鼠李糖脂抑制芽孢態(tài)蠟樣芽孢桿菌的活性及機(jī)制

牛永武，喬 杉，孫藝銘，王雨辰，趙仁勇，田雙起,*

（1.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.河南工業(yè)大學(xué) 小麥和玉米深加工國家工程研究中心，河南 鄭州 450001）

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）是一種常見的食源性致病菌，可以通過污染面制品、乳制品等食品引起成人和嬰幼兒食物中毒，危害人體健康[1]。研究表明，B.cereus能夠以營養(yǎng)細(xì)胞、芽孢和生物被膜3 種形態(tài)廣泛存在于土壤、水、空氣、食品等各種環(huán)境中[2]。其中，芽孢態(tài)B.cereus是其營養(yǎng)細(xì)胞在營養(yǎng)不足或外界環(huán)境脅迫條件下形成的休眠體，對高溫、紫外線、干燥、電離輻射和多種化學(xué)毒性物質(zhì)均有很強(qiáng)的抗逆性[3]。芽孢的代謝活性低，但可持續(xù)監(jiān)測周圍環(huán)境的營養(yǎng)狀況，一旦養(yǎng)分充足便可快速萌發(fā)[4]。目前，巴氏殺菌、輻照等物理殺菌技術(shù)和以食品防腐劑為核心的化學(xué)抑菌方法是食品生產(chǎn)中常用的微生物殺滅和抑制手段[5]，對滅活有害微生物、確保食品質(zhì)量安全起到關(guān)鍵作用。Juneja等[6]發(fā)現(xiàn)溫度從90.5 ℃升至99.0 ℃，可以使B.cereus芽孢數(shù)量降低2.53 個對數(shù)值。Ansari等[7]在熱處理的基礎(chǔ)上聯(lián)合超聲對食物中枯草芽孢桿菌芽孢進(jìn)行控制，發(fā)現(xiàn)100 ℃、振幅114 μm、1.1 W/mL條件下處理5 min，芽孢失活數(shù)量增加1.8 個對數(shù)值。然而，加熱處理并不適用于對多種食品加工中的殺菌保鮮，而當(dāng)前的非熱處理等物理殺菌技術(shù)大多還停留在實(shí)驗(yàn)室階段[8]。因此，尋求新型的芽孢抑菌劑對預(yù)防食品中的芽孢污染具有重要意義。

隨著消費(fèi)者食品健康意識的增強(qiáng)，具有綠色、安全無毒等特點(diǎn)的天然食品抑菌劑替代化學(xué)合成抑菌劑成為當(dāng)前的發(fā)展趨勢[9]，挖掘開發(fā)新的天然抑菌劑逐步成為研究熱點(diǎn)[10]。鼠李糖脂（rhamnolipids，RLs）是由銅綠假單胞菌發(fā)酵合成的次級代謝產(chǎn)物，是一種天然的陰離子糖脂類表面活性劑[11]，具有抑菌、乳化、抗癌等多種理化特性和生物學(xué)活性[12]。其中，RLs的抑菌活性早在1971年被發(fā)現(xiàn)[13]，其生物降解等安全性評價在2004年也已經(jīng)完成。Dusane等[14]研究發(fā)現(xiàn)，RLs濃度低于1.6 mmol/L時可以抑制短小芽孢桿菌的生長。de Freitas Ferreira等[15]證實(shí)RLs可以使金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌和B.cereus等食源性病原菌失活，抑菌機(jī)制主要是破環(huán)菌體細(xì)胞膜，使其通透性發(fā)生改變，造成大量胞內(nèi)物質(zhì)外泄，引發(fā)菌體死亡[16]。近年來，研究人員還對RLs抑制細(xì)菌生物被膜形態(tài)進(jìn)行了探究，發(fā)現(xiàn)RLs可以有效抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成，且呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)[17]。Bertuso等[18]發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度為3.13 mg/mL的RLs可以顯著抑制B.cereus芽孢的生長。隨后，該團(tuán)隊(duì)選擇芹菜籽油樹脂和檸檬烯與RLs聯(lián)合處理B.cereus芽孢，將芽孢抑制率從73%提升至98%[19]。但關(guān)于RLs對B.cereus芽孢的抗菌機(jī)制仍鮮見研究。

