基于搭建紫外-可見光譜儀并運用于氨基酸測定的實驗教學(xué)模式

劉永剛，唐 妍，吳 佳，曹亞焜

（1.西南科技大學(xué)分析測試中心，四川綿陽 621010；2.西南科技大學(xué)環(huán)境友好能源材料國家重點實驗室，四川綿陽 621010）

1 概述

近代分析化學(xué)的發(fā)展離不開儀器分析，儀器分析是科學(xué)研究、工業(yè)、醫(yī)學(xué)等許多其他領(lǐng)域的關(guān)鍵工具，在對物質(zhì)的定性、定量分析以及結(jié)構(gòu)分析中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。紫外-可見吸收光譜儀可用于分析樣品的結(jié)構(gòu)和化學(xué)鍵信息，對吸收峰進(jìn)行定性鑒別和定量測量，研究化學(xué)反應(yīng)的動力學(xué)過程等[1-3]。在實驗教學(xué)中，通過親自組裝紫外光譜儀，并利用量子化學(xué)原理計算樣品的紫外光譜，可以有效地加強(qiáng)學(xué)生的實驗操作技巧和科學(xué)知識儲備，以提高學(xué)生科學(xué)素養(yǎng)。學(xué)生將學(xué)習(xí)實踐中的物理光學(xué)原理以及計算化學(xué)方法，幫助他們加深對這些基礎(chǔ)概念的理解。2020年，馬品一等人通過搭建由氘燈、鎢燈和CCD傳感器組成的紫外可見光譜儀繪制了鋁的不同絡(luò)合物的吸收曲線，并進(jìn)行了微量鋁的測定[4]。在2023年，趙浩及其團(tuán)隊成功構(gòu)建了一種光學(xué)多通道分光光度計[5]。與常規(guī)的單光束和雙光束分光光度計相比，這種設(shè)備能更迅速地檢測到所有波長段的信息，使其成為進(jìn)行快速反應(yīng)動力學(xué)研究和多組分混合物分析的理想工具。為將具體的實驗過程與抽象的理論知識相結(jié)合，引入量子化學(xué)計算對實驗結(jié)果進(jìn)行核對分析，有助于培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目蒲袘B(tài)度和科學(xué)素養(yǎng)。量子化學(xué)以量子力學(xué)作為其基礎(chǔ)理論，通過對原子、分子、晶體的電子結(jié)構(gòu)、化學(xué)鍵理論、分子間的相互作用力以及化學(xué)反應(yīng)理論的研究，揭示了有機(jī)、無機(jī)化合物，生物大分子物質(zhì)以及化學(xué)反應(yīng)的內(nèi)在性質(zhì)和規(guī)律。具體包括從頭算、半經(jīng)驗和密度泛函等方法[6-7]。

2 實驗教學(xué)過程

本實驗教學(xué)設(shè)計融合了現(xiàn)代分析測試儀器搭建和量子化學(xué)計算（QC），在教學(xué)過程中學(xué)生根據(jù)課題自主查閱文獻(xiàn)，了解紫外-可見光譜儀的原理及在科學(xué)研究和工業(yè)應(yīng)用中的重要性，選擇合適的光源、光柵、CCD探測器等搭建紫外-可見光譜儀。氨基酸紫外光譜測定的流程為：

1）調(diào)研測量方案并與老師討論合理性。

2）選擇測試樣品為L-苯丙氨酸與L-酪氨酸并進(jìn)行預(yù)制備。

3）確定所需的波長范圍、光度精度和分辨率。

4）使用搭建好的光譜儀對樣品進(jìn)行測量。

5）從Pubchem數(shù)據(jù)庫中檢索獲得酪氨酸等氨基酸的初始結(jié)構(gòu)模型，采用密度泛函理論（DFT）和含時密度泛函理論（TDDFT）對這兩種氨基酸進(jìn)行量子化學(xué)計算。

6）對測得的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，與計算所得結(jié)果進(jìn)行對比分析，解釋光譜中的特征峰。

3 實驗教學(xué)實施

3.1 紫外-可見光譜的搭建裝置搭建

學(xué)生根據(jù)圖1(a)的指示建立光路，選用鹵鎢燈和氘燈作為光源，它們可以提供可見光區(qū)（鹵鎢燈）和紫外光區(qū)（氘燈）的連續(xù)光。從光源發(fā)射的復(fù)合光線經(jīng)過光闌和凸透鏡后，轉(zhuǎn)化為平行光束并穿過樣品。再通過凸透鏡聚焦過狹縫后，經(jīng)過凹面鏡反射在光柵上，經(jīng)過另一凹面鏡再次反射進(jìn)入檢測器。

