PPARγ低表達(dá)對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞肥大的影響

賴玲 繆林煜 廖偉

(1贛州市人民醫(yī)院,江西 贛州 341000;2贛南醫(yī)科大學(xué))

心血管疾病是全球發(fā)病率和死亡率的主要因素,也是許多慢性病的共同終點(diǎn),而心肌肥厚是心力衰竭的一個(gè)主要病因。心肌肥厚有生理性和病理性兩種類型。心肌肥大最初發(fā)展為對(duì)生理和病理刺激的適應(yīng)性反應(yīng),但病理性心肌肥大通常進(jìn)展為心力衰竭。每種形式的肥大都受到不同細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。目前,心肌細(xì)胞肥大(MCR)調(diào)控機(jī)制有脂肪代謝、膠原蛋白合成、增殖信號(hào)通路、轉(zhuǎn)錄因子。過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)γ是過氧化物酶體增殖物配體激活后調(diào)節(jié)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子之一。PPAR是心臟的生理主開關(guān),指導(dǎo)心肌細(xì)胞的心臟能量代謝,從而影響心力衰竭、心肌肥厚。本研究旨在探討PPARγ低表達(dá)對(duì)血管緊張素(Ang)Ⅱ誘導(dǎo)的H9c2 MCR的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要材料、試劑 大鼠心肌細(xì)胞株H9c2購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫;AD-PPARγRNAi腺病毒購于上海吉?jiǎng)P基因;PPARγ、肌球蛋白重鏈(MYH)7B、心鈉肽(ANP)抗體購于Abcam 公司;抗小鼠IgG-辣根過氧化物酶(HRP)、抗兔IgG-HRP二抗購自Abclonal公司;β-actin 小鼠單克隆抗體購自中山金橋公司;AngⅡ購自Abcam 公司;胎牛血清購自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司;DMEM、胰酶、磷酸鹽緩沖液(PBS)、二甲基亞砜(DMSO)、RIPA 裂解液購自索萊寶公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自碧云天;超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Thermo公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞,隔天換液1次,待細(xì)胞長至約占培養(yǎng)皿90%時(shí),用PBS 沖洗2遍,加數(shù)滴25%胰酶,消化1～2 min,加含血清培養(yǎng)液終止消化,用槍頭輕輕吹打使細(xì)胞脫落,離心、重懸后按1∶3比例接種到新的培養(yǎng)皿中。

1.3構(gòu)建MCR模型 把需要用的實(shí)驗(yàn)材料及試劑放于細(xì)胞房無菌超凈臺(tái)桌面上打開紫外燈,消毒30 min。在超凈工作臺(tái)將舊培養(yǎng)基倒入廢棄桶,PBS洗滌2次,然后用移液管吸干剩余的培養(yǎng)溶液。最后加入新配濃度為10-7mol/L的AngⅡ培養(yǎng)基,做好標(biāo)記,繼續(xù)放入孵箱培養(yǎng)至48 h。

1.4細(xì)胞分組 采用AD-PPARγRNAi重組腺病毒載體,感染到H9c2心肌細(xì)胞中。最終分為對(duì)照組、Vehicle組、AD-PPARγRNAi組;MCR組、MCR+Vehicle組、MCR+AD-PPARγRNAi組6組。

1.5AD-PPARγRNAi感染H9c2細(xì)胞 在病毒房細(xì)胞超凈臺(tái)內(nèi),準(zhǔn)備好細(xì)胞換液的實(shí)驗(yàn)用品,打開紫外線照射30 min,同時(shí)打開病毒房紫外線照射30 min。將細(xì)胞板中的液體倒入臺(tái)面上的廢棄桶,同時(shí)加入5 ml PBS,稍微搖晃幾下,將液體倒入臺(tái)面上的廢棄桶,PBS洗滌2次。將計(jì)劃好的病毒液體與培養(yǎng)液混勻后分別加入到Vehicle組、AD-PPARγRNAi組、MCR+Vehicle組、MCR+AD-PPARγRNAi組的細(xì)胞板內(nèi),做好標(biāo)記,放置孵箱最底層,培養(yǎng)2 h后,再次增加5 ml培養(yǎng)液。培養(yǎng)12 h后,將含病毒液培養(yǎng)的 H9c2細(xì)胞從孵箱中取出,將細(xì)胞在病毒室的潔凈室中更換,并繼續(xù)在培養(yǎng)箱中放置48 h。