基于此，本研究以常見食源性致病菌——B.cereus的芽孢為研究對象，以抑菌圈、生長曲線、菌體外觀形態(tài)、芽孢滲透性、相對電導(dǎo)率、生物大分子泄漏量、活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量、表面疏水性、吡啶-2,6-二羧酸（dipicolinic acid，DPA）釋放量以及DNA紫外光譜為評價指標(biāo)，探究RLs對B.cereus芽孢的抑菌活性和作用機(jī)理，以期為推動RLs作為抑菌劑在食品工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

B.cereus北京保藏生物科技有限公司

RLs（純度≥90%）湖州紫金生物科技有限公司；蛋白胨、牛肉粉、瓊脂 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；ROS測試盒、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI）安徽酷爾生物工程有限公司；其他試劑（均為分析純）上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（蛋白胨5.0 g/L、牛肉膏3.0 g/L、氯化鈉5.0 g/L、瓊脂15.0 g/L，pH 7.0）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（蛋白胨5.0 g/L、牛肉膏3.0 g/L、氯化鈉5.0 g/L，pH 7.0），121 ℃高壓滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

AB204-S型分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；ZHJH-C1109C超凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司；YXQ-LS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；Vortex-2 Genie渦旋振蕩器 美國Scientific Industries公司；SevenEasy S20 pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；5424高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司；UV-2550紫外分光光度計 日本島津公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海華燕醫(yī)療器械有限公司；ZQZY-C8振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；SPARK酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；Revolve FL熒光倒置顯微鏡美國Echo Laboratories公司；Nova NanoSEM 450場發(fā)射掃描電鏡 美國FEI公司；Mini-Protean?Tetra小型電泳套裝、GelDoc Go凝膠成像分析儀 美國伯樂公司；Freezone 6L真空冷凍干燥機(jī) 美國Labconco公司。

1.3 方法

1.3.1 芽孢懸液制備

制備1.0×107CFU/mL的B.cereus營養(yǎng)細(xì)胞菌液，取100.0 μL涂布在含0.05 g/L四水合硫酸錳的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)7 d誘導(dǎo)芽孢形成，超凈工作臺中用滅菌后的載玻片將平板表面的芽孢輕輕刮下，懸浮于無菌水中。4 ℃、6 000 r/min條件下離心10 min，棄上清液，用無菌水洗滌3 次，將芽孢重新懸浮在無菌水中，80 ℃水浴處理20 min殺死營養(yǎng)細(xì)胞。取一滴菌懸液于載玻片上，用5%的孔雀石綠溶液染色5 min，再用水沖洗，顯示青綠色即表明芽孢制備成功。將芽孢菌液調(diào)整至濃度1.0×107CFU/mL，置于-20 ℃條件下1 d后使用[20]。

1.3.2 抑菌活性的評價

最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測定：分別配制RLs質(zhì)量濃度為0.0、16.0、32.0、64.0、80.0、96.0、112.0、128.0、144.0、160.0、256.0、512.0 mg/L的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，按50.0 mL搖瓶進(jìn)行分裝，以不含RLs作為對照組。按2%（以體系體積計，下同）芽孢菌液接種，37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)48 h，測定OD600nm，與初始OD600nm相比變化小于5%的實(shí)驗(yàn)組RLs濃度為對B.cereus芽孢的MIC。

最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）的測定：配制營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，從MIC測定實(shí)驗(yàn)組中分別取100.0 μL均勻涂布于固體平板，與對照組相比，菌落數(shù)降低3 個數(shù)量級的實(shí)驗(yàn)組所對應(yīng)最低RLs濃度為MBC。

抑菌圈實(shí)驗(yàn)：配制RLs質(zhì)量濃度分別為MIC、MBC的溶液，吸取100.0 μL芽孢菌液均勻涂布于固體平板上，在培養(yǎng)基表面放置已滅菌的空牛津杯，并向牛津杯中加入200.0 μL不同質(zhì)量濃度的RLs溶液，以無菌水作為對照組，37 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察是否有抑菌圈生成。

生長曲線的繪制：分別配制RLs質(zhì)量濃度為0（對照）、MIC和MBC的液體培養(yǎng)基，將芽孢菌液按2%接種，37 ℃條件下培養(yǎng)，每2 h測定OD600nm，繪制芽孢生長曲線。

