UPLC-HRMS法同時直接測定白酒中多種痕量呈香呈味物質(zhì)及衍生物含量

楊軍林，尹艷艷，尹延順，楊少娟，田棟偉，謝 丹，尤小龍，吳 成，胡建鋒，張德芹

（貴州習(xí)酒股份有限公司，貴州 遵義 564622）

白酒風(fēng)味是決定其品質(zhì)的重要因素，目前主要針對白酒中揮發(fā)性香氣物質(zhì)的研究較多[1-3]。但白酒作為固態(tài)發(fā)酵蒸餾的產(chǎn)物，同樣存在某些非揮發(fā)性物質(zhì)[4-5]。據(jù)文獻報道，非揮發(fā)性物質(zhì)的存在對于白酒的風(fēng)格特征同樣產(chǎn)生重要作用，它作為潛在的重要呈香呈味物質(zhì)，構(gòu)成了白酒口感的豐富性和復(fù)雜性；可與揮發(fā)性物質(zhì)產(chǎn)生相互作用，調(diào)節(jié)揮發(fā)性物質(zhì)的揮發(fā)性能，改變并協(xié)調(diào)白酒的香氣結(jié)構(gòu)，如調(diào)節(jié)放香強度與香氣持久性；非揮發(fā)性物質(zhì)還具有獨特和重要的生物活性功能和效果[4-7]。

有機酸類物質(zhì)是白酒的重要風(fēng)味物質(zhì)，其中有機酸的種類和含量不僅影響白酒發(fā)酵過程微生物的生長與繁殖，也影響酯類香氣物質(zhì)的合成。作為白酒中重要呈香呈味物質(zhì)，起著呈香、助香、減少刺激和緩沖平衡的作用，其含量及組成直接影響著白酒的風(fēng)味、品質(zhì)及飲后舒適度[8-9]。在白酒生產(chǎn)中關(guān)注較多的是難揮發(fā)性有機酸，且以乳酸為主的比例及其量化關(guān)系研究較多，研究方法通常為氣相色譜或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[10-11]；同樣，其他難揮發(fā)性有機酸也不易氣化，并且即使進行酯化衍生處理，有些也無法被有效解析[12]。因此，現(xiàn)階段主要采用高效液相色譜法及離子色譜法進行白酒中難揮發(fā)性有機酸的定性定量分析。

白酒中氨基酸主要來源于釀酒原料中蛋白質(zhì)酶降解、發(fā)酵過程中微生物的代謝及其發(fā)酵后微生物細胞自溶[13-14]。氨基酸對葡萄酒品質(zhì)有重要影響[15]，它也是黃酒中重要的營養(yǎng)成分和風(fēng)味前驅(qū)體[16-18]，同樣，白酒中氨基酸及其衍生物作為風(fēng)味前體物質(zhì)可能對其呈香呈味有重要影響[13]。其中，飲料酒中雜醇油主要是發(fā)酵過程中氨基酸脫氨基和脫羰基代謝產(chǎn)生，如正丙醇來自于蘇氨酸、異丁醇來自于纈氨酸、異戊醇來自于亮氨酸、2-苯乙醇來自于苯丙氨酸等。其次，在飲料酒發(fā)酵過程中氨基酸還與多種含氮化合物的形成相關(guān)，如吡嗪類化合物雜環(huán)氮原子來自α-氨基酸[19-20]。此外，白酒中生物胺與氨基酸也有一定聯(lián)系[21]，生物胺作為一類含氮的脂肪族、芳香族或雜環(huán)類化合物，主要通過氨基酸的脫羧、醛與酮的胺化及轉(zhuǎn)氨基作用產(chǎn)生，對動植物和微生物活性細胞有重要的生理作用，適量生物胺有助于機體正常的生理功能，但過量會引起血壓升高、頭痛、皮疹等不良生理反應(yīng)，有時則表現(xiàn)為胃腸功能紊亂，如出現(xiàn)嘔吐和腹瀉，并伴隨腹痛等癥狀[22-24]。此外，有研究表明白酒中吡咯烷約占總生物胺含量的50%以上，可能是其沸點接近白酒蒸餾溫度而進入酒體中造成的，并且吡咯烷是一種白酒中特有而其他酒類中沒有或含量很低的生物胺[25]。

