MTHFD2與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤微環(huán)境相關(guān)性

史振祥，吳 灑，蔡偉松，明小平，陳 雄

1. 武漢大學(xué)中南醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（武漢 430071）

2. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬湖北婦幼保健院婦科Ⅱ（武漢 430070）

頭頸部癌癥在全球癌癥相關(guān)死亡率中排名第六，每年約有60 萬新發(fā)病例和近50%死亡率[1-2]。頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）作為最主要的組織學(xué)類型，占所有頭頸部癌癥的90%以上[3]。HNSCC 來源于口腔、咽和喉的黏膜上皮細(xì)胞。吸煙、酗酒是導(dǎo)致口腔癌和喉癌發(fā)展的兩個(gè)主要危險(xiǎn)因素，而感染人乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus，HPV）則與咽癌高度相關(guān)[2]。目前，HNSCC 的診斷是通過對(duì)原發(fā)腫瘤和（或）頸部腫塊的活檢來確定的，手術(shù)、放療、化療和免疫治療仍是HNSCC 的主要治療方式。HNSCC 的TNM分期系統(tǒng)是臨床上判斷預(yù)后最常用的指標(biāo)，這對(duì)治療策略的選擇至關(guān)重要[4]。雖然有文獻(xiàn)報(bào)道是否感染HPV 也能幫助評(píng)估一部分患者治療反應(yīng)與預(yù)后[2]，但仍有相當(dāng)一部分處于相同TNM 分期的HNSCC 患者在應(yīng)用免疫治療時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生不同的臨床結(jié)果[5]。相同TNM 分期的HNSCC 患者，只有少部分對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑顯示出治療效果[6]。因此，發(fā)現(xiàn)新的和敏感的HNSCC 生物標(biāo)志物仍然是至關(guān)重要的。

亞甲基四氫葉酸脫氫酶2（methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 2，MTHFD2）是葉酸介導(dǎo)的一碳代謝的關(guān)鍵酶之一，在細(xì)胞核苷酸補(bǔ)充氨基酸（甘氨酸和絲氨酸）穩(wěn)態(tài)和s-腺苷蛋氨酸（SAM）產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用[7]。為滿足對(duì)核苷酸供應(yīng)的需求，MTHFD2表達(dá)上調(diào)，這是胚胎發(fā)生過程中細(xì)胞增殖的關(guān)鍵，但其在大多數(shù)成人組織中很少表達(dá)[8]。值得注意的是，由于細(xì)胞增殖的高生物合成需求，MTHFD2在多種腫瘤中顯著上調(diào)。除了在腫瘤中的代謝功能外，MTHFD2在非代謝功能方面也起著至關(guān)重要的作用，如調(diào)節(jié)免疫攻擊能力的免疫細(xì)胞信號(hào)通路[9]。雖然HNSCC 是一種較為常見的癌癥類型，但MTHFD2在HNSCC 中的作用尚不清楚。本研究采用生物信息學(xué)方法，系統(tǒng)全面地獲取MTHFD2在HNSCC 中的表達(dá)情況，分析與腫瘤分級(jí)分期及預(yù)后的關(guān)系，并從基因功能與信號(hào)通路、腫瘤突變負(fù)荷、腫瘤免疫浸潤(rùn)等角度詮釋MTHFD2與HNSCC 之間的關(guān)系，以期為臨床上HNSCC 的診斷和治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

在癌癥和腫瘤基因圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA） 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://portal.gdc.cancer.gov/）中，選擇HNSCC 項(xiàng)目編號(hào)TCGA-HNSC，下載免疫系統(tǒng)浸潤(rùn)、基因表達(dá)（工作流類型：HTSeq FPKM）和相關(guān)臨床信息（數(shù)據(jù)類型：臨床補(bǔ)充）的數(shù)據(jù)[10]。本研究排除了任何關(guān)于年齡、TNM 分期、總生存期（overall survival，OS）、遠(yuǎn)處和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及局部浸潤(rùn)等數(shù)據(jù)缺失或不足的樣本。在全部528 例HNSCC 數(shù)據(jù)與44 例對(duì)照數(shù)據(jù)中，519 例HNSCC 樣本、44 例對(duì)照樣本符合納入標(biāo)準(zhǔn)，保留了RNA-Seq 和臨床數(shù)據(jù)，并用于進(jìn)一步的研究。本研究符合TCGA 提供的出版指南。