1.6H9c2細(xì)胞蘇木素-伊紅(HE)染色 (1)細(xì)胞狀態(tài)達(dá)90%左右時(shí)可進(jìn)行HE染色。6組均需要PBS洗滌2次;取出儲(chǔ)存在4 ℃冰箱中的4%多聚甲醛,均勻加入細(xì)胞中固定10 min。PBS洗滌3～5次,將移液槍吸取殘留余PBS并干燥,均勻加入蘇木素染液浸染8 min,分別加入二蒸水浸洗數(shù)遍,控干水分。加入分化液分色數(shù)秒,再藍(lán)化H9c2細(xì)胞的核通過用準(zhǔn)備好的涼水(100 ℃水放涼后)。用移液管吸取伊紅染液在細(xì)胞板內(nèi),5 min,在水龍頭下直接沖洗。最后脫色透明后在鏡下觀察拍照,每組重復(fù)3次。

1.7Western印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)

1.7.1細(xì)胞蛋白提取 (1)配制細(xì)胞裂解液:計(jì)算好需要的量并預(yù)先冷卻RIPA 裂解液,PMSF按100∶1比例準(zhǔn)備,將其放在渦流振蕩器上并充分混合,放在冰上或保存在4 ℃的冰箱中。(2)將細(xì)胞板中的液體倒入廢棄桶,同時(shí)加入5 ml PBS,稍微搖晃幾下,將液體倒入廢棄桶,重復(fù)再洗1次后,分別用大、中、小移液槍反復(fù)將剩余液體吸干凈,盡量去除剩余液體。(3)用移液槍吸取300～400 μl預(yù)冷后的細(xì)胞裂解液均勻滴加在培養(yǎng)皿中,放入4 ℃冰箱或冰上,5 min后輕輕搖晃使裂解液盡量覆蓋細(xì)胞上,繼續(xù)裂解5 min。(4)首先把細(xì)胞板放在冰上,接著用消毒后的細(xì)胞刮在細(xì)胞板上將H9c2細(xì)胞全部刮下至細(xì)胞板面光滑為止,最后將液體轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)。(5)將含有細(xì)胞液的離心管用透明薄膜密封,置于4 ℃離心機(jī)中,以12 000 r/min離心15 min,最后保留上清液用于標(biāo)記。(6)再將含蛋白質(zhì)且標(biāo)記好的EP管封口處理后存放在-20 ℃冰箱,不要反復(fù)凍融。

1.7.2蛋白濃度測(cè)定 (1)配制工作液:計(jì)算好需要的工作液,按混合試劑A與試劑B為50∶1比例配制,放于旋渦振蕩器上充分混勻后,將其放置冰上或4 ℃冰箱保存待用。(2)從-20 ℃冰箱內(nèi)取出BSA標(biāo)準(zhǔn)液室溫下溶解,配制標(biāo)準(zhǔn)品蛋白溶液:吸取20 μl BSA至EP管,再加入30 μl ddH2O,混勻,從中取出25 μl連續(xù)倍比稀釋,標(biāo)準(zhǔn)濃度為:0、25、50、100、200、400、800、1 600 μg/ml,在96孔板中向每個(gè)孔中加入25 μl。(3)待測(cè)樣品處理:取每組樣品用三蒸水分別稀釋成0、1、5、10、20倍,依次加入25 μl至96孔板中。(4)將配好的BCA工作液分別加入200 μl至標(biāo)準(zhǔn)蛋白液孔中及待測(cè)樣品空中,輕柔混勻,放于37 ℃恒溫箱,30 min。(5)提前打開酶標(biāo)儀,預(yù)熱。將96孔板放置在酶標(biāo)儀的指定位置,設(shè)置A562 nm的波長,運(yùn)行程序,記錄光密度(OD)值,并根據(jù)每個(gè)孔測(cè)量的數(shù)據(jù)獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線,從而計(jì)算樣品上樣量。

1.7.3電泳分離 (1)洗干凈配膠板同時(shí)用ddH2O沖洗,并固定在配膠固定架上,用橡膠板注入ddH2O泄漏檢測(cè)5 min,并去除板表面之間的 ddH2O備用。(2)接著按照表1分別配制12%、10%、8%的分離膠。(3)放在振蕩器上混勻后,用大移液槍迅速將液體加入玻璃板間隙內(nèi),操作過程中注意不要產(chǎn)生氣泡,接著加入1.5 ml異丙醇排除氣泡在室溫下放置50 min,倒掉異丙醇同時(shí)用ddH2O洗干凈,并用濾紙吸干凈。(4)配制5%聚成膠:其中ddH2O 3.4 ml,30% Acr-Bic 0.83 ml,Tris.HCl(pH6.8),0.63 ml 10%SDS 0.05 ml,10%AP 0.05 ml,TEMED 0.005 ml。(5)放在振蕩器上混勻后,用大移液槍迅速將液體加入玻璃板間隙內(nèi)操作過程中注意不要產(chǎn)生氣泡,同時(shí)將晾干的梳子快速的插入,室溫條件下放置45 min左右。(6)上樣:根據(jù)BCA法蛋白定量結(jié)果及實(shí)驗(yàn)分組調(diào)整進(jìn)樣量以使每個(gè)泳道蛋白上樣量一致。用進(jìn)樣針吸取相應(yīng)體積的蛋白緩慢注入泳道內(nèi),并在兩側(cè)分別注入3～5 μl蛋白Marker。(7)電泳槽被固定好后,并注入現(xiàn)配好的1倍電泳緩沖液,插好電泳儀電源,設(shè)置90 V恒壓30 min條件,當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)分離層時(shí),將其調(diào)到120 V恒壓,且電泳持續(xù)60 min至溴酚藍(lán)到底部。