目前，針對白酒中氨基酸多采用氨基酸自動分析儀以及柱前衍生-液相色譜儀檢測[26-27]，而對于白酒中難揮發(fā)性有機酸則主要通過高效液相色譜法及離子色譜法測定[28-30]，國內(nèi)外研究人員開發(fā)了測定白酒中多種呈香呈味物質(zhì)的檢測方法[4-5,8-9]，但針對白酒中多種痕量呈香呈味物質(zhì)以及生物胺同時進行定性定量分析的檢測方法甚少。因此，本實驗通過超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜儀建立一種同時測定白酒中多種痕量呈香呈味物質(zhì)及衍生物含量的檢測方法，對白酒樣品中某些非揮發(fā)性物質(zhì)進行準(zhǔn)確定性定量分析，以期為后續(xù)推進白酒中的非揮發(fā)性物質(zhì)組成及其量比關(guān)系對提高白酒品質(zhì)研究提供數(shù)據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售白酒購于貴州遵義習(xí)水縣合力超市。

甲醇 德國Merck公司；甲酸 美國Thermo Fisher Scientific公司；15 種氨基酸混標(biāo)（2.5 mmol/LL-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸以及1.25 mmol/LL-胱氨酸）和L-瓜氨酸（98.0%）德國Merck公司；2,3-二羥基丙酸（96.03%）上海麥克林生化科技有限公司；β-苯乙胺（98.6%）、酪胺（98.9%）、吡咯烷（98.5%）德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；L-色氨酸（99.04%）、色胺（98.4%）、L-酒石酸（99.2%）、L-蘋果酸（99.8%）、沒食子酸（99.1%）、阿魏酸（99.9%）、兒茶素（99.7%）、咖啡酸（99.4%）、木犀草素（98.6%）、綠原酸（99.4%）、對香豆酸（99.9%）、檸檬酸（98.9%）標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；QT-1旋渦混合器 上海琪特分析儀器有限公司；HC-3518高速離心機 安徽中科中佳科學(xué)儀器公司；Raykol AUTO EVA氮吹儀 睿科集團（廈門）股份有限公司；AR2140萬分之一分析天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；艾科普超純水機美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

準(zhǔn)確量取適量樣品于離心管中，經(jīng)10 000 r/min高速離心10 min后直接過0.22 μm水系PES針筒式過濾膜于2.0 mL液相色譜進樣小瓶中，待上機分析。

1.3.2 超高效液相色譜分析

超高效液相色譜儀條件：選用Hypersil Gold C18（150 mm×2.1 mm，1.9 μm）色譜柱；采用0.1%甲酸溶液（A）和甲醇（B）為流動相，按表1程序梯度洗脫；柱溫為40 ℃，進樣量為2 μL，流速0.2 mL/min，分析時間為16 min。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

高分辨質(zhì)譜儀離子源條件：加熱電噴霧電離源；鞘氣流量：40 arb；輔助氣流量：10 arb；噴霧電壓：±3.2 kV；離子源溫度：350 ℃；毛細管溫度：320 ℃。

高分辨質(zhì)譜儀掃描條件：采用全掃描/數(shù)據(jù)依賴性二級掃描的正負離子同時掃描采集模式；一級掃描范圍為m/z50.0～400.0；一級掃描分辨率70 000；自動增益控制進入軌道阱中的離子數(shù)（AGC target）為106；最大注入時間30 ms；二級掃描分辨率：17 500；AGC target為5×104；最大注入時間50 ms；歸一化碰撞能量：10、20、30 eV。

各待測組分化合物信息及高分辨質(zhì)譜參數(shù)見表2，采用外標(biāo)法定量，儀器采集數(shù)據(jù)的定性定量分析采用Xcalibur 4.1軟件。

表2 各待測組分化合物信息及高分辨質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Information about and HRMS parameters for all analytes

1.3.3 待測組分標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

各待測組分標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制：將17 種氨基酸、4 種生物胺以及11 種難揮發(fā)性有機酸待測組分按照類別分別用超純水配制成濃度為100 μmol/L（L-胱氨酸為50 μmol/L）、5.0 μg/mL和10.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，貯存于4 ℃?zhèn)溆茫?/p>

待測組分混合標(biāo)準(zhǔn)工作系列溶液配制：以超純水為試劑，配制成不同濃度氨基酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0 μmol/L）、不同質(zhì)量濃度生物胺系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 μg/L）以及不同質(zhì)量濃度難揮發(fā)性有機酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0 μg/L）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用Xcalibur 4.1軟件處理數(shù)據(jù)，以待測組分標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列濃度為橫坐標(biāo)（X），相應(yīng)待測組分色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得到相關(guān)線性回歸方程；將白酒樣品經(jīng)上述前處理之后通過超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜儀分析，利用待測組分標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計算，即得到白酒樣品中各待測組分的含量。每個實驗指標(biāo)至少重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的優(yōu)化