1.3.3 掃描電鏡觀察

在制備好的芽孢菌液（1.0×106CFU/mL）中加入RLs，使其終質(zhì)量濃度分別為MIC和MBC，37 ℃、180 r/min孵育6 h，4 ℃、6 000 r/min離心10 min收集菌體，無菌0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.2～7.4）洗滌2～3 次。加入體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液，于4 ℃過夜固定，依次用體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、90%乙醇溶液梯度脫水，100%乙醇脫水兩次，再用乙醇-叔丁醇（2∶1、1∶1，V/V）、100%叔丁醇置換，制成叔丁醇芽孢菌液，滴加叔丁醇菌液于鋁箔紙上，-80 ℃預(yù)冷后冷凍干燥，采用掃描電鏡觀察并拍照。

1.3.4 芽孢內(nèi)膜通透性的測定

芽孢滲透性分析：芽孢菌液（1.0×106CFU/mL）中加入RLs，終質(zhì)量濃度分別為MIC和MBC，對照組加入同體積的生理鹽水（質(zhì)量濃度為9.0 g/L），37 ℃處理6 h后取樣，離心收集菌體，用等體積生理鹽水重懸。加入濃度為30 μmol/L的PI，避光反應(yīng)10 min后，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，棄去上清液，等體積生理鹽水重懸芽孢菌體，取3.0 μL菌液置于熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照。

芽孢菌液胞外電導(dǎo)率的測定：參照Zhang Yunbin等[21]的方法，取芽孢菌液離心，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%葡萄糖溶液清洗芽孢菌體，使其電導(dǎo)率與5%葡萄糖溶液的電導(dǎo)率相同，此時的芽孢菌液為等滲菌液。分別加入MIC和MBC的RLs，對照組加入等體積生理鹽水，測定電導(dǎo)率并記為L1。取等滲菌液分別加入MIC和MBC的RLs或生理鹽水，37 ℃振蕩培養(yǎng)8 h，每2 h取樣離心并測定上清液的電導(dǎo)率，記為L2。將培養(yǎng)8 h的菌液121 ℃滅菌30 min，冷卻后離心，測定上清液電導(dǎo)率，記為L0。菌液相對電導(dǎo)率按式（1）計算：

芽孢內(nèi)大分子釋放量的測定：利用紫外吸光光度法檢測核酸和蛋白等大分子的外泄情況，取50.0 mL芽孢菌液（1.0×106CFU/mL），分別加入MIC、MBC的RLs，對照組加入相同體積的生理鹽水，在37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)，分別在0、2、4、6、8 h時取出2.00 mL菌液，利用0.22 μm微孔膜過濾，測定濾液的OD260nm和OD280nm。

1.3.5 芽孢ROS含量的測定

取50.0 mL芽孢菌液（1.0×106CFU/mL），加入MIC、MBC的RLs，對照組加入相同體積的生理鹽水，在37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)，分別在0、30、60、90、120 min時取出200.0 μL菌液，按照ROS檢測試劑盒說明書操作，利用酶標(biāo)儀檢測各組樣品濾液的熒光強(qiáng)度。

1.3.6 芽孢DPA釋放量的測定

在0.5 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 5.5）中加入抗壞血酸（終質(zhì)量濃度為1 g/100 mL）和硫酸亞鐵銨（終質(zhì)量濃度為1 g/100 mL）配成顯色劑。樣品前處理同1.3.5節(jié)，4 ℃、6 000 r/min離心15 min，取4.00 mL上清液與1.00 mL顯色劑混合，測定OD440nm，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到各組樣品中的DPA含量（標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝0.001 9x＋0.048 8，R2＝0.991 1）。

測定未處理芽孢的DPA總量，取5.00 mL未處理芽孢懸液經(jīng)121 ℃、30 min高溫高壓處理，冷卻后加1 mol/L醋酸溶液0.10 mL靜置1 h。離心，取4.00 mL上清液測定DPA含量，即為對照組。

1.3.7 芽孢表面疏水性的測定

利用芽孢對正十六烷的親和力測定其疏水性。樣品前處理同1.3.5節(jié)，分別取對照組和RLs處理組的芽孢菌液3.00 mL，與0.60 mL的正十六烷混勻，渦旋振蕩20 s后靜置10 min。對照組的芽孢菌液OD600nm記為A0。取水相再次測定OD600nm，記為A1，以疏水芽孢比例（ratio of hydrophobic spores，RHS）表征芽孢表面疏水性，按式（2）計算：

1.3.8 紫外光譜掃描測定芽孢DNA

按照細(xì)菌基因組DNA試劑盒提取方法提取芽孢基因組DNA，用Tris-HCl溶液（0.1 mol/L、pH 8.0）稀釋至1.00 mL，DNA溶液中分別加入MIC、MBC的RLs，以未添加RLs處理為對照組，于37 ℃反應(yīng)30 min，在220～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

