真核翻譯起始因子4G1在老年子宮內(nèi)膜樣癌患者中表達(dá)及臨床意義

彭秀娟 胡玉紅 張丹鳳

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科,黑龍江 佳木斯 154000)

子宮內(nèi)膜癌(EC)又稱子宮體癌,是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一〔1〕。國(guó)際癌癥機(jī)構(gòu)最新數(shù)據(jù)顯示,2020年,全球EC新發(fā)病例417 367例,新增死亡97 370例,且發(fā)病率及死亡率逐年上升〔2〕。子宮內(nèi)膜樣癌是EC最常見的病理亞型,約占EC總病例的80%,組織學(xué)上多呈絨毛腺管狀或腺性內(nèi)膜樣結(jié)構(gòu),并伴有復(fù)雜而密集的分支〔3〕。EC起病隱匿,多數(shù)早期患者可通過手術(shù)及放化療獲益,預(yù)后較好,但晚期及復(fù)發(fā)性患者的疾病管理與治療方案選擇有限,5年生存率僅為15%～17%〔4〕。真核翻譯起始因子(eIF)4G1是翻譯起始復(fù)合物eIF4F的亞基之一,該因子于1981年由Tahara等〔5,6〕從核糖體鹽液的蛋白復(fù)合物(eIF4F)中分離得出,并曾被稱為P220、eIF4G和eIF4γ。eIF4G1是一種關(guān)鍵的支架蛋白,在蛋白質(zhì)翻譯起始階段,可作為起始因子及蛋白結(jié)合橋梁促進(jìn)核糖體與mRNA的結(jié)合〔7〕。研究表明,eIF4G1可在多種翻譯機(jī)制和細(xì)胞進(jìn)程中扮演重要角色,與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、惡性轉(zhuǎn)化及侵襲密切相關(guān),是腫瘤診斷及治療的潛在靶標(biāo)〔8,9〕。既往研究證實(shí),eIF4G1過表達(dá)可參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展,如肺癌、前列腺癌、乳腺癌和鼻咽癌等,并與患者的不良預(yù)后緊密相關(guān)〔10,11〕。然而,eIF4G1在子宮內(nèi)膜樣癌中的表達(dá)、臨床意義及作用機(jī)制尚未見相關(guān)報(bào)道。因此,本研究旨在分析eIF4G1在子宮內(nèi)膜樣癌與癌旁組織中的表達(dá),同時(shí)進(jìn)一步探討其與患者臨床病理特征之間的關(guān)系,以闡明eIF4G1在子宮內(nèi)膜樣癌疾病診斷及病情評(píng)估中生物標(biāo)志物的潛在臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科2019年1月至2023年8月診治的62例子宮內(nèi)膜樣癌組織蠟塊標(biāo)本。平均年齡(57.08±7.91)歲。根據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO,2009年)分期:Ⅰ期35例,Ⅱ～Ⅲ期27例。收集同期行診刮術(shù)或子宮切除術(shù)的26例正常子宮內(nèi)膜組織、30例非典型增生子宮內(nèi)膜組織作為對(duì)照組。正常子宮內(nèi)膜組:年齡44～72歲,平均(54.00±6.79)歲;非典型增生子宮內(nèi)膜組:年齡41～73歲,平均(55.47±8.29)歲。3組年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.53,P=0.22)。另選取同期-80 ℃凍存的20例新鮮子宮內(nèi)膜樣癌組織及癌旁3 cm正常組織進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)和Western印跡檢測(cè),患者年齡43～76歲,平均(58.35±8.22)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):①符合WHO子宮體腫瘤分類(2020年)中子宮內(nèi)膜樣癌的診斷標(biāo)準(zhǔn),且經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí);②臨床資料完整;③術(shù)前未接受過放化療或靶向治療等相關(guān)治療。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并凝血功能障礙;②合并重要臟器功能不全;③合并免疫系統(tǒng)疾病或嚴(yán)重感染。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者均簽署知情同意書。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 免疫組化PV-6000、乙二胺四乙酸(EDTA)修復(fù)液和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購(gòu)自中杉金橋生物有限公司(中國(guó)),兔抗人eIF4G1多抗、β-actin抗體購(gòu)自Proteintech公司(美國(guó)),放射免疫沉淀(RIPA)總蛋白裂解液購(gòu)自代軒生物科技有限公司(中國(guó)),二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司(中國(guó)),PCR引物由捷瑞生物工程有限公司(中國(guó))合成,Trizol總RNA抽提試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司(美國(guó))。

1.3免疫組化實(shí)驗(yàn) 采用免疫組化PV-6000法檢測(cè)組織中eIF4G1蛋白表達(dá)。組織標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛溶液固定,石蠟包埋,4 μm厚度連續(xù)切片。切片常規(guī)脫蠟、水化,加入3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,再行高壓熱修復(fù)抗原,持續(xù)4.0 min。滴加一抗,eIF4G1稀釋至1∶200,4 ℃孵育過夜;磷酸緩沖液(PBS)沖洗,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠/兔IgG二抗,在室溫下孵育50 min;DAB顯色,蘇木素復(fù)染,梯度酒精進(jìn)行脫水后封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照,光鏡下觀察組織染色情況。

