“手十二井穴”放血預(yù)處理對(duì)大鼠急性低氧肺組織損傷模型血?dú)?、HIF-1α及VEGF水平的影響

張義超 灑玉萍 武娟 趙協(xié)慧 沈慧萍 劉菲菲 陳發(fā)章 呂李飛 馬積和

(1青海大學(xué),青海 西寧 810001;2青海省中醫(yī)院)

氧氣(O2)作為機(jī)體新陳代謝的主要條件,為人體呼吸系統(tǒng)提供基本的能源支持。急性肺組織損傷(ALI)是由不同致病因素導(dǎo)致的肺組織急性損傷,低氧是導(dǎo)致機(jī)體ALI發(fā)生的誘因之一。ALI常出現(xiàn)低氧血癥性呼吸衰竭和急性呼吸窘迫綜合征〔1〕。井穴是特定穴中五腧穴之一,依據(jù)中醫(yī)標(biāo)本根結(jié)學(xué)說(shuō),井穴放血具有蘇竅醒神、瀉熱通絡(luò)等作用,可治療肺、腦等相關(guān)疾病〔2〕。在前期研究〔3〕基礎(chǔ)上,在西寧地區(qū)(2 261 m)海拔下模擬15%O2〔4〕的急性低氧條件,觀察井穴放血預(yù)處理對(duì)大鼠急性低氧肺組織損傷模型血?dú)庀嚓P(guān)指標(biāo)氧分壓(PaO2)、血氧飽和度(SaO2)、酸堿度(pH)、二氧化碳分壓(PaCO2)值和低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α蛋白表達(dá)及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)含量的影響,為急性低氧環(huán)境下應(yīng)用針灸防治ALI提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康成年雄性SD大鼠72只,SPF級(jí),體質(zhì)量(200±20)g,由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(陜)2018-001。適應(yīng)性喂養(yǎng)后,將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組8只、急性低氧(模型)組32只、井穴放血預(yù)處理(放血)組32只,其中模型組和放血組分成6、24、48、72 h不同時(shí)間段4個(gè)亞組,每組各8只。本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物處理方法嚴(yán)格按照國(guó)家科技部2006年發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》,符合國(guó)際動(dòng)物倫理法案的要求。

1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 手持式血?dú)夥治鰞x(i-STAT?1,美國(guó)雅培),血?dú)馍囗?xiàng)測(cè)試卡片(G3+,美國(guó)雅培),二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0010,碧云天生物工程有限公司),電泳儀(基礎(chǔ)型,BIO RAD),低溫高速離心機(jī)(MIKRO 220R,Hettich),恒溫孵育箱(DNP9082,精宏),轉(zhuǎn)移電泳槽(VE 186,上海天能科技有限公司),熒光化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(ChemiQ4600,上海勤翔儀器),酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(E-EL-R2603c,伊萊瑞特),全自動(dòng)常壓動(dòng)物低氧缺氧裝置艙(ZKY-4F,杭州艾普),離心機(jī)(H1650-W,湖南湘儀),電熱恒溫培養(yǎng)箱(ICV-450,日本ASONE),多功能酶標(biāo)儀(Flexstation3,Molecular Devices)。

1.3干預(yù)方法 放血組:使用改良后的采血針點(diǎn)刺大鼠雙前肢十二井穴進(jìn)行放血預(yù)處理。借鑒人體解剖學(xué)的穴位,將比較解剖學(xué)用于井穴的選取,將放血組固定于自制鼠板上,先左前肢后右前肢,從“大指”至“小指”,依次按“少商”“商陽(yáng)”“中沖”“關(guān)沖”“少?zèng)_”“少澤”的順序進(jìn)行針刺,每天1次,每穴出血量以1滴血(約10 μl)為度。模型組與對(duì)照組:每日均給予與放血組相同方式抓取1次,但無(wú)放血干預(yù)。各組按上述干預(yù)方式給予相應(yīng)處理,期間動(dòng)物自由進(jìn)水飲食。