采用直接高速離心后過膜與經(jīng)氮吹除乙醇后上機分析的兩種前處理方式，測定白酒中的木犀草素、β-苯乙胺和L-蘇氨酸，從而明確適用于分析白酒樣品中多組分的前處理方法。如圖1A所示，與先氮吹除乙醇的前處理方式相比，直接經(jīng)高速離心膜過濾處理后的木犀草素色譜峰響應(yīng)值明顯較高；同時，經(jīng)添加木犀草素標(biāo)準(zhǔn)溶液的氮吹除乙醇樣品中其色譜峰響應(yīng)值低于未添加標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品，結(jié)果表明，氮吹除乙醇前處理方式不利于白酒樣品中木犀草素含量的測定，對檢測結(jié)果有不利影響；如圖1B所示，兩種前處理方式對添加標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品中β-苯乙胺的色譜峰響應(yīng)值影響差異不明顯；如圖1C所示，4 種樣品中L-蘇氨酸色譜峰響應(yīng)值差異不明顯。因此，通過不采用氮吹除乙醇消除乙醇的干擾，僅采取高速離心后過膜處理即可實現(xiàn)白酒樣品中多種待測組分的檢測。

圖1 氮吹除乙醇樣品與直接離心后過膜樣品處理方式下待測組分色譜圖Fig.1 Chromatographic profiles of analytes in samples subjected to nitrogen blowing for ethanol removal or direct centrifugation and membrane filtration

2.2 儀器參數(shù)的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱對檢測結(jié)果的影響

本實驗考察了Hypersil Gold C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）、Hypersil Gold C18（150 mm×2.1 mm，1.9 μm）、Accucore aQ（150 mm×2.1 mm，2.6 μm）3 種液相色譜柱對白酒樣品中32 種待測組分的分離效果影響，結(jié)果如圖2所示。以檸檬酸為例，樣品經(jīng)前處理后上機分析發(fā)現(xiàn)Hypersil Gold C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）與Accucore aQ（150 mm×2.1 mm，2.6 μm）色譜柱分離檸檬酸色譜峰寬度較大，且出現(xiàn)了明顯的拖尾現(xiàn)象；但經(jīng)Hypersil Gold C18（150 mm×2.1 mm，1.9 μm）色譜柱分離檸檬酸的色譜峰明顯優(yōu)于其他2 種色譜柱。因此，采用Hypersil Gold C18（150 mm×2.1 mm，1.9 μm）色譜柱作為分析色譜柱，可實現(xiàn)白酒樣品中多組分的檢測。

圖2 不同液相色譜柱下待測組分色譜圖Fig.2 Chromatographic profiles of analytes in samples separatedon different liquid chromatographic columns

2.2.2 流動相洗脫體系對檢測結(jié)果的影響

考察了0.1%甲酸-甲醇、1 mmol/L乙酸銨（0.1%甲酸）-甲醇兩種流動相洗脫體系對測定32 種待測組分的分離效果影響。如圖3所示，以吡咯烷為例，0.1%甲酸-甲醇流動相洗脫體系的吡咯烷色譜峰響應(yīng)值明顯高于1 mmol/L乙酸銨（0.1%甲酸）-甲醇流動相洗脫體系。因此，采用0.1%甲酸-甲醇流動相洗脫體系可以較好實現(xiàn)白酒樣品中32 種組分的分離。

圖3 不同流動相洗脫下待測組分色譜圖Fig.3 Chromatographic profiles of analytes in samples separated using different mobile phases

2.2.3 梯度洗脫程序?qū)Υ郎y組分分離的影響

采用表3不同梯度洗脫程序參數(shù)考察不同梯度洗脫程序下待測組分分離情況。如圖4所示，以吡咯烷為例，洗脫程序1的吡咯烷色譜峰響應(yīng)值明顯高于洗脫程序2，同時，洗脫程序3的吡咯烷色譜峰保留時間早于洗脫程序1，表明吡咯烷在洗脫程序3下尚未完全保留于液相色譜柱內(nèi)而被流動相洗脫。因此，采用梯度洗脫程序1可以較好實現(xiàn)白酒樣品中32 種組分的分離。

圖4 不同流動相洗脫程序條件下待測組分吡咯烷的色譜對比Fig.4 Chromatographic profiles of pyrrolidine under different mobile phase elution procedures