無特別說明，以上實(shí)驗(yàn)均為3 次重復(fù)。用Origin 8.0軟件繪制曲線圖，用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 RLs對B.cereus芽孢的抑菌活性評價

MIC和MBC分別可以反映抑菌劑對特定微生物的抑制和殺滅效果，是開發(fā)新型抑菌劑常用的評價指標(biāo)。分別利用吸光光度法和平板涂布法測定RLs對B.cereus芽孢態(tài)的MIC和MBC，結(jié)果見圖1。如圖1A所示，添加RLs質(zhì)量濃度為0～64.0 mg/L時，接種芽孢態(tài)B.cereus培養(yǎng)48 h后，培養(yǎng)液的OD600nm增長均遠(yuǎn)超過5%。RLs質(zhì)量濃度達(dá)到80.0 mg/L時，接種芽孢態(tài)B.cereus培養(yǎng)48 h后，培養(yǎng)液的OD600nm為0.104 8，與初始OD600nm（0.100 6）相比僅增加4.17%（＜5%），故確定RLs對芽孢態(tài)B.cereus的MIC為80.0 mg/L。將對照組和添加不同質(zhì)量濃度RLs培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行平板涂布（圖1B），發(fā)現(xiàn)RLs質(zhì)量濃度達(dá)到160.0 mg/L時，菌落總數(shù)降低3 個數(shù)量級，即160.0 mg/L RLs對芽孢態(tài)B.cereus的殺死率達(dá)99.9%。因此，確定RLs對芽孢態(tài)B.cereus的MBC為160.0 mg/L。

圖1 RLs抑制B.cereus芽孢生長的MIC（A）和MBC（B）Fig.1 MIC (A) and MBC (B) of RLs against B.cereus spores

如圖2所示，未添加RLs的芽孢在0～2 h處于延滯期，隨后進(jìn)入對數(shù)生長期，10 h后達(dá)到穩(wěn)定期。加入1/2 MIC的RLs后，芽孢的延滯期延長至4 h，隨后進(jìn)入生長對數(shù)期，但生長速率減緩，10 h后達(dá)到穩(wěn)定期。RLs質(zhì)量濃度為MIC時，24 h內(nèi)培養(yǎng)液持續(xù)呈澄清狀態(tài)，芽孢生長被完全抑制，這與RLs抑制金黃色葡萄球菌的研究結(jié)果[15]相似。為進(jìn)一步驗(yàn)證RLs對B.cereus芽孢的抑制作用，采用牛津杯法進(jìn)行抑菌圈實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示，MIC和MBC對B.cereus芽孢抑菌圈直徑分別為（9.77±0.09）mm和（11.29±0.31）mm，表明具有良好的抑菌效果。

圖2 RLs對B.cereus芽孢生長的影響Fig.2 Effect of RLs on the growth of B.cereus spores

圖3 不同質(zhì)量濃度RLs對B.cereus芽孢的抑菌效果Fig.3 Bacteriostatic effect of different concentrations of RLs on B.cereus spores

2.2 RLs對B.cereus芽孢形態(tài)的影響

如圖4所示，未經(jīng)RLs處理的芽孢呈短桿狀，表面有輕微皺縮，整體較為飽滿但無明顯異常變化。經(jīng)MIC RLs處理后，部分芽孢表面出現(xiàn)褶皺和折痕，而經(jīng)MBC RLs處理后的大部分芽孢表現(xiàn)出嚴(yán)重的皺縮和凹陷，且表面有泄漏的芽孢內(nèi)容物，表明一定質(zhì)量濃度RLs會引起B(yǎng).cereus芽孢外壁破損，破壞細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致內(nèi)容物泄漏，起到抑制芽孢生長或滅活的效果。

圖4 掃描電鏡觀察RLs對B.cereus芽孢形態(tài)的影響（×40 000）Fig.4 Effect of RLs on the morphology of B.cereus spores observed by SEM (× 40 000)

2.3 RLs對B.cereus芽孢內(nèi)膜通透性的影響

當(dāng)菌體死亡或細(xì)胞膜通透性改變時，PI染料能進(jìn)入細(xì)胞與DNA結(jié)合，熒光顯微鏡觀察結(jié)果可以間接反映細(xì)胞膜通透性變化[22]。由圖5可知，對照組在顯微鏡下無熒光現(xiàn)象，表明PI未進(jìn)入B.cereus芽孢內(nèi)部，細(xì)胞生長狀態(tài)正常。芽孢經(jīng)MIC和MBC的RLs處理后均觀察到紅色熒光，且MBC條件處理后的細(xì)胞紅色熒光顯著增強(qiáng)，表明RLs可以改變芽孢內(nèi)膜通透性，且破壞程度與RLs濃度呈正相關(guān)。

