中性粒細胞在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎中的相關(guān)性研究

劉 昕，郭佳軍，馬紅娥，張文賢

1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院（蘭州 730000）

2. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院老年骨科（蘭州 730000）

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis, OA）是一種最常見的影響身體關(guān)節(jié)的退行性肌肉骨骼疾病，膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis, KOA）是 OA在膝關(guān)節(jié)的具體表現(xiàn)[1]，近年，由于人口老齡化加速，導(dǎo)致KOA 患者在全球范圍內(nèi)不斷增加[2]。目前，已知造成疾病的危險因素有衰老、肥胖、性別、遺傳因素和創(chuàng)傷等[3]。KOA 病理因素復(fù)雜，對膝關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨、滑膜、韌帶和半月板等整體結(jié)構(gòu)變化有一定影響，因此了解KOA 的病因、病理情況，才能更好地在日后的防治中起到積極作用[4]。中性粒細胞作為強大的天然免疫效應(yīng)細胞，可以精確調(diào)節(jié)血液和組織的功能，是關(guān)節(jié)損傷后首先進入滑膜的免疫細胞，是關(guān)節(jié)炎癥和軟骨破壞的重要因素[5-6]。本文通過匯總中性粒細胞參與KOA 病理生理學(xué)變化過程，總結(jié)中性粒細胞通過促炎機制加速KOA 的進程，有助于了解中性粒細胞的作用機制，從而為抑制KOA病理進程、 幫助重建膝關(guān)節(jié)內(nèi)穩(wěn)態(tài)及后續(xù)治療提供新思路。

1 膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的影響因素

年齡是KOA 發(fā)展的重要危險因素之一。研究發(fā)現(xiàn)，60～69 歲人群KOA 患病率最高，到70歲后患病率呈階段性回落，推測可能與年齡增大減少繁重的體力活動有關(guān)[7-8]。因此，減少繁重體力活動或許能減輕膝關(guān)節(jié)負荷，從而減少KOA的發(fā)生。但弗雷明漢心臟研究（Framingham heart study）調(diào)查發(fā)現(xiàn)，60～90 歲的成人中有癥狀的OA 發(fā)病率為9.5%，放射學(xué)診斷KOA 的患病率為33%，其中7.6%的患者年齡小于70 歲，15.8%的患者超過80 歲，KOA 患病率隨年齡增長呈增加趨勢[9-10]。

性別也是KOA 的影響因素之一。有研究顯示，50～60 歲的女性KOA 發(fā)生率是同年齡段男性的3.5 倍，雌激素具有影響軟骨細胞活性的作用，雌激素水平下降導(dǎo)致骨量增加，從而加重膝關(guān)節(jié)負荷[11]。月經(jīng)周期和激素波動會導(dǎo)致關(guān)節(jié)松弛，增加女性關(guān)節(jié)損傷風(fēng)險，從而增加OA 患病風(fēng)險[12]。但絕經(jīng)期對KOA 影響的具體機制尚不明確，還需進一步研究。

生活方式亦對KOA 患病率有一定影響。研究證實，肥胖是影響KOA 發(fā)生的關(guān)鍵因素。日?；顒又?，膝關(guān)節(jié)負荷是體重的2～3 倍[12]，當(dāng)體重增加后，膝關(guān)節(jié)負荷隨之增大而出現(xiàn)應(yīng)力損傷[8]。研究發(fā)現(xiàn)女性體重降低5 kg，KOA 患病率降低50%[13]。此外，多余的脂肪組織會引起機體激素水平變化、生長因子增加等一系列促炎反應(yīng)，對膝關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨產(chǎn)生不良影響，從而導(dǎo)致KOA 的發(fā)生[14]。

職業(yè)和KOA 患病率也有一定相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，需要重復(fù)下蹲動作的工作，會導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)部壓力增大，并使膝關(guān)節(jié)長期受到?jīng)_擊力或扭力，從而提高KOA 患病風(fēng)險[15]。有較大強度體力運動的運動員、需要走路時搬運的工人和軍人KOA患病率也相應(yīng)增加[16-17]。近年來隨著KOA 患病率上升，KOA 患者廣泛分布在各個行業(yè)中，因此了解KOA 潛在機制至關(guān)重要。