表3 不同梯度洗脫程序參數(shù)Table 3 Parameters of different gradient elution procedures

2.2.4 分子離子峰對待測組分分析的影響

考察了2 種分子離子峰（[M＋H]＋和[M＋H]-形式）對待測組分分析的影響，白酒樣品經(jīng)高速離心后過膜處理，再利用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜儀進行分析。通過不同待測組分的分子離子峰響應(yīng)值得出，17 種氨基酸和4 種生物胺的分子離子峰在[M＋H]＋形式下響應(yīng)值最高，11 種難揮發(fā)性有機酸的分子離子峰在[M＋H]-形式下響應(yīng)值最高（圖5），各待測組分化合物信息及高分辨質(zhì)譜參數(shù)詳見表2。

圖5 32 種待測組分的分子離子提取色譜圖Fig.5 Extracted ion chromatograms of 32 analytes in samples

2.3 各待測組分檢測方法的線性范圍和檢出限（limit of detection，LOD）及定量限（limit of quantitation，LOQ）

各待測組分混合標(biāo)準(zhǔn)工作系列溶液在上述條件下進行測定，采用外標(biāo)法定量。以各待測組分的濃度為橫坐標(biāo)（X）、定量離子的色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得相關(guān)線性回歸方程；以信噪比為3計算得到各待測組分的LOD，以信噪比為10計算得到LOQ。如表4所示，待測組分標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好（R2＞0.990），且各待測組分的LOD、LOQ相對較低，可滿足后續(xù)白酒中待測組分的定量分析以及低含量組分的測定。

表4 各待測組分標(biāo)準(zhǔn)工作系列溶液的線性方程、LOD和LOQTable 4 Linear equations,detection limits and quantification limits of all analytes

2.4 各待測組分測定方法的回收率和精密度

在基質(zhì)樣品中根據(jù)各待測組分的LOQ，加入3 個不同濃度的待測組分標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其配制成加標(biāo)樣品，按上述方法進行前處理，利用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜儀進行分析，每個加標(biāo)水平做3 次平行，每個平行重復(fù)測定6 次，計算平均回收率，以驗證測定方法的準(zhǔn)確度、精密度及穩(wěn)定性，分析結(jié)果見表5。對于3 種不同的加標(biāo)水平，其平均回收率在71.92%～117.45%范圍內(nèi)，且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在0.46%～5.48%之間?？梢姡摐y定方法對白酒樣品中多種痕量呈香呈味物質(zhì)及其衍生物具有良好的回收率、精密度及穩(wěn)定性，同時，前處理方法對樣品中各待測組分損失較低。

表5 各待測組分測定方法的回收率和精密度Table 5 Recoveries and precision for all analytes

3 討論與結(jié)論

檢測白酒樣品中多組分的方法中，大多數(shù)會采取氮吹或者其他方式去除乙醇對檢測結(jié)果的干擾，達到更好的檢測效果[31]，但本研究發(fā)現(xiàn)對白酒樣品的前處理方法有氮吹或者其他方式除乙醇步驟，這會對白酒樣品中的痕量呈香呈味物質(zhì)檢測造成不同程度的影響，而當(dāng)不進行氮吹或者其他方式除乙醇，直接對白酒樣品進行高速離心、膜過濾時，卻可以更好地實現(xiàn)白酒樣品中多種痕量呈香呈味物質(zhì)的檢測分析。同時，采用該方法可實現(xiàn)定性定量分析白酒樣品中多種痕量呈香呈味物質(zhì)，進而結(jié)合滋味稀釋技術(shù)的分析方法，準(zhǔn)確且高效地鑒定出白酒樣品中關(guān)鍵性呈香呈味物質(zhì)[8,12]，這為進一步解析不同類型白酒樣品的風(fēng)味成分構(gòu)成提供了數(shù)據(jù)支撐。

本方法前處理過程簡單易操作，無需除去樣品中多余乙醇含量，也不用使用有機溶劑進行液液萃取處理，樣品僅需高速離心后過濾上機分析，同時，儀器分析過程僅需16 min便可完成一個白酒樣品中待測組分的含量測定，故前處理實驗成本低且低毒環(huán)保。該測定方法針對待測多組分化合物的線性關(guān)系良好，即R2＞0.990；同時各組分化合物L(fēng)OQ低，即可滿足實際白酒樣品的相關(guān)化合物分析需求。其次，該方法準(zhǔn)確性高和檢測能力強，通過采用高靈敏度、高分辨率和強抗干擾能力的超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜儀可對白酒中多種痕量呈香呈味物質(zhì)及衍生物精確定量。該方法適合任何白酒樣品中待測組分的定性定量分析，且樣品實驗用量少和分析時間短，可有效實現(xiàn)白酒中多種痕量呈香呈味物質(zhì)的定性定量解析，能更好詮釋其對白酒香氣形成的貢獻情況。