1.4模型建立 干預(yù)結(jié)束后,將模型組和放血組大鼠置于15%O2(15%O2,85%N2)的低氧模擬艙中(參照劉瑞欣等〔4〕造模方法改良)以制備急性低氧肺組織損傷模型〔設(shè)置艙內(nèi)條件:氧濃度(15.0±0.2)%,溫度(22±2)℃,濕度50%～60%;艙內(nèi)放置適量無(wú)水氯化鈣及鈉石灰以吸收二氧化碳及水分〕。大鼠入艙后,艙內(nèi)氧濃度在15 min內(nèi)勻速由21%降至(15.0±0.2)%。在艙內(nèi)暴露相應(yīng)時(shí)間(6、24、48、72 h)后出艙,根據(jù)肺組織損傷程度判定模型建立是否成功。

1.5觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法 取材:模型組和放血組于相應(yīng)時(shí)間段(6、24、48、72 h)出艙后,立刻給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉,腹主動(dòng)脈取血,取血結(jié)束后,快速剖開(kāi)胸腔,分離肺組織,于冰臺(tái)上小心剔除肺外組織,取右側(cè)肺組織置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?duì)照組按上述方法于第8天取材。

1.6手持式血?dú)夥治鰞x方法檢測(cè)動(dòng)脈血血?dú)庵笜?biāo) 各組腹主動(dòng)脈采血,使用即刻采出的動(dòng)脈血0.3 ml,排除空氣,棄去前1滴血,將其注入提前平衡至室溫的血?dú)馍囗?xiàng)測(cè)試卡片血液注樣口中,注入的血量至標(biāo)志處,按壓鎖蓋,將測(cè)試卡片放入手持式血?dú)夥治鰞x,輸入大鼠編號(hào),2 min后讀取血?dú)夥治鲋?記錄界面顯示的PaO2、SaO2、pH、PaCO2值。

1.7Western印跡法測(cè)肺組織HIF-1α表達(dá) 從以上樣本中各組隨機(jī)抽取3例凍存于-80 ℃的肺組織,檢測(cè)HIF-1α含量。按比例加入RIPA裂解液(放射免疫沉淀法裂解緩沖液),充分裂解后,-4 ℃、12 000 r/min離心5 min,取上清。使用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,計(jì)算上樣量,上樣后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),80 V恒壓電泳至分離膠頂端,然后120 V恒壓電泳至溴酚藍(lán)剛出膠底。順序放置海綿、濾紙、膠、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、濾紙、海綿于轉(zhuǎn)膜夾中,放入轉(zhuǎn)膜槽,200 mA冰上轉(zhuǎn)膜2.5 h。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,分別加入稀釋好的一抗〔抗HIF-1α、抗磷酸甘油醛脫氧酶(GAPDH)〕、辣根過(guò)氧化物酶二抗,加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)液后,將膜放入熒光化學(xué)發(fā)光成像儀曝光,得到HIF-1α蛋白條帶。

1.8ELISA法檢測(cè)血漿VEGF表達(dá) 大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后,腹主動(dòng)脈采血,3 000 r/min離心15 min后,取上清,嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行后續(xù)操作。得到各樣本光密度(OD)值后,通過(guò)測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到各樣本VEGF濃度。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及LSD-t法,方差不齊時(shí)采用Welch檢驗(yàn),兩兩比較選用TamhaneT2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1動(dòng)脈血PaO2值變化 與對(duì)照組相比,模型組各時(shí)段PaO2均明顯下降(P<0.01)。與同時(shí)間段模型組相比,放血組有升高趨勢(shì),在6、48 h時(shí)兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),但放血組各時(shí)段PaO2值仍明顯低于對(duì)照組(P<0.05,P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組動(dòng)脈血PaO2、SaO2、pH值、PaCO2及肺組織HIF-1α、血漿VEGF比較

