病理過程中,TGF-β與疾病相聯(lián)系,TGF-β是一種分泌型同源蛋白,由單核細胞和淋巴細胞產(chǎn)生,調(diào)節(jié)眾多的細胞生長與分化,在骨組織和血小板中的含量最為豐富,直接參與成纖維細胞與巨噬細胞的集聚和增成,具有抵抗炎癥、加速患處恢復(fù)的作用,是一種發(fā)揮重要作用的細胞因子〔20〕。在TGF-β家族中,TGF-β1是纖維化與瘢痕形成病理過程中的關(guān)鍵性細胞因子,其主要參與膠原、蛋白多糖、纖維連接蛋白等的合成,在肩周炎纖維化與炎癥過程中發(fā)揮重要作用〔21〕,TGF-β1含量與肩周炎發(fā)病機制和治療轉(zhuǎn)歸情況密切相關(guān)。Smad是介導(dǎo)TGF-β1信號傳導(dǎo)的胞內(nèi)蛋白,Smad蛋白是TGF-β家族細胞信號從細胞膜轉(zhuǎn)導(dǎo)至細胞核過程中的關(guān)鍵調(diào)控分子〔22〕,Smad蛋白復(fù)合物的磷酸化受TGF-β1調(diào)節(jié),TGF-β1可有效改變細胞形態(tài)和其結(jié)構(gòu)功能,激活Smad1,影響炎癥,在促纖維化中起重要作用〔23〕。

綜上,火刃針療法對于肩周炎模型兔的治療作用顯著,其直接作用于病變組織,在松解粘連的基礎(chǔ)上,可通過增強機體的抗氧化能力及降低TGF-β1/Smad1含量發(fā)揮其治療作用,從而促進機體的恢復(fù),為臨床治療肩周炎提供了新思路新方法。