ASXL3基因在前列腺癌中的表達(dá)

張晉輝，劉夢(mèng)洋，崔金龍，任一鳴，蔡誼，明道靖，任學(xué)群，袁帥

1.河南大學(xué)淮河醫(yī)院普外科（河南開封 475000）

2.武漢大學(xué)中南醫(yī)院循證與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心（武漢 430071）

3.武漢大學(xué)中南醫(yī)院泌尿外科（武漢 430071）

前列腺癌是男性最常見的惡性腫瘤之一，也是全球癌癥死亡的主要原因之一[1]。相對(duì)于歐美發(fā)達(dá)國(guó)家，亞洲地區(qū)前列腺癌發(fā)病率較低[2-3]，然而，近年來我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，已逐漸演變?yōu)橥{我國(guó)老年男性健康的重要疾病[4-5]。因此，尋找新的前列腺癌生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)迫在眉睫。

ASXL（Additional sex combs-like）基因家族屬于表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)因子之一[6]。該家族成員參與形成Trithorax-group（TrxG）蛋白和Polycombgroup（PcG）蛋白復(fù)合物，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮調(diào)控作用。TrxG 蛋白和PcG 蛋白在轉(zhuǎn)錄中分別起到激活和抑制作用，通過形成不同的復(fù)合物，維持關(guān)鍵發(fā)育調(diào)控基因的特異性轉(zhuǎn)錄[7]。ASXL3 能夠與PcG 蛋白形成復(fù)合物，在發(fā)育過程中維持同源基因的抑制狀態(tài)，還可能通過組蛋白的甲基化引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化[8]。ASXL3基因突變可以引起B(yǎng)ainbridge-Ropers 綜合征和自閉癥[9-10]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，ASXL3基因在多種癌癥中發(fā)揮重要作用，例如ASXL3 與BRD4 結(jié)合形成的BAP1 復(fù)合物能夠控制小細(xì)胞肺癌中增強(qiáng)子的活性[11]。此外，在前列腺癌中，循環(huán)游離DNA 中的ASXL3基因甲基化改變可能是神經(jīng)內(nèi)分泌性前列腺癌的診斷標(biāo)志物[12-13]。

本研究通過探索ASXL3在前列腺癌中的表達(dá)及其對(duì)患者預(yù)后的影響，并分析ASXL3在前列腺癌中可能發(fā)揮的調(diào)控作用，以及與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的關(guān)系。此外，還通過qRT-PCR 對(duì)前列腺癌細(xì)胞系中ASXL3mRNA 的表達(dá)進(jìn)行初步驗(yàn)證，旨在為前列腺癌治療提供新的靶點(diǎn)，并為探尋其發(fā)病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人正常前列腺基質(zhì)永生化細(xì)胞WPMY-1 以及前列腺癌細(xì)胞系（LNCaP、PC-3 和DU145）均來源于上海中科院細(xì)胞庫(kù)，C4-2 來源于武漢普諾賽生命科技有限公司。WPMY-1 細(xì)胞在含有5% FBS的DMEM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，LNCaP、C4-2 細(xì)胞在含有10% FBS 的1640 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，PC-3 細(xì)胞在含有10% FBS 的F-12K 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，DU145 細(xì)胞在含有10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，以上培養(yǎng)液均購(gòu)自Gibco 公司；培養(yǎng)液中添加青霉素-鏈霉素-兩性霉素B溶液（碧云天生物技術(shù)有限公司）。所有細(xì)胞在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技公司）中培養(yǎng)2～3 代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞（約1×106個(gè)）進(jìn)行后續(xù)的RNA 提取和qRT-PCR。

1.2 RNA的提取和qRT-PCR

使用 Eastep? Super 總RNA提取試劑盒（Promega 公司）對(duì) WPMY-1、LNCaP、C4-2、PC-3、DU145 細(xì)胞進(jìn)行RNA 提取。隨后， 采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara Bio 公司） 將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。 使用Genious 2X SYBR Green Fast qPCR Mix（ABclonal 公司）進(jìn)行qPCR 檢測(cè)。GAPDH的正向引物：5'-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3'， 反向引物：5'-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3'。ASXL3的正向引物：5'-TTACCGTGGCCTCTGGTTTC-3'，反向引物：5'-CCGTACAGACGATGCTACCC-3'。