2 膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎與中性粒細胞和巨噬細胞的關(guān)系

OA 患者關(guān)節(jié)中可以檢測到巨噬細胞和中性粒細胞，巨噬細胞分泌金屬蛋白酶和炎癥細胞因子，中性粒細胞分泌中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase, NE）在內(nèi)的降解蛋白酶，此過程會促進OA 進程，損傷關(guān)節(jié)軟骨[18]。關(guān)節(jié)滑液和滑膜組織中含有巨噬細胞、中性粒細胞、T 細胞等，其中巨噬細胞含量最多，中性粒細胞分布較廣。大部分中性粒細胞分布在關(guān)節(jié)滑液中，約占26%，只有8%分布于其他組織，約35%的KOA 患者可在滑膜中檢測出中性粒細胞，含量與性別差異無關(guān)。NE 可以在早期、中期KOA 患者的關(guān)節(jié)滑膜中檢測出來，但無法在正常人的關(guān)節(jié)滑膜中檢測到[19]。中性粒細胞與滑液在關(guān)節(jié)中發(fā)生反應(yīng)，中性粒細胞與淋巴細胞的比值（neutrophil to lymphocyte ratio, NLR）可以反映OA 進展，晚期KOA 患者的NLR 數(shù)值會顯著增高[20]。巨噬細胞具有可塑性，不同的刺激下能使尚未分型的成熟巨噬細胞發(fā)生分型極化，已分化的巨噬細胞之間可以相互轉(zhuǎn)化。而間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有潛在的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，它不僅能抑制M1 型巨噬細胞活性，還能誘導(dǎo)M1 型巨噬細胞向M2 型巨噬細胞極化，使M2 型巨噬細胞功能進一步活化，抗炎因子生成增多，促炎因子生成減少，由組織促炎反應(yīng)向抗炎反應(yīng)調(diào)節(jié)，進而改善失控性炎癥反應(yīng)[19,21]。為闡明中性粒細胞在KOA 進展中的作用與具體機制變化，還需進一步研究中性粒細胞和KOA 分子的相關(guān)性。

3 膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎病理機制

KOA 初始階段表現(xiàn)為軟骨細胞增殖、肥大，促進軟骨細胞基質(zhì)合成等。關(guān)節(jié)的慢性炎癥反應(yīng)是KOA 發(fā)生發(fā)展的重要因素，中性粒細胞在此過程中發(fā)揮著重要作用。滑膜囊中的中性粒細胞幫助趨化因子分泌，抑制軟骨細胞活動，形成NE 促進KOA 的炎癥進程[22]。

3.1 軟骨退化

目前，骨與軟骨先后變化結(jié)果尚不明確，KOA 的病理生理學(xué)作用尚需進一步探索[8]。膝關(guān)節(jié)軟骨由軟骨細胞構(gòu)成，軟骨細胞分泌細胞外基質(zhì)（extracellular matrixc, ECM），能夠承受生物力學(xué)壓力，為軟骨提供彈性和抗壓力的能力[1-2]，正常情況下，軟骨細胞維持關(guān)節(jié)內(nèi)穩(wěn)態(tài)。在KOA發(fā)病過程中，軟骨細胞會通過分解代謝蛋白酶，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)ECM 增殖和分化，使軟骨損傷[3,8]，受損后的軟骨難以修復(fù)[23]。

骨髓MSCs 可以分化軟骨細胞并增強其增殖能力，輔助造血分化的同時進行自我更新，通過白介素-6（interleukin-6，IL-6）減少中性粒細胞凋亡[24]。骨骼發(fā)育過程中，轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)MSCs，通過信號通路傳導(dǎo)進入軟骨細胞，受Runx2 轉(zhuǎn)錄因子正調(diào)控作用，在軟骨內(nèi)骨化并使其增殖和肥大。軟骨細胞增殖區(qū)產(chǎn)生Ⅵ型膠原并在這個過程中提供軟骨內(nèi)鈣化的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)[7,25]。骨重塑過程中，基質(zhì)金屬蛋白酶-13（matrix metalloproteinase-13,MMP-13）加速破骨細胞和軟骨細胞的活性吸收[26]。

