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    氟吡菌酰胺對非靶標生物的急性毒性效應(yīng)

    2024-04-08 01:46:36劉新剛崔少青何明遠
    現(xiàn)代農(nóng)藥 2024年1期
    關(guān)鍵詞:染毒靶標酰胺

    吳 遲,李 敏,劉新剛,崔少青,孫 田,何明遠*

    (1.中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室,北京 100193;2.廣西思浦林科技有限公司,南寧 530001)

    氟吡菌酰胺(fluopyram)是德國拜耳作物科學公司開發(fā)的苯甲酰胺類殺菌劑和殺線蟲劑,其作用機理為抑制病原菌和線蟲的琥珀酸脫氫酶的活性,阻礙線粒體呼吸,干擾細胞的分裂和生長,進而防止真菌病害及線蟲的發(fā)生[1]。

    目前酰胺類殺菌劑在全球的使用量逐年遞增,2016年,靶向琥珀酸脫氫酶的殺菌劑全球銷售額為17億美元,占全球農(nóng)藥市場的3%[2]。其中,氟吡菌酰胺具有內(nèi)吸性強、高效、廣譜等優(yōu)點,已在歐盟、美國、中國等國家和地區(qū)登記使用,可有效防治黃瓜、番茄等多種作物線蟲、白粉病、靶斑病、炭疽病[3]。宋益民等[4]在番茄田施用氟吡菌酰胺產(chǎn)品,對根結(jié)線蟲的防效最高可達75%,并使番茄增產(chǎn);韓瑞華等[5]研究發(fā)現(xiàn),在甘薯田施用41.7%氟吡菌酰胺懸浮劑可促進甘薯的生長,對甘薯黑斑病、軟腐病和線蟲病的防效分別達82.7%、75.6%和81.13%。目前,關(guān)于氟吡菌酰胺的研究除防治效果外,較多關(guān)注于其毒性,研究對象以鼠類為主。氟吡菌酰胺會通過干擾雌烷受體和雄烷受體基因的表達,造成雌鼠的肝臟細胞癌變[6];雄鼠會產(chǎn)生過量的甲狀腺激素并形成甲狀腺腫瘤[7]。但是農(nóng)藥在使用過程中不可避免地會流入環(huán)境中,對非靶標生物產(chǎn)生毒害作用。目前關(guān)于氟吡菌酰胺對環(huán)境有益非靶標生物的毒性效應(yīng)的研究成果非常有限,因此有必要開展相關(guān)研究評價其環(huán)境安全性。

    本文以97%氟吡菌酰胺原藥為試驗藥劑,分別測定8種非靶標生物(表1)的急性毒性,為氟吡菌酰胺的合理使用提供數(shù)據(jù)支撐。

    表1 供試生物

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    1.1.1 供試藥劑

    97%氟吡菌酰胺原藥由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所提供。

    1.1.2 試驗儀器

    紫外-可見分光光度計,舜宇恒平UV-2600;立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安LDZM-60KCS;電子天平,梅特勒-托利多ME104/02;可調(diào)式移液器,10~100 μL、20~200 μL、100~1 000 μL、500~5 000 μL;超聲波清洗器,昆山KQ-250DE;便攜式溶解氧測定儀,衡欣AZ8403型;溫濕度計,山東仁科RS-WS-WIFI-Y4;數(shù)字式照度表,TES-1330A;便攜式pH計,衡欣AZ9861型;人工氣候箱,寧波賽福PRX-350B;不銹鋼鳥籠;蜂盒;量筒;容量瓶;燒杯等。

    1.2 試驗方法

    氟吡菌酰胺對8種非靶標生物的急性毒性試驗參照GB/T 31270—2014《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》進行,同時對水生生物試驗濃度進行檢測。