1.3 差異表達(dá)及臨床特征分析

使用R（version 4.3.2）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)提取和分析。使用TCGAbiolinks 軟件包（version 2.30.0）下載TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.cancer.gov/ccg/research/genome-sequencing/tcga）中前列腺腫瘤樣本及正常組織的RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)及臨床信息數(shù)據(jù)。利用dplyr 軟件包（version 1.1.4）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合和預(yù)處理，比較ASXL3mRNA 在正常樣本與腫瘤組織中的表達(dá)情況以及不同臨床特征中的表達(dá)變化情況，ggplot2（version 3.4.4）和gghalves 軟件包（version 0.1.4）用于繪圖 ，使用ggsignif 包（version 0.6.4）通過t檢驗(yàn)比較不同分組之間的差異，并繪制顯著性標(biāo)記，探討其與Gleason 評(píng)分、TP53 突變、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及年齡的關(guān)系。

1.4 生存分析

使用GEPIA2（http://gepia2.cancer-pku.cn/#index）工具分析ASXL3的表達(dá)與前列腺癌總生存期的關(guān)系[14]。

1.5 相互作用蛋白分析

使用STRING Version 12.0（https://cn.stringdb.org/）[15]探索ASXL3最為相關(guān)的基因構(gòu)建蛋白作用網(wǎng)絡(luò)及其他相關(guān)信息。

1.6 GO和KEGG分析

使用R 軟件通過Pearson 相關(guān)分析篩選出在TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中與ASXL3最相關(guān)的基因（r＞0.5，P＜0.05）。選取該基因集及在STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中與ASXL3 最為相關(guān)的前50 個(gè)相互作用蛋白分別在DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）上進(jìn)行GO 和KEGG 分析，使用ggplot2 軟件包（version 3.4.4）進(jìn)行繪圖。在GO 功能富集分析中，分別從生物學(xué)過程（biological process, BP）、細(xì)胞組成（cellular component, CC）、分子功能（molecular function, MF）三個(gè)方面進(jìn)行研究。使用R 軟件分析ASXL3mRNA表達(dá)與其它基因的相關(guān)性，并采用Pearson 相關(guān)性系數(shù)篩選cor 相關(guān)系數(shù)＞0.5 且P值＜0.05 的基因。

1.7 免疫浸潤(rùn)分析

使用TIMER（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）分析前列腺癌中ASXL3 與腫瘤的純度、B細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的相關(guān)性[16-17]。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用R 語(yǔ)言分析ASXL3mRNA 的差異表達(dá)以及與臨床特征的相關(guān)性，通過t檢驗(yàn)計(jì)算統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。利用SPSS 22.0 進(jìn)行正常及前列腺癌細(xì)胞系中ASXL3mRNA 的表達(dá)分析，采用t檢驗(yàn)計(jì)算統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ASXL3 mRNA在前列腺癌組織中的表達(dá)分析

從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了554 例RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)，表達(dá)差異分析結(jié)果顯示，ASXL3mRNA 水平在前列腺癌組織中的表達(dá)顯著低于正常組織（圖1）。

圖1 ASXL3 mRNA在正常組織和前列腺癌組織中的表達(dá)差異Figure 1. The difference expression of ASXL3 between normal and prostate tumor tissues

2.2 ASXL3 mRNA表達(dá)與前列腺癌患者臨床特征的關(guān)系

ASXL3mRNA 的表達(dá)與Gleason 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，8～10 分的腫瘤樣本中ASXL3mRNA 的表達(dá)顯著低于6～7 分患者（P＜0.05）（圖2-A）。與TP53 未突變患者相比，TP53 突變患者中ASXL3mRNA 的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）（圖2-B）。在區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N1）患者組織中ASXL3mRNA 水平顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N0）患者（P＜0.05）（圖2-C）。此外，ASXL3mRNA 的表達(dá)在不同年齡（41～60 歲vs.61～80 歲）患者中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2-D）。

圖2 ASXL3 mRNA表達(dá)水平與前列腺癌患者臨床特征的相關(guān)性分析Figure 2. Correlation analysis between ASXL3 mRNA expression level and clinical characteristics in prostate cancer patients

2.3 ASXL3 mRNA表達(dá)與前列腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

根據(jù)ASXL3mRNA 表達(dá)水平的中位數(shù)，患者被分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。結(jié)果顯示，高表達(dá)ASXL3mRNA 組患者的總生存期顯著優(yōu)于低表達(dá)組患者（HR=0.14，P＜0.05）（圖3）。提示ASXL3可作為前列腺癌的預(yù)后生物標(biāo)志物。

圖3 ASXL3 mRNA表達(dá)與前列腺癌患者總生存期的關(guān)系Figure 3. The relationship between ASXL3 mRNA expression and overall survival in prostate cancer patients