1.4Western印跡檢測(cè)eIF4G1蛋白表達(dá)水平 配制RIPA蛋白裂解液,提取組織總蛋白,BCA定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。將蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后,膠內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)移至0.2 μm聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,一抗eIF4G1(1∶200)、β-actin 4 ℃孵育過夜,Tris鹽酸緩沖液 (TBST)洗滌3次后,室溫孵育二抗1 h,滴加電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色。β-actin作為內(nèi)參,用凝膠成像系統(tǒng)分析目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5Real-time PCR實(shí)驗(yàn) 采用Real-time PCR對(duì)eIF4G1 mRNA進(jìn)行定量檢測(cè)。使用Trizol試劑提取30對(duì)子宮內(nèi)膜樣癌與癌旁內(nèi)膜組織總RNA,紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒生成cDNA,按Real-time PCR試劑說明書進(jìn)行PCR,β-actin基因作為內(nèi)參。PCR體系:上、下游引物各0.4 μl,DNA模板2.0 μl,SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μl,添加焦碳酸二乙酯(DEPC)水至總體積20 μl。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性60 s;95 ℃ 15 s,60 ℃退火延伸34 s,循環(huán)40次。Primer Premier5軟件設(shè)計(jì)eIF4G1引物,eIF4G1上游序列:5′-TATTCCAGCCAACTTGTCTC-3′,下游:5′-CAACAGCCTCCTTCTTATTTAG-3′;β-actin上游:5′-AAGGTGACAGCAGTCGGTT-3′,下游:5′-TGTGTGGACTTGGGAGAGG-3′。比較eIF4G1 mRNA表達(dá)差異,相對(duì)表達(dá)倍數(shù)用2-ΔΔCt值表示。

1.6染色結(jié)果判定 兩位主治及以上職稱的病理科醫(yī)師以雙盲方式進(jìn)行切片判讀,eIF4G1陽性表達(dá)定位為細(xì)胞質(zhì),表現(xiàn)為棕黃色或黃褐色顆粒。每張切片將隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野(×400),計(jì)數(shù)每個(gè)視野中的200個(gè)細(xì)胞,細(xì)胞的染色強(qiáng)度和密度將作為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。①細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分:0分(無染色或染色不清)、1分(淺黃色)、2分(棕黃色)、3分(深褐色)。②陽性細(xì)胞百分比評(píng)分:無陽性細(xì)胞為0分,陽性細(xì)胞數(shù)25%≤為1分,26%～50%為2分,51%～75%為3分,>75%為4分。將陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分與表達(dá)百分比相乘:0～3分為陰性(-),>3分為陽性(+)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn),使用Graphpad Prism7.0繪圖。

2 結(jié) 果

2.13組子宮內(nèi)膜組織中eIF4G1蛋白表達(dá) eIF4G1陽性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì),呈棕黃色或黃褐色顆粒。在正常子宮內(nèi)膜組、非典型增生子宮內(nèi)膜組及子宮內(nèi)膜樣癌組eIF4G1陽性表達(dá)率分別為19.2% (5/26)、53.3% (16/30)和80.6%(50/62),組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=29.614,P<0.05)。正常子宮內(nèi)膜組陽性率明顯低于非典型增生子宮內(nèi)膜組(χ2=6.912,P<0.05),非典型增生子宮內(nèi)膜組明顯低于子宮內(nèi)膜樣癌組(χ2=7.439,P<0.05),正常子宮內(nèi)膜組明顯低于子宮內(nèi)膜樣癌組(χ2=29.479,P<0.05)。見圖1。

圖1 eIF4G1在各組子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)(PV-6000法,×400)

2.2子宮內(nèi)膜樣癌組織中eIF4G1蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 eIF4G1與患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及絕經(jīng)狀態(tài)無關(guān)(P>0.05),與組織分化程度、FIGO分期、肌層浸潤(rùn)深度及脈管癌栓相關(guān),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 子宮內(nèi)膜樣癌患者eIF4G1陽性表達(dá)與臨床病理資料的相關(guān)性〔n(%)〕

2.3子宮內(nèi)膜組織中eIF4G1蛋白與mRNA表達(dá)差異 Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,癌組織中eIF4G1 mRNA表達(dá)水平(1.84±0.21)明顯高于癌旁組織(0.99±0.13;t=12.755,P<0.001)。同時(shí),Western印跡分析eIF4G1在子宮內(nèi)膜樣癌與癌旁組織中的蛋白表達(dá)水平提示,在癌組織中,eIF4G1蛋白表達(dá)水平(0.44±0.04)明高于對(duì)應(yīng)的癌旁內(nèi)膜組織(0.26±0.06;t=7.488,P<0.001)。見圖2。

