CRNKL1基因rs16981448多態(tài)性與中國漢族人缺血性腦卒中及其中醫(yī)證候顯著關聯(lián)

古聯(lián) 楊怡冰 蘇莉 梁寶云 宋瀟宵 羅偉生

(1廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,廣西 南寧 530023;2廣西中醫(yī)藥大學;3廣西醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院)

缺血性腦卒中(IS)屬于中醫(yī)范疇內的“中風”,又稱之為缺血性中風。2022年美國心臟協(xié)會的報告顯示,每年約有79 500人發(fā)生腦卒中,其中約有61 000人是首發(fā),185 000人是復發(fā)〔1〕。它是全球成年人死亡的第二大原因和致殘的第三大原因〔2〕。果蠅曲頸基因(CRN)定位于細胞核內,是前mRNA剪接所必需的蛋白編碼基因,在細胞周期進程和前mRNA剪接過程中發(fā)揮著重要作用〔3〕。轉錄組學研究表明,曲頸前mRNA剪接因子(CRNKL)1可以抑制細胞mRNA子集的細胞質水平,參與RNA延伸、RNA輸出、DNA 修復和細胞周期等過程〔4〕。既往研究發(fā)現(xiàn)基因多態(tài)性與中醫(yī)證候的形成相關〔5〕。已有學者探索了基因多態(tài)性與急性心肌梗死、高血壓等疾病的中醫(yī)證候的關聯(lián)性〔6,7〕。但是目前尚未有CRNKL1基因多態(tài)性與IS的關聯(lián)研究報道。本研究旨在探索CRNKL1基因rs16981448多態(tài)性與IS及其中醫(yī)證候的相關性。

1 對象與方法

1.1研究對象 2016～2019年廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院收治的IS患者為病例組。其中女315例、男459例,平均年齡(64.12±10.34)歲。納入標準:①符合《各類腦血管疾病診斷要點》中腦卒中的診斷〔8〕,且經過頭顱CT和(或)磁共振成像(MRI)確診;②符合《中風病診斷與療效評定標準(試行)》中中風病的診斷〔9〕;③符合《中風病辨證診斷標準(試行)》中對各中醫(yī)證候的診斷〔10〕;④均為中國漢族人群。排除標準:①合并腦出血者;②短暫性腦缺血發(fā)作(TIA),因腦血管畸形、動脈瘤、動脈炎、腦外傷等引起的腦卒中;③合并有嚴重的心、肝、腎等功能不全患者,合并有嚴重血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)疾病及梅毒、獲得性免疫缺陷綜合征等傳染性疾病患者。選自同一時期廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院及社區(qū)體檢中心的健康體檢者設為對照組。其中女356例、男437例,平均年齡(63.81±10.36)歲。納入標準:均為中國漢族人群。排除標準:①有心腦血管疾病病史;②合并有嚴重的心、肝、腎等功能不全及免疫系統(tǒng)疾病患者。兩組性別分布、年齡差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究方案已經通過廣西醫(yī)科大學醫(yī)學倫理委員會審查,批準編號:20150304-2。所有受試者已簽署知情同意書。

1.2基因分型檢測 使用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管收集受試者清晨空腹外周血,使用北京艾德萊生物科技有限公司的DNA 提取試劑盒提取外周血液樣本DNA,放置在-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。使?Agena平臺的MassARRAY SNP基因分型實驗技術對CRNKL1基因rs16981448多態(tài)性位點進行基因分型檢測,rs16981448多態(tài)性位點上游引物:5′-ACGTTGGATGGATGATGTTCTCCTGCTCAC-3′,下游引物5′-ACGTTGGATGAGCCTGACTGCTTTAGTCAC-3′。病例組、對照組的基因分型成功率分別為99.48%(770/774)、99.37%(788/793)。

1.3臨床生化指標測定 采用日立7600全自動生化分析儀檢測受試者同型半胱氨酸(Hcy)、尿酸(UA)及載脂蛋白(APO)-A、APO-B、低密度脂蛋白(LDL)、極低密度脂蛋白(VLDL)、高密度脂蛋白(HDL)、膽固醇(TC)和三酰甘油(TG)。

1.4統(tǒng)計學方法 采用PLINK軟件進行遺傳關聯(lián)分析。采用擬合優(yōu)度χ2檢驗分析哈溫平衡(HWE)遺傳定律及組間的基因型頻率分布。采用SPSS21.0軟件進行χ2檢驗、t檢驗或方差分析,Logistic回歸分析,一般線性模型分析。