成骨細胞起源于MSCs，可以調(diào)控前列腺素E2（prostaglandin E2, PGE2） 和IL-6。PGE2 和IL-6 的分泌水平與骨保護素表達呈正相關(guān)，與核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）受體活化因子配體（receptor activactor of NF-κB liganel，RANKL）表達呈負相關(guān)[27]。研究表明，當(dāng)成骨細胞表達較低時，其骨吸收效率更高[26]。成骨細胞會分泌RANKL，作為一種啟動破骨前體細胞向破骨細胞分化的重要因子，RANKL 會與破骨前體細胞表面受體結(jié)合，從而產(chǎn)生破骨細胞[6,27]。中性粒細胞誘導(dǎo)破骨細胞前體分泌RANKL 來激活破骨細胞，從而促進骨吸收作用。骨形成和重塑主要由軟骨細胞、成骨細胞和破骨細胞控制。軟骨細胞積累軟骨基質(zhì)，鈣化并形成鈣化骨。骨祖細胞經(jīng)過骨鈣素誘導(dǎo)分化成為成骨細胞。骨橋蛋白（OPN）封閉破骨細胞之間的區(qū)域，為骨骼提供抗壓強度的I 型膠原和骨唾液酸蛋白（BSP），將成骨細胞與ECM 結(jié)合。當(dāng)MSCs 分化為成骨細胞時，分泌細胞集落刺激因子（CSF）并產(chǎn)生骨保護素（OPG），隔離RANKL 競爭性結(jié)合，幫助破骨細胞發(fā)育[2,26]。

隨著KOA 發(fā)展，肥厚的軟骨細胞在退變區(qū)凋亡增加，并停止增殖正常的軟骨細胞，軟骨細胞凋亡后使軟骨下骨硬化及礦化、生成骨贅，形成不可逆的軟骨退行性變。KOA 晚期，軟骨細胞增殖、分化受限變小，關(guān)節(jié)表面及半月板會顯示出退化過程的纖維性顫動。研究認為造成KOA軟骨不可逆的損傷可能是過度激活了MMP-13。中性粒細胞通過釋放NE，可以在體外快速降解軟骨膠原蛋白并激活潛在的MMP-13[28]，NE 只需4 h 即可破壞軟骨結(jié)構(gòu)，并導(dǎo)致疼痛發(fā)生[7,29]。NE可以抑制軟骨細胞的增殖，通過激活半胱天冬酶-3 誘導(dǎo)DNA 變性，同時誘導(dǎo)β 受體引起線粒體內(nèi)鈣離子的釋放，影響線粒體膜電位，刺激細胞膜上的受體，引起細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cAMP）的積累，進而通過AMP 激酶（AMPK）通路抑制線粒體的呼吸功能，降低膜電位并增加細胞內(nèi)活性氧（ROS）以促進細胞凋亡[30]。

炎癥反應(yīng)及骨重建的過程會引起B(yǎng) 淋巴細胞和巨噬細胞增多，導(dǎo)致骨硬化。骨硬化后軟骨通過增加表面積來承擔(dān)關(guān)節(jié)的應(yīng)力負擔(dān)，最終導(dǎo)致骨贅形成。隨著KOA 炎癥程度加重，關(guān)節(jié)中T細胞和中性粒細胞的水平增加[31]。研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷性O(shè)A 小鼠模型中巨噬細胞耗竭時，受傷關(guān)節(jié)無法恢復(fù)，表明巨噬細胞可以抑制中性粒細胞失衡造成的損傷，有一定抗炎作用[31]。另外，NE通過活化蛋白酶激活受體2（protease-activated receptor 2，PAR-2）參與骨的發(fā)育，PAR-2 與骨贅形成正相關(guān)，提示NE 可增強PAR-2 的活性，減少KOA 軟骨損傷[32]。

以上研究表明，中性粒細胞對于關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)有重要作用，其在KOA 進程中表現(xiàn)出異?；钚裕@種異?？赡苡蓱?yīng)力介導(dǎo)的關(guān)節(jié)內(nèi)通道感覺信號在傳導(dǎo)時激活中性粒細胞，導(dǎo)致軟骨退行性變[33]。

3.2 滑膜組織

滑膜組織的低度慢性炎癥在KOA 病理進程中起核心作用，中樞免疫機制失調(diào)導(dǎo)致滑膜組織破壞和炎癥反應(yīng)增加是KOA 慢性疼痛的潛在因素。KOA 作為由炎癥引發(fā)的多因素復(fù)雜關(guān)節(jié)病，據(jù)現(xiàn)有研究表明，中性粒細胞在滑膜炎癥中發(fā)揮重要作用[5,33]。KOA 滑膜炎癥發(fā)生時，會產(chǎn)生單核細胞侵襲、囊膜纖維化、血管翳生成和滑膜增生等一系列組織學(xué)變化。