    1.2.1 非靶標生物急性毒性試驗

    (1)日本鵪鶉急性徑口毒性試驗:選用體重約為100 g的日本鵪鶉為試驗用鳥,試驗開始前12 h禁食。采用膠囊法進行經(jīng)口染毒,設(shè)置有效成分質(zhì)量分數(shù)為2.00×103mg/kg(b.w.)的試驗處理,每個膠囊的平均裝藥量為0.206 g,每只鵪鶉灌喂1個裝藥膠囊,染毒后的鵪鶉放置于鳥籠中,2 h后正常喂食。同時設(shè)置空白對照(灌喂1顆空膠囊),各處理組重復10只鵪鶉,雌雄各5只。試驗周期為7 d,試驗溫度(26±1)℃,光暗周期12 h/12 h(光照/黑暗)。藥劑處理8、24、48、72、96、120、144和168 h時分別觀察試驗用鳥的中毒及死亡情況,計算半致死劑量LD50(7 d)。

    (2)意大利蜜蜂急性經(jīng)口毒性試驗:使用二甲基亞砜和吐溫-80助溶氟吡菌酰胺,用50%的蔗糖水配制試驗藥液,以121 μg/蜂(有效成分用量)進行試驗處理。試驗用蜂麻醉后移入蜂籠中,將裝有藥液(200 μL)的飼喂管懸掛在蜂籠上,待蜜蜂取食藥液并消耗完畢后取出飼喂管,換50%的蔗糖水正常飼喂,根據(jù)實際消耗藥劑重量計算染毒劑量。同時設(shè)置空白對照和溶劑對照,各處理組3個重復,每重復10只蜜蜂。試驗周期為48 h,試驗溫度(25±1)℃,全程黑暗。染毒24和48 h分別觀察蜜蜂的中毒及死亡情況,并計算半致死劑量LD50(48 h)。

    (3)意大利蜜蜂急性接觸毒性試驗:使用丙酮助溶氟吡菌酰胺并配制成質(zhì)量濃度為5.00×104mg/L的儲備液。將蜜蜂麻醉后,在每只蜜蜂的中胸背板點滴2 μL的儲備液,得到100 μg/蜂的試驗處理。在各處理蜜蜂恢復前裝入蜂籠,飼喂適量的糖水。同時設(shè)置空白對照和溶劑對照,各處理組3個重復,每重復10只蜂。試驗周期為48 h,試驗溫度(25±1)℃,全程黑暗。染毒24和48 h分別觀察密蜂的中毒及死亡情況,并計算半致死劑量LD50(48 h)。

    (4)家蠶急性毒性試驗(浸葉法):使用二甲基亞砜和吐溫-80助溶氟吡菌酰胺,并配制成質(zhì)量濃度分別為400、460、529、608、700和805 mg/L的試驗藥液,將(5.0±0.5)g的桑葉浸泡在50 mL藥液中,藥液在葉片表面均勻分布后陰干。葉片放至12 cm的培養(yǎng)皿中,接入2齡起蠶。同時設(shè)置空白對照和溶劑對照,各處理組3個重復,每重復20頭蠶。試驗周期為96 h,試驗溫度(25±1)℃、濕度(80±5)%。染毒24、48、72和96 h分別觀察試驗用蠶的中毒及死亡情況,并計算半致死濃度LC50(96 h)。

    (5)玉米螟赤眼蜂急性毒性試驗:用丙酮溶解并配制成質(zhì)量濃度為295 mg/L的氟吡菌酰胺藥液。采用藥膜法,添加0.700 mL的試驗藥液于螺口瓶中,用烤腸機滾勻吹干成藥膜,得到6.26 μg/cm2的試驗處理,黑暗條件下備用。將羽化后48 h的玉米螟赤眼蜂接入藥膜管中,封口(60±2)min后,將赤眼蜂轉(zhuǎn)入無藥的螺口瓶中,飼喂適量的10%蜂蜜水并用黑棉布封口。同時設(shè)置空白對照和溶劑對照,每管100頭赤眼蜂。試驗周期為24 h,試驗溫度(25±1)℃,濕度(75±5)%,全程黑暗。染毒24 h觀察赤眼蜂的死亡情況,根據(jù)半抑制率LR50(24 h)計算安全系數(shù)。