1.2 基因集合富集分析

使用從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的歸一化RNASeq 數(shù)據(jù)進(jìn)行基因集合富集分析（gene sets enrichment analysis，GSEA）[11]。排列的數(shù)量被設(shè)置為1 000 個(gè)。利用GSEA 分析GO 和KEGG 通路，以研究MTHFD2可能的生物學(xué)功能。富集結(jié)果滿足錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）和P值均小于0.05 時(shí)表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 腫瘤突變負(fù)荷分析

體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)，包括體細(xì)胞、編碼、堿基替換和插入-缺失突變，由R 軟件和maftools 軟件包進(jìn)行處理，該軟件包分析并創(chuàng)建突變注釋格式文件（https://github.com/PoisonAlien/maftools）的可視化，其中，能進(jìn)行數(shù)據(jù)處理的樣本有508 例。腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation burden，TMB）計(jì)算為每百萬堿基的體細(xì)胞突變數(shù)。中位TMB 值定義為將HNSCC 患者分為高TMB 組和低TMB 組的臨界值。

1.4 免疫浸潤(rùn)分析

使用CIBERSORT 和TIMER 2.0（http://timer.comp-genomics.org/）相關(guān)模塊評(píng)估MTHFD2表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞（tumor-infiltrating immune cells，TIICs）之間的潛在關(guān)系。數(shù)據(jù)處理采用Spearman 相關(guān)性分析，P＜0.05 表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TIMER 2.0 是一個(gè)用于系統(tǒng)分析不同癌癥類型的免疫浸潤(rùn)的綜合資源站。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用R 4.2.3 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。應(yīng)用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行單變量和多變量模型生存分析，分別計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比（hazard ratio，HR）和95%置信區(qū)間（confidence interval，CI），并評(píng)估MTHFD2的表達(dá)以及其他病理和臨床因素對(duì)OS 的影響。組間比較采用χ2檢驗(yàn)及Fisher 精確檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 生存分析

TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)用于識(shí)別正常組織和腫瘤組織中MTHFD2mRNA 水平的差異。對(duì)納入的519個(gè)腫瘤文件和44 個(gè)正常文件進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，將計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為與微陣列數(shù)據(jù)更相似的值。正常組織和HNSCC 組織中MTHFD2的表達(dá)結(jié)果見圖 1-A，MTHFD2在HNSCC 組織中高表達(dá)，在正常組織中低表達(dá)；差異表達(dá)與HNSCC 組織與配對(duì)相鄰正常組織比較結(jié)果一致（圖1-B）。使用Cox 回歸分析探索MTHFD2以及其他病理和臨床因素與HNSCC 患者OS 之間的聯(lián)系，單因素分析顯示，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[HR=4.745，95%CI（1.748，12.883），P=0.02]、淋巴血管浸潤(rùn)[HR=1.699，95%CI（1.211，2.384），P=0.02]、MTHFD2表達(dá) 水 平[HR=1.477，95%CI（1.185，1.842），P＜0.001]與OS 顯著相關(guān)；多因素分析結(jié)果如圖1-C 顯示，MTHFD2表達(dá)是預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。如圖1-D 所示，使用最佳閾值方法確定cut-off 值，并劃分為高、低表達(dá)組，每組各130例患者。相較于MTHFD2低表達(dá)的HNSCC 患者，MTHFD2高表達(dá)人群OS 更低（HR=1.5，P=0.04）。MTHFD2表達(dá)的分布、HNSCC 患者的生存狀態(tài)、MTHFD2的表達(dá)譜如圖1-E 所示。MTHFD2對(duì)HNSCC 預(yù)后有一定預(yù)測(cè)價(jià)值，ROC曲線顯示MTHFD2表達(dá)水平預(yù)測(cè)HNSCC 患者5年生存率的AUC 為0.612（圖1-F）。

圖1 MTHFD2表達(dá)及其與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者生存預(yù)后的關(guān)系Figure 1.The expression of MTHFD2 and its relationship with survival status of patients with HNSCC