2 結 果

2.1CRNKL1基因rs16981448多態(tài)性基因型頻率分布比較及HWE檢驗 CRNKL1基因rs16981448多態(tài)性在對照組中的分布符合HWE定律(PHWE=0.335)。rs16981448的小等位基因為G,基因型為GG、GC、CC。rs16981448多態(tài)性在病例組與對照組間的基因型頻率分布差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.039)。血瘀證組、氣虛證組與對照組間的基因型頻率分布差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.014,P=0.030)。見表1。

表1 CRNKL1基因rs16981448多態(tài)性在IS不同證候組與對照組基因型頻率分布比較(n)

2.2CRNKL1基因rs16981448多態(tài)性與IS發(fā)生風險的關聯(lián)分析 CRNKL1基因rs16981448多態(tài)性與IS發(fā)生風險顯著相關〔加性模型:OR(95%CI)= 1.35(1.06～1.72),P=0.016;顯性模型:OR(95%CI)為1.40(1.08～1.82),P=0.011;等位基因模型:OR(95%CI)為1.35(1.06～1.72),P=0.015〕,隱性模型與IS發(fā)生風險不相關〔OR(95%CI)為1.17(0.42～3.25),P=0.761〕。

2.3CRNKL1基因rs16981448多態(tài)性與IS不同中醫(yī)證候發(fā)生風險的關聯(lián)分析 多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn),校正年齡、性別后,CRNKL1基因rs16981448多態(tài)性與IS痰證(加性模型、顯性模型)、血瘀證(加性模型、顯性模型)、氣虛證(加性模型、顯性模型)發(fā)生風險的關聯(lián)均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01)。但是,rs16981448多態(tài)性與IS風證、火熱證發(fā)生風險無統(tǒng)計學關聯(lián)。見表2。

表2 CRNKL1基因rs16981448多態(tài)性與IS不同中醫(yī)證候發(fā)生風險的關聯(lián)分析

2.4CRNKL1基因rs16981448多態(tài)性與IS患者UA和Hcy水平的關聯(lián)分析 CRNKL1基因rs16981448多態(tài)性與IS患者的UA(顯性模型)、 Hcy(加性模型、顯性模型)水平顯著相關(P<0.05)。見表3。

表3 CRNKL1基因rs16981448多態(tài)性與IS患者UA、Hcy水平的關聯(lián)分析

2.5CRNKL1基因rs16981448多態(tài)性與IS患者血脂水平的關聯(lián)分析 CRNKL1基因rs16981448多態(tài)性與IS患者的VLDL(加性模型、顯性模型)、TG(加性模型、顯性模型)水平顯著相關(P<0.05),但與其他血脂水平的相關性均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 CRNKL1基因rs16981448多態(tài)性與IS患者血脂水平的關聯(lián)分析

3 討 論

中醫(yī)診斷的精髓在于整體審查、四診合參和病癥結合。同病異證(治)的思想起源于《素問》:“有病頸癰者,或石治之,或針灸治之,而皆已,其真安在?岐伯曰:此同名異治也。夫癰氣之息者,宜以針開除去之;夫氣盛血聚者,宜石而瀉之。所謂同病異治也〔11〕。”由于機體所處外界環(huán)境的不同及個體自身的體質差異,導致不同體質的個體對疾病的易感性不同,最終發(fā)展為不同的階段,即“同病異證”〔12〕。近年來,不少研究將SNP與中醫(yī)辯證相結合,探討不同疾病中醫(yī)證候的易感基因。龍春莉等〔13〕研究發(fā)現(xiàn),Megsin基因C2093T位點CC基因型可能是IgA腎病脾腎氣虛證的易感位點,但該位點與IgA腎病風濕熱毒證、氣陰兩虛證、肝腎陰虛證無顯著相關性。張宇等〔14〕研究發(fā)現(xiàn),CYP2C19*2基因多態(tài)性與IS患者氣虛血瘀證具有顯著的相關性,但未發(fā)現(xiàn)該多態(tài)性位點與陰虛風動證、痰熱腑實證和風痰瘀阻證有顯著相關性。本研究結果說明,基因多態(tài)性位點為中醫(yī)的證候組學提供了分子生物學基礎,也為中醫(yī)“同病異證”提供了理論支持。