圖5 B.cereus芽孢的熒光顯微鏡分析Fig.5 Fluorescence microscopic images of B.cereus spores

相對電導(dǎo)率是衡量細(xì)胞膜滲透性的指標(biāo)之一，數(shù)值上升表明菌液中電解質(zhì)增加，即細(xì)胞膜破損程度更加嚴(yán)重[23]。如圖6所示，所有組的芽孢菌液相對電導(dǎo)率隨時間延長均有所升高，但對照組在4 h后基本不增加，而MIC和MBC RLs處理的芽孢菌液相對電導(dǎo)率呈現(xiàn)持續(xù)升高趨勢，其中MBC組升高趨勢更為顯著。8 h時，MIC組相對電導(dǎo)率達(dá)到了20.86%，MBC組升至32.13%，進(jìn)一步證實(shí)了RLs可以改變B.cereus芽孢內(nèi)膜通透性，引起芽孢內(nèi)電解質(zhì)的泄漏。

圖6 RLs對B.cereus芽孢相對電導(dǎo)率的影響Fig.6 Effect of RLs on relative conductivity of B.cereus spores

2.4 RLs對B.cereus芽孢內(nèi)大分子釋放的影響

蛋白質(zhì)和核酸是細(xì)胞的重要大分子物質(zhì)，對菌體生長繁殖起決定性作用[24]，測定不同處理時間后的芽孢溶液OD260nm和OD280nm，可以判斷芽孢內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)的泄漏情況。由圖7可知，對照組的OD260nm和OD280nm呈現(xiàn)較低水平，而RLs處理后的芽孢菌液OD260nm和OD280nm明顯升高，且隨著RLs濃度增大和作用時間延長而提升，表明RLs對芽孢各層的通透性和完整性有明顯的破壞作用，導(dǎo)致核酸和蛋白質(zhì)大量外泄，引起功能紊亂，影響芽孢生長。黃現(xiàn)青等[25]探究了表面活性素對B.cereus壁膜通透性的影響，發(fā)現(xiàn)150 μg/mL的surfactin顯著提高了芽孢核酸釋放量，與本研究結(jié)果一致。

圖7 RLs對B.cereus芽孢核酸和蛋白質(zhì)泄漏量的影響Fig.7 Effect of RLs on the leakage of nucleic acids and proteins in B.cereus spores

2.5 RLs對B.cereus芽孢內(nèi)ROS的影響

ROS是氧正常代謝的天然副產(chǎn)物，在細(xì)胞信號傳導(dǎo)和體內(nèi)平衡中具有重要作用[26]。細(xì)胞受到外界的不良刺激時，ROS水平會急劇上升，表現(xiàn)出氧化應(yīng)激現(xiàn)象[27]。如圖8所示，RLs處理60 min后，濾液的熒光強(qiáng)度開始顯著升高，且MBC處理組的熒光強(qiáng)度始終高于MIC組，表明RLs可以導(dǎo)致B.cereus芽孢產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起芽孢發(fā)生不可逆損傷和死亡。Gut等[28]發(fā)現(xiàn)Nisin處理炭疽芽孢桿菌芽孢后同樣使其ROS大量增加，造成氧化應(yīng)激現(xiàn)象。

圖8 B.cereus芽孢內(nèi)ROS含量的變化Fig.8 Changes in ROS content of B.cereus spores

2.6 RLs對B.cereus芽孢內(nèi)DPA釋放的影響

DPA是芽孢的核心組成成分，自身釋放會導(dǎo)致芽孢抗性降低[29]，測定DPA的釋放量可以評價芽孢的抵抗能力[30]。未處理的菌液經(jīng)過121 ℃加熱20 min后，芽孢內(nèi)DPA全部釋放，此時測得芽孢內(nèi)DPA的總量為（166.83±1.44）μg/mL。由圖9可知，RLs處理會引起DPA的釋放，且高質(zhì)量濃度的RLs促使DPA釋放量達(dá)到（86.11±2.01）μg/mL，約占總量的51.61%，表明RLs可以有效降低芽孢的耐熱性，從而加速芽孢損傷和失活。Dong等[31]選擇十六烷基三甲基溴化銨處理枯草芽孢桿菌芽孢，發(fā)現(xiàn)十六烷基三甲基溴化銨通過激發(fā)菌體釋放大量DPA進(jìn)而導(dǎo)致菌體失活，與本研究結(jié)果類似。