2.2動(dòng)脈血SaO2值變化 與對(duì)照組相比,模型組各時(shí)段SaO2值均明顯下降(P<0.01)。與同時(shí)間段模型組相比,放血組6、24、48 h時(shí)SaO2值明顯升高(P<0.05,P<0.01);但放血組SaO2仍低于對(duì)照組,在6、24 h時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.3動(dòng)脈血pH值變化 與對(duì)照組比較,模型組各時(shí)段pH值有降低趨勢(shì),6、72 h時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),放血組6 h時(shí)pH值顯著降低(P<0.01),其余各時(shí)段未見(jiàn)明顯變化(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.4動(dòng)脈血PaCO2值變化 與對(duì)照組相比,模型組48、72 h時(shí)PaCO2明顯下降,放血組24、48、72 h時(shí)PaCO2明顯降低(P<0.05,P<0.01)。與同時(shí)間段模型組相比,放血組24、48 h時(shí)PaCO2顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.5各組肺組織HIF-1α蛋白表達(dá) 與對(duì)照組相比,模型組各時(shí)段HIF-1α表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)。與同時(shí)間段模型組相比,放血組各時(shí)段HIF-1α蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05,P<0.01),但放血組仍高于對(duì)照組,在6、48、72 h時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。見(jiàn)表1、圖1。

1～9:對(duì)照組、6 h模型、放血組、24 h模型、放血組、48 h模型、放血組、72 h模型、放血組

2.6各組血漿VEGF含量變化 與對(duì)照組相比,模型組及放血組各時(shí)間段VEGF含量明顯升高(P<0.05,P<0.01)。與同時(shí)間段模型組相比,放血組各時(shí)段VEGF含量下降,在24、48、72 h時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。見(jiàn)表1。

3 討 論

低氧是高原環(huán)境中影響生命活動(dòng)的主要因素,西寧地區(qū)平均海拔已處于2 261 m,依據(jù)含氧量屬于低氧地區(qū)。人體急速進(jìn)入低氧環(huán)境時(shí),器官組織受到不同程度的損傷,肺作為人體通氣的門戶,是氣體交換的場(chǎng)所,肺部?jī)?nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)最多、毛細(xì)血管網(wǎng)數(shù)量最大,急性低氧環(huán)境損傷肺泡上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞,具體損傷程度主要取決于海拔高度和機(jī)體對(duì)低氧環(huán)境的適應(yīng)。

當(dāng)前ALI病死率較高,為29%～42%〔5〕,在發(fā)生ALI情況下,肺泡-毛細(xì)血管壁受到損傷,氣血屏障的通透性升高,炎性細(xì)胞等滲入肺泡,引起肺泡上皮功能障礙,肺泡液體轉(zhuǎn)運(yùn)受阻〔6〕,誘導(dǎo)肺水腫的發(fā)生,進(jìn)而肺泡和毛細(xì)血管的氣體交換減少,造成低氧性呼吸衰竭和急性呼吸窘迫綜合征〔7,8〕。此外,ALI發(fā)生時(shí),肺血管收縮,肺動(dòng)脈壓力升高,易形成肺動(dòng)脈高壓(PH)。目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道ALI的病因復(fù)雜多樣,有研究表明,ALI的發(fā)生與急性低氧環(huán)境、炎癥反應(yīng)失衡、細(xì)胞凋亡、氧化還原失衡、水通道蛋白、凝血與纖溶及遺傳基因等密切相關(guān)〔9〕。

井穴放血以中醫(yī)經(jīng)絡(luò)學(xué)說(shuō)和氣血津液學(xué)說(shuō)為理論基礎(chǔ),經(jīng)絡(luò)和氣血津液是人體活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ),也是疾病轉(zhuǎn)歸的介質(zhì)和渠道。放血療法是獨(dú)具特色的中醫(yī)外治療法,當(dāng)經(jīng)絡(luò)或氣血運(yùn)行不暢時(shí),會(huì)影響臟腑正常生理功能,人體絡(luò)脈的色澤、粗細(xì)等表現(xiàn)異常,此時(shí)刺絡(luò)放血能夠祛除舊血產(chǎn)生新血,臟腑得新血滋養(yǎng),功能復(fù)?！?0〕。井穴是人體經(jīng)脈陰陽(yáng)交匯的場(chǎng)所,可謂小刺激導(dǎo)致大反應(yīng)〔11〕。手十二井穴在雙手指端,擁有豐富的毛細(xì)血管網(wǎng)和神經(jīng)末梢,指端分布量較之于軀干神經(jīng)纖維有數(shù)倍之多,放血刺激強(qiáng)度較大〔12〕;可通過(guò)井穴刺激來(lái)影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的交感神經(jīng)和局部血管壁上的自主神經(jīng),起到調(diào)控血管壁張力的作用〔13〕。井穴放血可連通十二經(jīng)之氣,通絡(luò)祛瘀、激發(fā)陽(yáng)氣、改善血運(yùn)、瀉熱消腫,在健腦啟智、調(diào)節(jié)機(jī)體平衡、改善自主神經(jīng)等方面具有獨(dú)特作用〔14〕。另外,對(duì)肺臟急性病癥有明顯療效〔15〕。