圖2 Western印跡檢測(cè)eIF4G1蛋白表達(dá)

3 討 論

EC是女性癌癥死亡的主要原因之一。不孕癥、肥胖、癌癥家族史、糖尿病、年齡和雌激素水平升高均被確定為該疾病的重要危險(xiǎn)因素〔12〕。近年來,隨著EC診斷方式和治療策略的不斷改進(jìn),規(guī)范的手術(shù)、化療或放療己成為在早期患者中常用且有效的治療手段,普遍預(yù)后良好,然而,對(duì)于晚期及復(fù)發(fā)型病例,該病的治療選擇仍然有限,需要尋找更有效的臨床診治策略〔13〕。

蛋白質(zhì)的合成包含4個(gè)主要環(huán)節(jié):起始、延伸、終止及核糖體回收,其中,起始階段是其翻譯調(diào)控的主要靶點(diǎn)及限速步驟〔14〕。eIF4G1是eIF4G家族的主要成員,在真核生物mRNA翻譯起始過程中,可作為啟動(dòng)因子與蛋白對(duì)接位點(diǎn),與eIF4A、eIF4E組裝形成翻譯起始復(fù)合物eIF4F,進(jìn)而調(diào)控核糖體亞基與mRNA結(jié)合,啟動(dòng)翻譯機(jī)制〔15,16〕。

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過程,涉及多種因素的協(xié)同作用。選擇性mRNA翻譯和信號(hào)傳導(dǎo)通路的紊亂被廣泛認(rèn)為是導(dǎo)致細(xì)胞分化異常和惡性轉(zhuǎn)變的主要原因〔17,18〕。研究表明,翻譯起始因子的功能失調(diào)可以促進(jìn)蛋白質(zhì)翻譯的重編程,進(jìn)而對(duì)細(xì)胞的生存、增殖、轉(zhuǎn)移和新生血管形成產(chǎn)生影響〔19,20〕。Silvera等〔21〕在乳腺癌中發(fā)現(xiàn),eIF4G1可對(duì)蛋白質(zhì)合成機(jī)制進(jìn)行重編程,以增加具有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)的mRNA的翻譯,從而促進(jìn)乳腺癌瘤栓形成和腫瘤細(xì)胞存活(如p120 mRNA),沉默eIF4G1可對(duì)癌栓形成明顯抑制。Li等〔8〕研究也證實(shí),eIF4G1過表達(dá)與乳腺癌的預(yù)后不良密切相關(guān),是其潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物。eIF4G1在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的發(fā)病機(jī)制中同樣發(fā)揮重要作用。Del Valle等〔10〕通過免疫組化發(fā)現(xiàn),eIF4G1在NSCLC腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于癌旁及正常組織,并與NSCLC中的PD-1/PD-L1等免疫檢查點(diǎn)分子具有顯著相關(guān)性,應(yīng)用eIF4G1抑制劑可有效抑制細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型中 NSCLC的生長(zhǎng)。證明了eIF4G1在NSCLC中的臨床相關(guān)性、免疫調(diào)節(jié)功能和治療潛力。Jaiswal等〔22〕在前列腺癌中觀察到,eIF4G1的基因表達(dá)與PCa腫瘤分級(jí)和分期呈正相關(guān),其蛋白過表達(dá)亦與腫瘤進(jìn)展及轉(zhuǎn)移有緊密關(guān)系,敲低PCa細(xì)胞中eIF4G1可引起細(xì)胞周期阻滯、增殖抑制及遷移減少。此外,eIF4G1還被認(rèn)為參與多種疾病及腫瘤的發(fā)生發(fā)展,是其病情程度判斷及預(yù)后評(píng)估的重要生物標(biāo)志物〔22～24〕。然而,eIF4G1在子宮內(nèi)膜樣癌中表達(dá)及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系仍缺少相關(guān)報(bào)道。

本研究提示,eIF4G1可能參與調(diào)控子宮內(nèi)膜樣癌的發(fā)生發(fā)展,并與腫瘤的惡性生物學(xué)行為相關(guān)。eIF4G1因子高陽性表達(dá)可能與腫瘤進(jìn)展、侵襲性增加及不良預(yù)后相關(guān)。

綜上,eIF4G1有望成為子宮內(nèi)膜樣癌臨床治療靶點(diǎn)和早期診斷標(biāo)志物,并為患者病情和預(yù)后評(píng)估提供參考依據(jù)。但是,本實(shí)驗(yàn)也存在不足,如樣本數(shù)量有限,可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差,且該因子在子宮內(nèi)膜樣癌發(fā)病中具體作用機(jī)制尚未明確,因此,下一步還需擴(kuò)大樣本規(guī)模以提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)功效及通過離體和在體實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?進(jìn)一步探索eIF4G1在子宮內(nèi)膜樣癌發(fā)生發(fā)展中作用及分子機(jī)制。