    (6)赤子愛勝蚓急性毒性試驗:用丙酮溶解氟吡菌酰胺原藥并配制成質(zhì)量濃度為1.00×104mg/L的儲備液。10 g石英砂中加入14.5 mL儲備液,混合均勻放置通風櫥使丙酮全部揮發(fā)后,與1 490 g人工土壤混合均勻,得到質(zhì)量分數(shù)為100 mg/kg的試驗用土。同時設(shè)置空白對照和溶劑對照,各處理組3個重復,每重復10條蚯蚓。試驗周期為14 d,試驗溫度(20±1)℃,濕度(80±5)%,全程光照,光照強度(600±50)lx。染毒7和14 d分別觀察蚯蚓的中毒及死亡情況,并計算半致死濃度LC50(14 d)。

    (7)斑馬魚急性毒性試驗:用曝氣水溶解氟吡菌酰胺原藥并配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的試驗藥液,每24 h全部試驗藥液更換1次。同時設(shè)置空白對照,不設(shè)置重復,各處理組7尾魚。試驗周期為96 h,試驗溫度(22±1)℃,pH為8.3±0.1,溶解氧含量(90±5)%,光暗周期16 h/8 h(光照/黑暗),水硬度180 mg/L(以CaCO3計)。在染毒后24、48、72和96 h分別觀察斑馬魚的中毒及死亡情況,并計算半致死濃度LC50(96 h)。

    (8)大型溞急性活動抑制試驗:用曝氣水溶解氟吡菌酰胺原藥并配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的儲備液,設(shè)置26.9、35.0、45.5、59.2、76.9和100 mg/L 6個試驗處理,每24 h全部試驗藥液更換1次。同時設(shè)置空白對照,各處理組4個重復,每重復5只溞。試驗周期為48 h,試驗溫度(20±1)℃、pH8.3±0.1,光暗周期16 h/8 h(光照/黑暗),水硬度180 mg/L(以CaCO3計)。在染毒后24和48 h分別觀察試驗用溞的中毒及死亡情況,并計算半數(shù)抑制濃度EC50(48 h)。

    (9)羊角月牙藻生長抑制試驗:用BG11培養(yǎng)基溶解氟吡菌酰胺原藥并配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的儲備液,設(shè)置4.68、6.79、9.84、14.3、20.7和30.0 mg/L 6個試驗處理,使處理的藻細胞初始濃度為5.00×104個/mL,各處理組染毒藻液轉(zhuǎn)入250 mL的三角瓶中,并置于智能人工氣候箱培養(yǎng)72 h。同時設(shè)置空白對照,各處理組3個重復,每重復90 mL。試驗周期為72 h,試驗溫度(23±1)℃,pH為8.02±0.5,全程光照,光照強度(7 100±100)lx。在染毒后24、48和72 h分別觀察記錄各錐形瓶內(nèi)藻細胞的數(shù)量,并根據(jù)生物量生長抑制百分率和生長率抑制百分率來分別計算EyC50(72 h)和ErC50(72 h)。

    1.2.2 水生分析方法的建立

    在斑馬魚、大型溞和羊角月牙藻的急性毒性試驗中,分別收集氟吡菌酰胺在羊角月牙藻急性毒性試驗開始0和72 h的藻液、斑馬魚和大型溞急性毒性試驗開始0和24 h的試驗藥液進行測定,若氟吡菌酰胺的濃度變化超過20%,則使用實際濃度表示結(jié)果,反之使用理論濃度。

    1.2.2.1 提取凈化

    將收集的試驗藥液取2 mL至離心管中,加入2 mL乙腈,充分混勻,2 500 r/min振蕩2 min,收集混合液體過0.22 μm有機濾膜,待測。

    1.2.2.2 分析條件

    采用高效液相色譜儀(島津LC-40 DXR)對氟吡菌酰胺進行分析檢測。儀器條件為:色譜柱Shim-pack GIST C18(100 mm×2.1 mm,2 μm),進樣體積5 μL,柱溫箱40℃,流動相0.1%甲酸水+乙腈(體積比35∶65),流速0.3 mL/min,采集時間4.5 min,檢測器類型為紫外檢測器SPD-40,檢測波長210 nm。