表1 分離膠配制

1.7.4蛋白的膜轉(zhuǎn)移、顯色、檢測(cè) (1)濕轉(zhuǎn):從電泳槽中取出膠板,按蛋白分子量大小,參照蛋白分子 marker,用刀片切下相應(yīng)的膠塊,浸泡在預(yù)冷的1倍濕轉(zhuǎn)緩沖液中,將聚偏氟乙烯(PVDF)膜在甲醇中電離1 min,制備膜夾。按照“黑膠白膜”的原則放入切好的膠塊及 PVDF膜,排盡膜與膠之間的氣體,堵住濕轉(zhuǎn)移夾,蓋住電轉(zhuǎn)移裝置,調(diào)好濕轉(zhuǎn)移條件,四周放入冰水及冰袋。(2)封閉:從濕轉(zhuǎn)移裝置中取出PVDF膜,輕輕沖洗TTBS并置于現(xiàn)成的5%脫脂乳中,在室溫下封閉2 h。(3)一抗孵育:從封閉溶液中取出PVDF膜,輕輕沖洗TTBS以除去殘留的封閉溶液,然后置于相應(yīng)的一抗中,并在4 ℃溫育過夜。(4)二抗孵育:第2天,取出PVDF膜,漂洗TIBS 10 min×4(根據(jù)暴露背景適當(dāng)調(diào)整特定的漂洗時(shí)間),根據(jù)初級(jí)來源選擇二級(jí)抗體。(5)曝光:二抗中取出PVDF膜后,TTBS漂洗10 min×5(具體漂洗時(shí)間根據(jù)曝光背景做出適當(dāng)調(diào)整),吸干PVDF膜上殘留TBS,將ECL試劑盒中A與B溶液以1∶1比列混勻后,把PVDF膜放在混合液中,最后曝光成像同時(shí)保存圖片。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1H9c2細(xì)胞模型的構(gòu)建 HE染色結(jié)果顯示,MCR組與對(duì)照組比較,H9c2細(xì)胞核形態(tài)大小變大,見圖1。Western 印跡結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較,MCR組MYH7B、ANP的表達(dá)顯著增加(P<0.05),表明MCR模型構(gòu)建成功。見圖2、表2。

圖1 HE染色H9c2細(xì)胞(×200)

1～6:對(duì)照組、Vehicle組、AD-PPARγRNA組、MCR組、MCR+Vehicle組、MCR+AD-PPARγRNAi組

表2 AD-PPARγRNAi感染H9c2細(xì)胞PPARγ、MYH7B、ANP的相對(duì)表達(dá)量

2.2各組PPARγ低表達(dá)比較 AD-PPARγRNAi組較對(duì)照組和Vehicle組PPARγ表達(dá)明顯降低(P<0.05);MCR+AD-PPARγRNAi組較MCR和MCR+Vehicle組明顯降低(P<0.05),見表2。

2.3空白對(duì)照與病毒對(duì)照比較 HE染色結(jié)果顯示,Vehicle組較對(duì)照組H9c2細(xì)胞核形態(tài)大小無明顯變化,MCR+Vehicle組與MCR組比較H9c2細(xì)胞核形態(tài)大小無明顯變化;Vehicle組與對(duì)照組比較、MCR+Vehicle組與MCR組比較PPARγ、MYH7B、ANP表達(dá)均無明顯差異(P>0.05),見圖1、圖2、表2。

2.4AD-PPARγRNAi感染H9c2細(xì)胞MYH7B、ANP的相對(duì)表達(dá)情況比較 Western印跡條帶分析顯示,與對(duì)照組比較,AD-PPARγRNAi組MYH7B、ANP表達(dá)明顯增加(P<0.05);與MCR組比較,MCR+AD-PPARγRNAi組MYH7B、ANP表達(dá)明顯增加(P<0.05),見表2。