有關腦卒中的病因病機,歷代醫(yī)家對其均有不同的認識。唐宋以前醫(yī)家都持外風學說,認為腦卒中是臟腑失和,營衛(wèi)不固,外邪侵襲發(fā)病。金元時期的朱丹溪主張“痰濕生風”,《丹溪心法》云“半身不遂,大率多痰”,脾胃虛弱,無以運化水谷精微,生濕化痰,痰郁化熱生風,上沖于腦〔15〕。李東垣倡導“氣虛生風”,脾為后天之本,一為氣機升降的樞紐,二來運化水谷精微以濡養(yǎng)機體,老年人脾胃功能虛弱,臟腑經脈失于濡養(yǎng)故而多發(fā)〔16〕。此外,氣虛無力推動血液在脈管內運行,可導致淤血。痰濁、血瘀、濕滯阻塞腦竅,導致陰陽失調、氣血逆亂,發(fā)為腦卒中〔17〕。由此可見,痰、氣虛、血瘀是導致腦卒中發(fā)生的重要病理基礎。

CRNKL1位于染色體20p11.23上,在染色體20p11區(qū)域存在不少與IS有關的基因。一項全基因組關聯(lián)研究(GWAS)在IMT染色體20p11的基因間區(qū)域檢測到兩個強相關的SNP(rs16983261、rs6113474),這兩個SNPs可能與頸總動脈和頸內動脈的近壁或遠壁相關,而頸總動脈和頸內動脈的內膜中層厚度是動脈粥樣硬化的既定指標,可預測中風和心肌梗死的風險〔18〕。有報道發(fā)現(xiàn),染色體20p11上的很多基因位點,如ENTPD6 (rs2179638)、PYGB(rs6138553)、GINS1(rs6076347、rs2500406)和RP4-691N24.1(rs16987806、rs6083877)可以導致葡萄糖急性胰島素反應(AIRg)的變異,AIRg是2型糖尿病的預測因子,而糖尿病是IS發(fā)生的危險因素〔19〕。UA是黃嘌呤氧化酶氧化黃嘌呤和次黃嘌呤合成的嘌呤代謝最終產物,可以通過AMP活化蛋白激酶(AMPK)介導的炎癥促進動脈粥樣硬化的發(fā)展〔20〕。新進研究表明,UA不僅能在血清中表達,還能在頸動脈粥樣硬化斑塊中表達,而頸動脈粥樣硬化斑塊的破裂容易引發(fā)血栓栓塞,這也是IS發(fā)生的一個重要原因〔21〕。另有報道〔22〕TMEM63C基因rs3813539位點與IS患者UA 水平顯著關聯(lián),說明該位點可能參與了IS患者UA的代謝過程,這與本研究的結果類似。早期研究發(fā)現(xiàn),高Hcy是動脈粥樣硬化和腦卒中發(fā)生的主要危險因素之一〔23〕。高同型半胱氨酸血癥可以通過增加不對稱二甲基精氨酸(ADMA)的水平導致動脈內皮結構和功能的障礙,使血管壁內產生復雜的變化,還可以誘導氧化應激、內質網應激和未折疊蛋白反應導致動脈粥樣硬化血栓的形成〔24,25〕。Huang等〔26〕報道,lncRNA H19 SNP rs217727與IS患者Hcy水平關聯(lián)具有統(tǒng)計學意義,提示lncRNA H19變異可能影響中國南方漢族人群 IS 患者Hcy的代謝。

血漿中的脂質如TG和TC與冠狀動脈疾病(CAD)發(fā)生風險相關,TG主要在VLDL、乳糜微粒及其代謝殘余物中運輸,TC主要在LDL或HDL中攜帶。與本研究結果相類似的是,既往也有研究報道單核苷酸多態(tài)性與IS患者的血脂水平相關。例如,朱殊等〔27〕報道,攜帶NOS3基因G894T TT基因型的IS患者的LDL-C、TC水平顯著高于攜帶GG和GT基因型患者。另外,Do等〔28〕報道,TRIB1基因rs2954022、APOB基因rs1367117、CILP2基因rs10401969位點與TG、LDL-C及冠狀動脈疾病(CAD)發(fā)生風險相關,而CAD會增加IS的發(fā)生風險。