    1.2.2.3 標準曲線

    在1.2.2.2部分描述的儀器分析方法條件下,分析檢測質(zhì)量濃度為0.100、0.500、1.00、5.00、10.0、50.0、80.0、100、150 mg/L的標樣溶液,擬合峰面積和溶液濃度的標準曲線。

    1.2.2.4 添加回收和精密度

    分別向魚和溞培養(yǎng)基(去氯自來水)中添加氟吡菌酰胺標準品,配制質(zhì)量濃度為1.50和120 mg/L的溶液;向藻類培養(yǎng)基(BG11)中添加氟吡菌酰胺標準品,配制質(zhì)量濃度為0.500和50.0 mg/L的溶液,各質(zhì)量濃度均設(shè)置5個重復,測定濃度,計算回收率。按照3倍信噪比(S/N)計算得出氟吡菌酰胺在魚和溞培養(yǎng)基中的檢出限為2.15×10-2mg/L,定量限為最低添加濃度1.50 mg/L;在藻培養(yǎng)基中檢出限為2.21×10-2mg/L,定量限為最低添加濃度0.500 mg/L。

    1.3 數(shù)據(jù)分析與毒性劃分

    使用SPSS 25.0軟件分析氟吡菌酰胺對非靶標生物的急性毒性結(jié)果以及95%置信區(qū)間,毒性等級按《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》標準進行劃分。

    2 結(jié)果分析

    2.1 水生實測濃度

    氟吡菌酰胺在去氯自來水和BG11培養(yǎng)基中的回收率為94.6%~105.0%(表2)。在去氯自來水中的檢出限為2.15×10-2mg/L,定量限為1.50 mg/L;在BG11培養(yǎng)基中的檢出限為2.21×10-2mg/L,定量限為0.500 mg/L。

    表2 氟吡菌酰胺的平均添加回收率

    試驗結(jié)果顯示,氟吡菌酰胺在水中的實測濃度(表3)均低于理論濃度的80%,因此,采用實際濃度計算氟吡菌酰胺對水生生物的急性毒性。

    表3 氟吡菌酰胺在水生急性毒性試驗中的實測濃度

    2.2 急性毒性結(jié)果

    氟吡菌酰胺對非靶標生物的急性毒性測定結(jié)果見表4。

    表4 氟吡菌酰胺對非靶標生物的急性毒性

    氟吡菌酰胺對日本鵪鶉半致死劑量大于2.00×103mg/kg(b.w.),受試鵪鶉未出現(xiàn)死亡和明顯的中毒癥狀,毒性等級為低毒;對意大利蜜蜂經(jīng)口半致死劑量大于112 μg/蜂、接觸半致死劑量大于100 μg/蜂,受試蜜蜂未出現(xiàn)死亡和明顯的中毒癥狀,毒性等級為低毒;家蠶半致死濃度為702 mg/L,受試家蠶出現(xiàn)拒食、身體變軟、身體扭曲、吐液、側(cè)倒、假死、生長緩慢等中毒癥狀,毒性等級為低毒;對玉米螟赤眼蜂半抑制率大于6.26 μg/cm2,受試赤眼蜂未出現(xiàn)死亡和明顯的中毒癥狀,風險性等級為低風險;赤子愛勝蚓半致死濃度大于100 mg/kg,受試蚯蚓未出現(xiàn)死亡和明顯的中毒癥狀,毒性等級為低毒;斑馬魚半致死濃度大于15.8 mg/L,受試魚未出現(xiàn)死亡和明顯的中毒癥狀,毒性等級為低毒;大型溞半數(shù)抑制濃度為7.01 mg/L,受試溞出現(xiàn)游動能力減弱、附肢輕微顫動、原地轉(zhuǎn)圈游動等中毒癥狀,毒性等級為中等毒;羊角月牙藻EyC50(72 h)為0.675 mg/L、ErC50(72 h)為2.41 mg/L,受試藻液出現(xiàn)無色透明、顏色較淺等抑制效應(yīng),毒性等級為中等毒。