血?dú)饽軌蛑苯臃从撤闻K的換氣功能和酸堿平衡狀態(tài),可用來(lái)判斷是否缺氧及缺氧程度。本研究結(jié)果表明,放血預(yù)處理可升高氧分壓,進(jìn)而升高血氧飽和度,對(duì)PaO2、SaO2有積極的調(diào)節(jié)作用,但隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng),針刺對(duì)其干預(yù)效應(yīng)逐漸減緩,放血對(duì)pH值有一定調(diào)節(jié)作用。井穴放血預(yù)處理可在一定程度和時(shí)間上升高動(dòng)脈血中溶解氧氣分子量和血紅蛋白結(jié)合氧含量,對(duì)保持酸堿度平衡有一定積極意義,對(duì)低氧引起的ALI模型大鼠血?dú)庀嚓P(guān)指標(biāo)有積極影響,有利于機(jī)體適應(yīng)急性低氧環(huán)境。

HIF-1是介導(dǎo)人體組織、器官與細(xì)胞產(chǎn)生缺氧耐受的上游調(diào)控因子,參與細(xì)胞水平引起的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制〔16〕,廣泛表達(dá)于肺、心、腦等組織器官〔17〕。HIF-1是由α和β亞基組成的異二聚體,氧氣不影響HIF-1β表達(dá),而HIF-1α表達(dá)受低氧誘導(dǎo)且低氧條件下保持穩(wěn)定,在常氧環(huán)境下將迅速降解〔18〕,它是人體保持氧平衡最重要的氧調(diào)節(jié)蛋白,細(xì)胞中HIF-1α更多介導(dǎo)了急性快速的缺氧過(guò)程,且隨著時(shí)間的增加而被逐步降解,在多種缺血缺氧性及炎性疾病的病程中發(fā)揮作用。HIF-1α可以誘導(dǎo)血管收縮物質(zhì)如內(nèi)皮素1和一氧化氮合酶等來(lái)增多血流,減輕缺血的損傷〔19〕,通過(guò)激活與缺氧相關(guān)血管生成和線粒體代謝的基因來(lái)維持氧穩(wěn)態(tài),使機(jī)體耐受低氧環(huán)境。VEGF是HIF-1α的下游調(diào)控產(chǎn)物,受低氧誘導(dǎo)VEGF表達(dá)增加,VEGF與血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合,進(jìn)而增加毛細(xì)血管通透性,誘導(dǎo)肺水腫形成。VEGF可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的擴(kuò)張、增殖與遷移,新血管生成增多,出現(xiàn)血管狹窄閉塞等肺血管重構(gòu)現(xiàn)象,增加肺血管通透性誘導(dǎo)ALI大鼠產(chǎn)生肺水腫〔20〕,最終導(dǎo)致低氧性PH(HPH)形成〔21〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,隨急性低氧時(shí)間延長(zhǎng),機(jī)體對(duì)低氧環(huán)境出現(xiàn)了一定的適應(yīng),且手十二井穴放血預(yù)處理對(duì)15%O2急性低氧引起的大鼠肺組織損傷模型的缺氧情況有一定改善作用。

綜上,“手十二井穴”放血預(yù)處理在一定時(shí)間和程度上可改善大鼠15%O2急性低氧肺組織損傷模型的缺氧情況,有利于模型大鼠適應(yīng)急性低氧環(huán)境,其可能的作用與升高動(dòng)脈血PaO2、SaO2及下調(diào)HIF-1α表達(dá)、降低VEGF含量有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)手十二井穴放血預(yù)處理療法凸顯了《黃帝內(nèi)經(jīng)》中關(guān)于未病先防的理念,為“病在臟者取之井”(《靈樞·順氣一日分為四時(shí)》)理論提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),也為針灸臨床防治急性低氧肺損傷提供實(shí)驗(yàn)參考。