圖9 B.cereus芽孢內(nèi)DPA含量的變化Fig.9 Changes in DPA content of B.cereus spores

2.7 RLs對B.cereus芽孢表面疏水性的影響

表面疏水性是決定芽孢黏附性的重要影響因素之一[32]。根據(jù)表1可知，未經(jīng)處理的B.cereus芽孢的RHS 59.938%，表現(xiàn)出較強(qiáng)的疏水性。而經(jīng)RLs處理后，芽孢RHS顯著降低，MIC組降低至12.310%，MBC組下降至10.792%，分布在正十六烷中的芽孢比例顯著降低，芽孢表面由疏水向親水轉(zhuǎn)變。表明RLs可以降低芽孢與疏水表面和界面黏附能力，為減少B.cereus芽孢在食品加工中的污染提供潛在可能。

表1 RLs對B.cereus芽孢表面疏水性的影響Table 1 Effect of RLs on surface hydrophobicity of B.cereus spores

2.8 RLs對B.cereus芽孢DNA的影響

由以上結(jié)果可知，RLs具有透過芽孢內(nèi)膜進(jìn)入內(nèi)部結(jié)構(gòu)的潛力，猜測其可能與DNA發(fā)生作用，利用紫外光譜探究RLs與DNA之間的相互作用。從圖10可以看出，B.cereus芽孢DNA的最大紫外吸收峰隨著RLs處理質(zhì)量濃度的增加呈降低趨勢，發(fā)生減色效應(yīng)，表明RLs可以與B.cereus芽孢DNA分子發(fā)生作用。分析原因可能是RLs作為小分子物質(zhì)競爭性地插入DNA的堿基對中，致使堿基對脫落，進(jìn)而降低紫外吸光度[33]。

圖10 DNA與RLs作用后的紫外光譜變化Fig.10 UV absorption spectra of RLs interacting with DNA

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)針對RLs對B.cereus芽孢的抑菌活性及芽孢壁膜的破壞作用展開研究，發(fā)現(xiàn)RLs可以有效抑制芽孢態(tài)B.cereus的生長，MIC和MBC分別為80.0 mg/L和160.0 mg/L，具有良好的抑菌活性。進(jìn)一步研究RLs對芽孢態(tài)B.cereus的抑制機(jī)制，發(fā)現(xiàn)RLs處理后引起芽孢出現(xiàn)嚴(yán)重皺縮、凹陷和內(nèi)膜破裂，導(dǎo)致芽孢內(nèi)容物外泄。同時，RLs對芽孢內(nèi)膜通透性和完整性均發(fā)生破壞，引起芽孢內(nèi)電解質(zhì)、核酸以及蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)的大量泄漏，導(dǎo)致芽孢的正常新陳代謝紊亂甚至失活。此外，RLs處理促使芽孢核心內(nèi)的DPA大量釋放到外界環(huán)境中，顯著降低了芽孢抗性。RLs處理后的芽孢內(nèi)ROS大量堆積，表現(xiàn)出氧化應(yīng)激現(xiàn)象，降低菌體的代謝活性。RLs能夠有效降低芽孢的表面疏水性，從而降低其黏附能力，還可以與芽孢DNA相互作用并發(fā)生減色效應(yīng)，導(dǎo)致菌體DNA結(jié)構(gòu)受損，對DNA的功能造成干擾。

整體來看，本研究從細(xì)胞水平闡述了RLs對B.cereus芽孢形態(tài)的抑菌效果及機(jī)理，揭示了RLs可有效滅活芽孢的萌發(fā)，并對其各層結(jié)構(gòu)均產(chǎn)生破壞作用；同時，RLs可以通過降低芽孢黏附性及熱抗性、加速胞內(nèi)大分子物質(zhì)外泄、產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)等多種途徑對芽孢造成損傷，可為RLs的抑菌研究提供理論依據(jù)。目前，為減少抑菌劑的使用量，多種殺菌技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用已逐步成為殺菌行業(yè)的關(guān)注點(diǎn)，后續(xù)可以對RLs與其他抑菌劑或物理抑菌方法的聯(lián)合應(yīng)用展開深入研究。