    3 結(jié)語

    非靶標生物在環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著十分重要的作用,因此國內(nèi)外均非常重視農(nóng)藥對非靶標生物毒性風險的相關(guān)研究。本文利用不同的方法測定了氟吡菌酰胺對8種非靶標生物的急性毒性,為氟吡菌酰胺的應(yīng)用補充了生態(tài)毒理學數(shù)據(jù)。研究結(jié)果表明,氟吡菌酰胺對陸生生物和水生生物斑馬魚的毒性等級為低毒,對水生大型溞和羊角月牙藻的毒性等級為中等毒,因此,氟吡菌酰胺在實際田間施用時應(yīng)注意對水溞等水生生物的保護,施藥時遠離水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū),避免在水體中清洗施藥用具。

    自科聚亞公司于1966年開發(fā)了第一個酰胺類殺菌劑以來,經(jīng)過幾十年的發(fā)展,酰胺類殺菌劑現(xiàn)有的代表性品種有甲霜靈、噻呋酰胺、環(huán)酰菌胺和氟唑菌苯胺等[8]。楊石有等[9]測定了噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺2種酰胺類殺菌劑對4種非靶標生物的急性毒性,結(jié)果表明,噻呋酰胺對意大利蜜蜂急性經(jīng)口、家蠶、赤子愛勝蚓、斑馬魚的毒性等級依次為中等毒、低毒、低毒和中等毒;環(huán)酰菌胺對意大利蜜蜂急性經(jīng)口、家蠶、赤子愛勝蚓、斑馬魚的毒性等級依次為中等毒、低毒、低毒和中等毒。顧林玲[10]研究發(fā)現(xiàn),氟唑菌苯胺對日本鵪鶉急性經(jīng)口、鯉魚、水溞、羊角月牙藻的毒性等級依次為低毒、高毒、中等毒和低毒。韓文浩等[11]測定了吡噻菌胺對3種水生非靶標生物的急性毒性,結(jié)果表明,吡噻菌胺對斑馬魚胚胎、大型溞、藻類的毒性等級均為中等毒。因此,根據(jù)文獻報道可知,與氟吡菌酰胺相比,其他酰胺類殺菌劑同樣對陸生生物的毒性較低,并對水生生物具有較高的毒性效應(yīng),但是氟吡菌酰胺對非靶標生物的毒性比多數(shù)酰胺類殺菌劑更低。因此,在殺菌廣譜、高效的酰胺類殺菌劑中,氟吡菌酰胺是對環(huán)境生物毒性較低的種類之一,本文為氟吡菌酰胺安全使用提供了有力的數(shù)據(jù)支撐。

    在評估農(nóng)藥施用于田間的風險時,除考慮對環(huán)境生物的毒性外,還應(yīng)根據(jù)施用量、施用方法和農(nóng)藥理化性質(zhì)等其他因素進行風險評估[12]。美國和歐盟早已開展了風險評估相關(guān)工作并建立了完整的評估體系,我國也在2016年發(fā)布了NY/T 2882—2016《農(nóng)藥登記環(huán)境風險評估指南》,促使了我國風險評估程序規(guī)范化的實現(xiàn)。農(nóng)藥對環(huán)境的風險分析包括暴露分析、效應(yīng)分析和風險表征三步驟,暴露分析是通過農(nóng)藥的施用量和施用方法等信息確定其在環(huán)境中的暴露濃度,效應(yīng)分析是通過農(nóng)藥對環(huán)境生物的急性或慢性毒性數(shù)據(jù)進行計算,風險表征是結(jié)合暴露分析和效應(yīng)分析的結(jié)果評估農(nóng)藥在田間施用的風險[13]。雖然,氟吡菌酰胺等酰胺類殺菌劑對環(huán)境生物的毒性較低,但應(yīng)根據(jù)藥劑的具體GAP信息判斷其對環(huán)境生物的安全性。

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