2.4 ASXL3相互作用蛋白及功能分析

蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)結(jié)果展示了前20 位最相關(guān)的互作蛋白（圖4-A），評(píng)分前4 位分別為BAP1（0.917）、EZH2（0.810）、ASXL2（0.786）、BRD4（0.773）。GO 功能富集分析顯示，這些蛋白在 BP 方面主要富集在染色質(zhì)重塑（GO:0006338, chromatin remodeling）、RNA 聚合酶II對(duì)轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)節(jié)（GO: 0000122, negative regulation of transcription from RNA polymerase II promoter）、染色質(zhì)組織（GO: 0006325, chromatin organization）（圖4-B）；在CC 方面主要富集在PcG 蛋白復(fù)合體（GO: 0031519, PcG protein complex）、PRC1復(fù)合體（GO: 0035102, PRC1 complex）、核質(zhì)（GO: 0005654, nucleoplasm）（圖4-C）；在MF 方面主要富集在核染色質(zhì)結(jié)合（GO:0003682, chromatin binding）、組蛋白結(jié)合（GO:0042393, histone binding）、 甲基化組蛋白結(jié)合（GO: 0035064, methylated histone binding）（圖 4-D）。在KEGG 通路分析中，ASXL3及其相關(guān)互作蛋白主要富集在多梳蛋白抑制復(fù)合物（hsa03083, polycomb repressive complex）、干細(xì)胞多能性調(diào)控通路（hsa04550, signaling pathways regulating pluripotency of stem cells）、ATP 依賴的染色質(zhì)重塑（hsa03082, ATP-dependent chromatin remodeling）（圖4-E）。提示ASXL3 及其相互作用蛋白可能在染色質(zhì)的重塑以及PcG 復(fù)合體功能中發(fā)揮重要作用。

圖4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析及GO、KEGG富集分析Figure 4. Protein interaction network analysis and GO and KEGG enrichment analysis

2.5 ASXL3 mRNA表達(dá)相關(guān)基因的GO、KEGG 通路分析

首先利用TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出與ASXL3mRNA 表達(dá)正相關(guān)的基因（r＞ 0.5，P＜ 0.05），隨后進(jìn)行GO 功能富集和KEGG 通路分析。結(jié)果顯示，ASXL3mRNA 表達(dá)相關(guān)基因GO 功能富集和KEGG 通路分析顯示，ASXL3 的正相關(guān)基因在BP 方面主要富集在JAK-STAT 級(jí)聯(lián)正向調(diào)節(jié)（GO:0046427, positive regulation of JAK-STAT cascsde）、肽代謝過程（GO: 0006518, peptide metabolic process）、復(fù)制叉處理（GO: 0031297, replication fork processing）（圖5-A）；在CC 方面主要富集在核質(zhì)（GO: 0005654, nucleoplasm）、受體復(fù)合物（GO:0043235, receptor complex）、 胞漿（GO: 0005829,cytosol）（圖5-B）；在MF 方面主要富集在蛋白質(zhì)結(jié)合（GO: 0005515, protein binding）、RNA 結(jié)合（GO: 0003723, RNA binding）、大分子復(fù)合物的結(jié)合（GO: 0044877, macromolecular complex binding）（圖5-C）。而在KEGG 通路分析中，ASXL3mRNA 的正相關(guān)基因主要富集在ECM 受體相互作用（hsa04512, ECM-receptor interaction）、多巴胺能突觸（hsa04728，dopaminergic synapse）、光傳導(dǎo)（hsa04744，phototransduction）、內(nèi)吞作用（hsa04144, endocytosis）（圖5-D）。

圖5 ASXL3 mRNA表達(dá)相關(guān)基因的GO分析和KEGG通路分析Figure 5. GO analysis and KEGG pathway analysis of ASXL3 mRNA expression related genes

2.6 ASXL3 mRNA表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性分析

ASXL3mRNA 表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性分析顯示，ASXL3mRNA 表達(dá)與腫瘤的純度（P＜0.01）呈負(fù)相關(guān)，而與B 細(xì)胞（P＜0.01）、CD8+T 細(xì)胞（P＜0.01）、CD4+T 細(xì)胞（P＜0.01）、巨噬細(xì)胞（P＜0.01）、中性粒細(xì)胞（P＜0.01）、樹突狀細(xì)胞（P＜0.01）的浸潤(rùn)呈正相關(guān)（圖6）。提示ASXL3 可能參與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)過程。

圖6 前列腺癌中ASXL3 mRNA表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性Figure 6. Correlation between ASXL3 mRNA expression and immune cells infiltrating in prostate cancer

2.7 ASXL3 mRNA在前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)

qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，與WPMY-1 相比，ASXL3mRNA 在前列腺癌細(xì)胞系LNCaP、C4-2、PC-3、DU145 中顯著低表達(dá)（圖7），P＜0.01。