2.2 MTHFD2表達(dá)與臨床病理的關(guān)系

MTHFD2表達(dá)水平增加與T 分期（圖2-A）、N 分期（圖2-B）、臨床分期（圖2-D）、組織學(xué)分級(jí)（圖2-E）、淋巴血管浸潤(rùn)程度（圖2-F）顯著相關(guān)，P值均＜0.05，而M 分期與MTHFD2過表達(dá)之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2-C）。結(jié)果表明，與MTHFD2低表達(dá)水平HNSCC 患者相比，MTHFD2高表達(dá)水平者具有更高的組織學(xué)分級(jí)和臨床分期。

圖2 MTHFD2表達(dá)與臨床病理的關(guān)系Figure 2. Relationship between MTHFD2 expression and clinicopathology

2.3 MTHFD2的GSEA研究

采用GO 和KEGG 通路分析，探討MTHFD2潛在的生物學(xué)功能。G S E A 結(jié)果顯示，在MTHFD2高水平樣本中，GO 項(xiàng)和KEGG 通路富集存在顯著差異（FDR ＜0.050，P＜0.050）。根據(jù)其歸一化富集評(píng)分（normalized enrichment score，NES）選擇最高度富集的信號(hào)通路。KEGG通路分析顯示，與MTHFD2表達(dá)呈強(qiáng)正相關(guān)的通路包括細(xì)胞周期、藥物代謝細(xì)胞色素p450、細(xì)胞色素p450的異生物代謝、視黃醇代謝和類固醇激素生物合成；強(qiáng)負(fù)相關(guān)通路包括心肌收縮、擴(kuò)張性心肌病、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、肥厚性心肌病和阿爾茨海默?。▓D3-A、圖3-B）。GO 通路分析顯示5 類與高水平MTHFD2正相關(guān)的生物進(jìn)程，分別為ncRNA 代謝過程、模式形成過程、細(xì)胞器分裂、ATP 酶活性和纖毛組織；負(fù)相關(guān)進(jìn)程為神經(jīng)遞質(zhì)受體調(diào)節(jié)活動(dòng)、血管緊張素激活信號(hào)通路、原纖維膠原三聚體、角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)育和細(xì)胞外基質(zhì)組織的負(fù)調(diào)控，如圖3-C 和3-D 所示。與MTHFD2密切相關(guān)的生物過程和分子功能分別是小分子分解代謝過程、羧酸生物合成過程和羧酸結(jié)合過程。結(jié)果表明，在HNSCC患者中調(diào)控細(xì)胞周期控制和ncRNA 代謝過程的通路與MTHFD2的表達(dá)密切相關(guān)。

圖3 MTHFD2 的GO功能富集分析與KEGG信號(hào)通路分析Figure 3. GO term and KEGG pathway analyses of MTHFD2

2.4 MTHFD2表達(dá)與腫瘤突變負(fù)荷的關(guān)系

TMB 被認(rèn)為是一種新的免疫療效的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。本研究共分析了508 個(gè)樣本，其中451 個(gè)樣本發(fā)生了改變，MTHFD2體細(xì)胞突變率為0.59%（圖4-A）。圖4-B 顯示MTHFD2和TP53、TTN、FAT1等前10 個(gè)突變基因的錯(cuò)義突變幾乎占了所有的突變類型。變異型中單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）的頻率明顯高于插入和缺失，C ＞T 是最常見的突變型。特定樣本中的TMB 和排名前10位的突變基因見圖4-C。進(jìn)行相關(guān)性分析以確定MTHFD2表達(dá)與TMB 評(píng)分之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MTHFD2表達(dá)與TMB 評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.18，P＜0.001)，這些結(jié)果可能為MTHFD2干預(yù)治療HNSCC 提供潛在線索和證據(jù)。

圖4 MTHFD2存在體細(xì)胞突變且其表達(dá)與腫瘤突變負(fù)荷呈正相關(guān)Figure 4.The somatic mutation of MTHFD2 and the positive correlation between its expression and TMB score