ECM 受損、細胞應(yīng)激后，通過Toll 樣受體（TLRs）激活先天免疫系統(tǒng)和NF-κB，產(chǎn)生巨噬細胞、特質(zhì)顆粒白細胞和淋巴細胞，經(jīng)過募集作用使炎癥因子發(fā)揮重要作用，誘導(dǎo)軟骨細胞的分解代謝[29]。中性粒細胞是最先滲入滑膜的免疫細胞，巨噬細胞是滑膜和滑膜液中含量最豐富的細胞[5]。在OA 免疫細胞中，中性粒細胞數(shù)量較少，但其細胞毒性可能最顯著。中性粒細胞中的NE與OA 嚴重程度有關(guān)，NE 可以促進中性粒細胞等免疫細胞在ECM 中的遷移，加劇炎癥反應(yīng)[34]。

免疫細胞、成纖維細胞和結(jié)締組織為關(guān)節(jié)滑液提供能量，關(guān)節(jié)滑液中的MMP-9 和中性粒細胞明膠酶相關(guān)的脂質(zhì)運載蛋白通過中性粒細胞形成復(fù)合物，參與促炎和免疫調(diào)節(jié)作用，使促炎和抗炎處于一個復(fù)雜平衡的狀態(tài)，共同促進軟骨降解[5]。從關(guān)節(jié)滑液中發(fā)現(xiàn)了嗜中性粒細胞因子包括IL-1β、IL-6、IL-21、IL-22、IL-23、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）[5,8,35]。此外，IL-7 會在滑膜組織中升高，引起中性粒細胞溶解[33,35]。

KOA 炎癥是軟骨修復(fù)和降解過程中的結(jié)合，抑制某一種細胞因子對KOA 的病理進程沒有明顯改善作用[36]。例如，KOA 患者關(guān)節(jié)中TNF-α刺激軟骨細胞分解代謝，使用TNF 抑制劑可能對疼痛和功能有所改善，但并不能改變KOA 病理狀態(tài)[32,37]，表明利用細胞因子作為KOA 治療靶點，需要了解KOA 發(fā)病機制中所有細胞因子間的相互作用。

3.3 外泌體

外泌體是一種來自體液和細胞的細胞外微泡，攜帶蛋白質(zhì)、DNA、RNA 等生物大分子與其表面受體結(jié)合，使信號在細胞間傳遞。因此，外泌體在免疫調(diào)節(jié)、疾病發(fā)生發(fā)展和治療中發(fā)揮重要作用[38]。外泌體廣泛存在于各種細胞中，由MSCs、骨細胞或軟骨細胞開發(fā)的外泌體可以促進骨和軟骨再生。

外泌體中包含許多重要的生物分子，例如蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、糖類等，這些生物分子在體內(nèi)外環(huán)境中發(fā)揮著重要的作用，外泌體可以直接進入靶細胞并將其分解為蛋白質(zhì)或脂質(zhì)，同時攜帶其他生物分子和信號分子，如miRNA 和mRNA。此外，外泌體還可以促進某些基因的表達[39]。MSCs 衍生的外泌體通過調(diào)節(jié)miRNA 的含量來改善OA 的炎癥和軟骨變性，與miR-100-5p、miR-135b、miR-92a-3p、miR-95-5p、miR-140-5p 及l(fā)ncRNAKLF3-AS1 相關(guān)[40-41]。研究表明，外泌體在OA 中發(fā)揮著雙重作用，一是直接作用于成纖維細胞和免疫細胞，成纖維滑膜細胞內(nèi)化，下調(diào)TNF-α 誘導(dǎo)的炎性因子表達；二是間接作用于其他炎癥相關(guān)分子[41-42]。同時，在正常組織和OA 組織的外泌體中發(fā)現(xiàn)了一些共有的生物標志物，在正常組織中發(fā)現(xiàn)的外泌體生物學(xué)特征與OA 組織存在顯著差異[43]，但這些研究缺乏對其特異性和穩(wěn)定性的評估。

4 膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的治療現(xiàn)狀

KOA 作為臨床上常見疾病，目前治療目標為控制癥狀、減緩疾病進展，從而提升患者生活質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)，OA 可以誘導(dǎo)軟骨細胞凋亡，關(guān)節(jié)被炎癥介質(zhì)浸潤而損傷軟骨[8]。軟骨細胞凋亡首先發(fā)生于某處部位，當(dāng)其向其他部位蔓延時，會導(dǎo)致更嚴重的損害，進而引發(fā)級聯(lián)反應(yīng)[44]。