圖7 ASXL3 mRNA在前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平Figure 7. The expression levels of ASXL3 mRNA in prostate cancer cell lines

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織中ASXL3mRNA 表達(dá)水平顯著低于正常組織，高ASXL3mRNA 表達(dá)與患者總生存期正相關(guān)，表明ASXL3可能參與抑制前列腺癌的發(fā)生發(fā)展。

ASXL3作為一種重要的表觀遺傳因子，可以作為BAP1 復(fù)合體的一部分，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞中H2A 的去泛素化水平或解除染色質(zhì)上的抑制狀態(tài)，進(jìn)而影響基因的表達(dá)[18-20]。ASXL3在肺癌中發(fā)揮著重要的作用，其編碼的蛋白可將BRD4 橋接到BAP1 復(fù)合物進(jìn)而控制小細(xì)胞肺癌的增強(qiáng)子活性[11]，同時(shí)其被證明是人呼吸道上皮細(xì)胞中的一種新型多能性因子，可作為小細(xì)胞肺癌的潛在靶點(diǎn)[21-22]。在前列腺癌中，有研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)內(nèi)分泌性前列腺癌中可檢測(cè)到循環(huán)游離DNA 中的ASXL3高甲基化，有望成為神經(jīng)內(nèi)分泌性前列腺癌的潛在靶點(diǎn)[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，ASXL3mRNA表達(dá)與患者年齡無相關(guān)性，但與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TP53 突變相關(guān)。同時(shí)，Gleason 評(píng)分為6～7 分的患者ASXL3mRNA 表達(dá)水平顯著高于8～10 分的患者，表明ASXL3可能作為前列腺癌惡性進(jìn)展的標(biāo)志物。STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示最可能與ASXL3 相互作用的蛋白，包括BAPl、EZH2、ASXL2 等。已有研究表明ASXL3 可能與BRD4 和BAP1 復(fù)合物相互作用，調(diào)控增強(qiáng)子活性，為治療ASCL1 依賴性小細(xì)胞肺癌提供潛在靶點(diǎn)[11,22]。也有研究表明ASXL 家族可以與BAP1、EZH2、NCOA1和核受體等共同調(diào)節(jié)表觀遺傳[23]，但ASXL3如何參與并調(diào)節(jié)表觀遺傳尚未可知，仍需更深入的研究。此外，GO 和KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)ASXL3正相關(guān)基因主要富集在JAK-STAT 級(jí)聯(lián)的正向調(diào)控、蛋白質(zhì)結(jié)合和ECM 受體相互結(jié)合等過程，提示ASXL3可能在這些通路中發(fā)揮重要作用。

免疫系統(tǒng)是人體重要的防御系統(tǒng)，對(duì)于預(yù)防包括癌癥在內(nèi)的多種疾病至關(guān)重要。免疫細(xì)胞是免疫系統(tǒng)重要的組成部分，可以分為固有性免疫應(yīng)答細(xì)胞和適應(yīng)性免疫應(yīng)答細(xì)胞，主要的免疫細(xì)胞有B 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。由于不同腫瘤中免疫細(xì)胞的數(shù)量并不相同，有學(xué)者提出依據(jù)免疫細(xì)胞的多少將腫瘤分為“冷腫瘤”和“熱腫瘤”[24]。在“熱腫瘤”中，存在更多的免疫細(xì)胞可以使得腫瘤被免疫系統(tǒng)識(shí)別和攻擊，而“冷腫瘤”內(nèi)存在極少的腫瘤細(xì)胞使得腫瘤無法被免疫系統(tǒng)識(shí)別，這為腫瘤的免疫治療帶來了極大的難度。前列腺癌為“冷腫瘤”[25]，其在發(fā)展過程中難以被免疫系統(tǒng)識(shí)別和攻擊，治療較為困難[26]，但目前研究仍在探尋有效的針對(duì)前列腺癌免疫治療的方法。本研究中，ASXL3mRNA 與這些免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)呈正相關(guān)，這可能為前列腺癌免疫治療提供新的思路，但仍需更為透徹地研究ASXL3mRNA與免疫浸潤(rùn)之間的關(guān)系，探討其作為免疫治療靶點(diǎn)的可行性。此外本研究通過qRT-PCR 技術(shù)驗(yàn)證了ASXL3mRNA 在前列腺癌細(xì)胞系中的低水平表達(dá)，為后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

綜上，ASXL3在前列腺癌中低表達(dá)且與患者預(yù)后顯著相關(guān)，提示ASXL3有望成為潛在的前列腺癌生物標(biāo)志物。同時(shí)，ASXL3mRNA 與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)呈正相關(guān)，可能為前列腺癌治療提供新的靶點(diǎn)。