3 討 論

心肌肥厚是導(dǎo)致心力衰竭的一個(gè)重要病因,也會(huì)導(dǎo)致心臟疾病患者死亡。病理性心肌肥大除了細(xì)胞生長和蛋白質(zhì)合成外,心肌肥大會(huì)變成適應(yīng)不良的失代償:細(xì)胞死亡、纖維化、Ca2+處理蛋白失調(diào)、線粒體功能障礙、代謝重塑、胎兒基因表達(dá)重新激活、蛋白質(zhì)和線粒體調(diào)控受損、肌節(jié)結(jié)構(gòu)改變和血管生成不足。誘導(dǎo)這些反應(yīng)的信號(hào)機(jī)制促進(jìn)了適應(yīng)不良的心臟重塑和功能障礙,并最終導(dǎo)致心力衰竭。因此,伴隨上述反應(yīng)的心肌肥大通常被認(rèn)為是病理性的。抑制心肌肥大的信號(hào)通路在治療上可能存在重要作用。高血壓和心肌梗死等病理狀況主要通過神經(jīng)內(nèi)分泌激素和機(jī)械力促進(jìn)病理性肥大,并伴有與生理性肥大不同的信號(hào)通路。

心臟代謝在生理和病理性心肌肥大中受到不同調(diào)節(jié)〔1〕。全身及心臟代謝的變化在心力衰竭發(fā)展之前〔2,3〕。心肌肥大反應(yīng)過程中能量代謝的適應(yīng)受損加劇病理性心肌肥大,增加心肌細(xì)胞死亡。ATP產(chǎn)生的過程直接改變收縮功能并導(dǎo)致心力衰竭〔4,5〕。在心肌肥大過程中,雌激素受體相關(guān)受體(ERR)α與過氧化物酶體增殖物激活受體-γ共激活因子(PGC)1α相互作用,通過增加編碼參與三羧酸(TCA)循環(huán)的蛋白質(zhì)基因表達(dá)來激活線粒體能量代謝和氧化磷酸化。盡管編碼ERRα的基因缺失不會(huì)影響TAC誘導(dǎo)心肌肥大的最初發(fā)展,但ERRα缺乏會(huì)促進(jìn)向心力衰竭的轉(zhuǎn)變〔6〕。編碼清道夫受體基因的心臟特異性CD36缺失,將減少心臟中脂肪酸的攝取和利用,加劇壓力超負(fù)荷引起的心功能不全和心力衰竭,但不影響心肌肥大程度〔7〕。以上表明適當(dāng)?shù)拇x作用將適應(yīng)病理性心肌肥大維持收縮功能。編碼胰島素受體基因的心臟特異性缺失通過損害脂肪酸和丙酮酸代謝及 TCA 來促進(jìn)線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激和收縮功能障礙〔8〕。因此,誘導(dǎo)生理性心肌肥大的信號(hào)機(jī)制可能協(xié)調(diào)線粒體的代謝來維持心臟功能。改變的代謝物也會(huì)促進(jìn)病理性心肌肥大或心力衰竭?；蚬こ绦∈竽Ｐ椭兄舅峄蛱妓衔锎x失調(diào)直接誘導(dǎo)心肌肥大或通過調(diào)節(jié)病理性心肌肥大的信號(hào)機(jī)制導(dǎo)致功能下降〔9～14〕。

PPAR是一類配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子在脂質(zhì)和脂蛋白代謝、葡萄糖平衡中的作用代謝、細(xì)胞增殖、分化和凋亡中發(fā)揮重要作用。根據(jù)專業(yè)結(jié)構(gòu),PPARs可分為3個(gè)亞組:PPARα〔也稱為核受體亞家族 1 組 C 成員(NR1C)1〕、PPARδ(也稱為 PPARβ 或 NR1C2)和 PPARγ(也稱為 NR1C3)。最初發(fā)現(xiàn),PPARγ主要是在脂肪細(xì)胞中調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的分化而脂質(zhì)代謝和提高胰島素敏感性,故與高血壓、肥胖、動(dòng)脈粥樣硬化、Ⅱ型糖尿病、胰島素抵抗密切相關(guān)。最近發(fā)現(xiàn),PPARγ也在心臟、血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等部位中表達(dá)。此外,PPARγ激活劑吡格列酮和羅格列酮可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的新生大鼠MCR。表明PPARγ參與了MCR的病理生理過程。

本研究通過高糖培養(yǎng)基結(jié)合AngⅡ培養(yǎng)H9c2 心肌細(xì)胞48 h MYH7B、ANP表達(dá)增加,再給予AD-PPARγRNAi重組腺病毒感染后MYH7B、ANP表達(dá)上調(diào)。

綜上,保護(hù)心肌細(xì)胞中PPARγ至關(guān)重要,后續(xù)研究繼續(xù)探討PPARγ高表達(dá)是否對(duì)改善或逆轉(zhuǎn)MCR有重要作用,本研究為了解心肌肥厚機(jī)制、心肌細(xì)胞的防治策略及以PPARγ為靶點(diǎn)新藥開發(fā)提供依據(jù)。