2.5 MTHFD2表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞的關(guān)系

為探究不同MTHFD2水平的HNSCC 患者腫瘤免疫微環(huán)境是否不同，根據(jù)MTHFD2的表達(dá)情況將腫瘤樣本分為2 組，其中高表達(dá)組250 例，低表達(dá)組250 例。使用CIBERSORT 算法評(píng)估MTHFD2高、低表達(dá)組在24 種免疫細(xì)胞上表達(dá)水平的差異，結(jié)果顯示指狀樹突細(xì)胞（interdigitating dendritic cell，iDC）、肥大細(xì)胞、NK CD56 bright 細(xì)胞、NK CD56 dim 細(xì)胞、T 輔助細(xì)胞、TFH、Th17 細(xì)胞、Th2 細(xì)胞和Treg 細(xì)胞的浸潤(rùn)程度均受到MTHFD2表達(dá)的影響；與低表達(dá)組相比，高表達(dá)組NK CD56 bright 細(xì)胞、T 輔助細(xì)胞和Th2 細(xì)胞升高，而iDC、TFH、Th17 細(xì)胞、Treg 細(xì)胞、NK CD56 dim 細(xì)胞和肥大細(xì)胞降低（圖5-A）。本研究還評(píng)估了24 種免疫細(xì)胞之間可能存在的相關(guān)性，熱圖結(jié)果顯示，不同的腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞亞群的比例是從弱相關(guān)到中度相關(guān)的（圖5-B）?？紤]到獨(dú)立的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞在預(yù)測(cè)總生存率和前哨淋巴結(jié)狀態(tài)中起著關(guān)鍵作用，使用TIMER 2.0 來分析HNSCC 中MTHFD2的表達(dá)與免疫浸潤(rùn)水平之間可能存在的相關(guān)性。如圖5-C 所示，MTHFD2的表達(dá)與Th2細(xì)胞（r=0.245，P＜0.001）、T 輔助細(xì)胞（r=0.225，P＜0.001）的浸潤(rùn)水平呈正相關(guān)，和肥大細(xì)胞（r=-0.172，P＜0.001）、Th17 細(xì)胞（r=-0.128，P=0.004）、中性粒細(xì)胞（r=-0.104，P=0.020）以及Treg 細(xì)胞（r=-0.094，P=0.036）的浸潤(rùn)水平呈負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果表明，MTHFD2與HNSCC的免疫浸潤(rùn)水平有著十分密切的聯(lián)系。

3 討論

HNSCC 發(fā)病率逐年上升，預(yù)計(jì)其2030 年發(fā)病率相較于2018 年升高30%[2]。既往研究顯示盡管癌癥患者總體生存率顯著提高，但晚期HNSCC患者治療后失敗的可能性仍相對(duì)較高[12]。目前臨床采用包括手術(shù)、放化療和免疫治療在內(nèi)的多種治療策略[13]，為各個(gè)階段的HNSCC 患者提供個(gè)體化和有效治療，免疫治療是其中發(fā)展最為迅速的一種治療方法[4,14]。生物標(biāo)志物有助于預(yù)測(cè)免疫表型，這是由免疫反應(yīng)狀態(tài)定義的。大量研究證據(jù)提供了關(guān)于HNSCC 生物標(biāo)志物的信息。PD-L1 負(fù)向調(diào)節(jié)免疫功能，是HNSCC 中著名但有爭(zhēng)議的生物標(biāo)志物[15]。與PD-L1-腫瘤相比，PD-L1+腫瘤對(duì)應(yīng)用抗PD-1/PD-L1 治療的反應(yīng)率提升[16]。然而，來自III 期隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)的數(shù)據(jù)未能發(fā)現(xiàn)PD-L1 表達(dá)與腫瘤反應(yīng)或生存之間的顯著相關(guān)性，通過長(zhǎng)期的隨訪，使用納武利尤單抗對(duì)PD-L1 表達(dá)與PD-L1 非表達(dá)患者均有療效，死亡風(fēng)險(xiǎn)分別降低了45%和27%，且兩組患者總體生存率在18、24、30 個(gè)月時(shí)均無顯著性差異[17-18]。TMB 近年來在前瞻性臨床試驗(yàn)和許多腫瘤類型中被評(píng)估為免疫檢查點(diǎn)封鎖的潛在生物標(biāo)志物[19-21]。據(jù)報(bào)道，MTHFD2參與了一系列關(guān)鍵的細(xì)胞生物學(xué)過程，如核苷酸補(bǔ)充、氨基酸（甘氨酸和絲氨酸）穩(wěn)態(tài)和s-腺苷甲硫氨酸（SAM）產(chǎn)生[7]。最初，MTHFD2被認(rèn)為是葉酸介導(dǎo)的一碳代謝的關(guān)鍵酶之一，通過上調(diào)一碳代謝策略參與腫瘤的發(fā)生和癌癥的發(fā)展[22-23]?；诖嗽?，針對(duì)一碳代謝的選擇性化療藥物不斷被研發(fā)并被應(yīng)用于腫瘤治療，如經(jīng)典藥物甲氨蝶呤等。近年來MTHFD2的非代謝功能越來越受到關(guān)注，研究認(rèn)為IFN-γ 誘導(dǎo)的MTHFD2通過非代謝方式上調(diào)PD-L1 來誘導(dǎo)癌癥免疫逃避[9]。