KOA 患者因為移動困難，關(guān)節(jié)僵硬、疼痛尋求診斷時，通常是利用體格檢查和放射學(xué)影像發(fā)現(xiàn)膝關(guān)節(jié)骨骼異常，而磁共振成像（MRI）和超聲檢查應(yīng)用較少[45]。當(dāng)患者膝關(guān)節(jié)疼痛并在影像學(xué)層面發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)面硬化時，通常被診斷為中度的軟骨退化[46]。目前OA 治療手段包括減肥、物理治療、口服藥物治療、關(guān)節(jié)腔注射治療和關(guān)節(jié)置換術(shù)。在日常生活中可以通過鍛煉、減肥并使用矯形器輔助減輕機械應(yīng)力對關(guān)節(jié)的影響[47]。物理治療包括運動、電療、針灸、超聲波和冷熱療法等，或是以軟膏、藥膏外敷和食用含高濃度膠原和氨基糖的膳食治療OA，以緩解疼痛、改善炎癥和提高關(guān)節(jié)靈活性[48-50]。OA 患者在發(fā)病初期主要采用運動療法，通過運動來增加膝關(guān)節(jié)周圍肌肉的穩(wěn)定性，每周至少進行2 次監(jiān)督治療，6 周后觀察患者癥狀是否得到改善[51]。

藥物治療是臨床治療的一線方案，通過非甾體抗炎藥（nonsteroidal antiinflammatory drugs,NSAIDs）、糖皮質(zhì)激素、阿片類藥物和細胞因子抑制劑干預(yù)減少關(guān)節(jié)炎癥，改善疼痛癥狀。慢作用藥物包括NSAIDs、透明質(zhì)酸、D-氨基葡萄糖硫酸鹽和雙醋瑞因，在減輕疼痛、緩解癥狀、改善體征及增強活動能力方面取得良好治療效果，但也存在一些胃腸道反應(yīng)和長期應(yīng)用造成的潛在不良反應(yīng)[52]。糖皮質(zhì)激素具有強大的抗炎和免疫抑制作用，可以抑制炎癥細胞積聚、吞噬和中性粒細胞超氧化物的產(chǎn)生，阻止炎癥介質(zhì)合成和分泌，保護關(guān)節(jié)軟骨的同時刺激軟骨細胞分化，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射起效快，早期緩解疼痛能達到3 周左右[53]。但是，糖皮質(zhì)激素在使用過程中也存在不良反應(yīng)，如減少膠原合成、抑制細胞增殖、誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和減少細胞活力等[54]。另外，細胞因子治療包括抗TNF-α 等促炎細胞因子的抗體或使用IL-4、IL-10 和TNF-β 等抗炎細胞因子[53,55]。細胞因子抑制劑可以調(diào)控與軟骨降解有關(guān)的細胞因子IL-1，由中性粒細胞等免疫細胞產(chǎn)生[56]。研究表明，IL-1 受體拮抗劑IL-1Rα 可緩解骨關(guān)節(jié)炎癥狀，減少骨溶解和骨隧道擴大，減緩疾病進展[57-58]，然而，IL-1 阻斷劑對OA 止疼效果不顯著[59-60]。尚需對細胞因子治療進一步研究，明確在OA 中的適用性問題。

此外，Caspase 抑制劑已在體外研究中證實與OA 軟骨和骨骼病變的基因序列有關(guān)。骨形成蛋白（BMP）可以導(dǎo)致缺損的關(guān)節(jié)軟骨再生，改善新軟骨和關(guān)節(jié)表面軟骨之間的相互作用，也可能對KOA 的治療有益[61]。當(dāng)晚期KOA 物理療法和藥物干預(yù)無效時，則需行手術(shù)治療。手術(shù)方案包括關(guān)節(jié)鏡下灌洗、剃須、清創(chuàng)術(shù)、微骨折術(shù)和關(guān)節(jié)置換術(shù)，此外還有自體軟骨細胞或軟骨細胞移植術(shù)[49]。研究發(fā)現(xiàn)，可使用抗微生物中性粒細胞提取物調(diào)控中性粒細胞移植術(shù)后的反應(yīng)[46]。因此中性粒細胞在骨和軟骨移植術(shù)后的作用，具有一定研究前景。

5 結(jié)語

KOA 作為一種世界性的疾病，伴隨著肌骨損傷患病率、人口老齡化和肥胖率的上升，越來越多的人被診斷為KOA。中性粒細胞在KOA 滑液中調(diào)控促炎-抑炎細胞因子分泌，反映了關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)與降解過程中的動態(tài)平衡，因此中性粒細胞在KOA 微環(huán)境的動態(tài)平衡中起到重要作用，有望成為OA 治療的熱門領(lǐng)域。