本研究使用從TCGA 獲得的HNSCC 患者的數(shù)據(jù)來評(píng)估MTHFD2對(duì)生存結(jié)局的預(yù)測(cè)價(jià)值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MTHFD2高表達(dá)可作為不良OS 的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。有報(bào)道稱MTHFD2在急性髓系白血病（AML）中過表達(dá)，下調(diào)MTHFD2可降低AML細(xì)胞的生長(zhǎng)和集落形成，并誘導(dǎo)分化[24]。在乳腺癌細(xì)胞中抑制MTHFD2可顯著影響許多重要的代謝途徑，表明MTHFD2在癌細(xì)胞可能起著中央代謝酶的作用[25]。高表達(dá)MTHFD2的HNSCC 患者較低表達(dá)者更有可能表現(xiàn)為晚的TNM 分期[26]，反映高M(jìn)THFD2表達(dá)水平可能影響腫瘤發(fā)生和腫瘤免疫機(jī)制的進(jìn)展[27]。

GO 項(xiàng)和KEGG 通路分析顯示，MTHFD2表達(dá)上調(diào)主要與細(xì)胞周期控制和小分子分解代謝過程有關(guān)。在HNSCC 患者中MTHFD2表達(dá)升高可能會(huì)改變細(xì)胞周期控制和代謝過程。除代謝功能外，MTHFD2體細(xì)胞突變率接近1%，其表達(dá)與TMB 評(píng)分呈正相關(guān)。自從TMB 首次被認(rèn)為是黑色素瘤免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICIs）的潛在生物標(biāo)志物以來[20]，許多研究已經(jīng)報(bào)道了更高的TMB和ICIs 療效之間的聯(lián)系，表明TMB 可能是一個(gè)很好的療效預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物[28-30]。

本研究使用TIMER 2.0 數(shù)據(jù)庫(kù)揭示了HNSCC中MTHFD2的表達(dá)和免疫浸潤(rùn)水平之間的聯(lián)系。MTHFD2表達(dá)與肥大細(xì)胞、T 輔助細(xì)胞和Th2細(xì)胞的相關(guān)性最強(qiáng)。此外，CIBERSORT 分析顯示，MTHFD2表達(dá)水平與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平，特別是NK 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T 輔助細(xì)胞之間呈中度至強(qiáng)正相關(guān)。MTHFD2高表達(dá)組中NK CD56 bright、Th2 等細(xì)胞增加，而iDC、NK CD56 dim和肥大細(xì)胞等減少。NK 細(xì)胞根據(jù)CD56 的密度分為NK CD56 dim 細(xì)胞和NK CD56 bright 細(xì)胞2種類型，前者有強(qiáng)大的細(xì)胞毒性，后者可以分泌豐富的細(xì)胞因子[29]。有研究報(bào)道CD4+細(xì)胞中不同細(xì)胞亞群一碳代謝和嘌呤合成的激活有明顯差異[31-32]，與本團(tuán)隊(duì)分析一致，MTHFD2表達(dá)的差異可能與不同T 細(xì)胞亞型的浸潤(rùn)有關(guān)，提示了MTHFD2調(diào)控HNSCC 中NK 細(xì)胞和T 細(xì)胞功能的可能機(jī)制。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示MTHFD2可作為HNSCC 新的生物標(biāo)志物。研究有助于在HNSCC中闡明MTHFD2與HNSCC 患者預(yù)后的關(guān)系及其與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的作用，以及調(diào)節(jié)這些過程的蛋白質(zhì)。隨著對(duì)其功能范圍的進(jìn)一步研究，MTHFD2可作為一種對(duì)HNSCC 診斷和免疫生物標(biāo)志物的有效工具，并可能有助于使生物標(biāo)志物治療成為未來治療HNSCC 的一個(gè)有前途的選擇。