圖1 紫外可見光譜儀的光路圖(a)、紫外光譜儀的光路調(diào)節(jié)(b)、紫外-可見光譜儀的搭建實物圖(c)

3.2 紫外-可見光譜儀的搭建裝置校準(zhǔn)

光路搭建好后，需進(jìn)行儀器校準(zhǔn)，光學(xué)元件在空間中有3個自由度：水平位置、垂直高度和傾角直接決定了光的路徑和強(qiáng)度，這些因素對最終結(jié)果的精確性有直接影響，因此需要進(jìn)行仔細(xì)的調(diào)整[8]。利用實驗室常用的高強(qiáng)度激光和光高度計對上面這些光學(xué)元件進(jìn)行垂直高度的調(diào)節(jié)。先確認(rèn)光源水平，再使得各個光學(xué)元件等高，光斑位于中心，讓激光射入球面鏡的中心，反射的激光不需要穿過高孔，水平位置，傾角的調(diào)節(jié)需要在高度調(diào)節(jié)之后完成。通過不斷移動CCD，當(dāng)觀察到CCD上反射的像是最清晰的時候進(jìn)行固定，如圖1(b)所示。在光路搭建完畢后，仍需要對各部件的位置進(jìn)行微小的調(diào)整，直至得到正確的光源光譜，到此一臺較為精準(zhǔn)的紫外-可見光譜儀調(diào)節(jié)最終完成，可直接用于后續(xù)樣品測定。圖1(c)展示了已經(jīng)搭建完成的紫外-可見光譜儀的實物圖。

3.3 兩種氨基酸紫外-可見光譜的測定與模擬

采用圖1(c)所示的自搭建的紫外-可見光譜儀對待測樣品進(jìn)行檢測，檢測過程中使用CCD作為檢測器來檢測樣品光信號，紫外可見吸收光譜遵循朗博比爾吸收定律，其表達(dá)式為：

式（1）中，A為樣品光吸收強(qiáng)度，k為摩爾吸收系數(shù)，l為光在樣品中穿過的距離，c為溶液濃度，I0為入射光強(qiáng)度，It為光通過樣品后剩余光強(qiáng)度。朗博比爾定律是一個有限的定律，適用于濃度較低的溶液，當(dāng)樣品濃度較高時，溶液內(nèi)粒子間距離減小，受粒子間電荷分布影響，摩爾吸收系數(shù)將發(fā)生改變，偏離朗博比爾吸收定律，另一方面，溶度過高，透射光強(qiáng)度就會過低，就會受到CCD噪聲的影響，從而導(dǎo)致較大的測量誤差。為了使學(xué)生更好地了解搭建的紫外-可見光譜儀的工作原理，我們對兩種氨基酸分別配置了不同濃度進(jìn)行測試。

分別稱取0.001 g、0.0015 g、0.002 g、0.0025 g 的L-苯丙氨酸與L-酪氨酸粉末，將稱取好的樣品分別置入100 mL水溶劑中充分?jǐn)嚢柚敝寥芙?。將儀器打開預(yù)熱30 min，使光源穩(wěn)定，使用前需要對儀器進(jìn)行全面校正檢定和校正測試定波長，檢查樣品池。使用搭建好的紫外-可見光譜儀，保證實驗在25 ℃下進(jìn)行，以配制溶液所采用的溶劑水做參比，波長范圍為200～400 nm測得氨基酸的紫外-可見光譜。

從Pubchem數(shù)據(jù)庫中獲得氨基酸初始結(jié)構(gòu)，使用Gaussion 09軟件包，采用TD-DFT方法計算每種目標(biāo)物的激發(fā)態(tài)躍遷能和對應(yīng)的振子強(qiáng)度，在B3LYP/def2-SVP級別下對結(jié)構(gòu)進(jìn)行幾何優(yōu)化和振動分析以獲得氨基酸穩(wěn)定的構(gòu)型，并采用基于密度的溶劑模型（SMD）為氨基酸添加了水溶劑環(huán)境，通過頻率分析確定沒有虛頻。優(yōu)化的各收斂限度為：能量變化（Energy Change）：5.0000×10-6Eh；最大梯度變化（Max. Gradient）：3.0000×10-4Eh/bohr；均方根梯度變化（RMS Gradient）：1.0000×10-4Eh/bohr；最大位移（Max. Displacement）：4.0000×10-3bohr；均方根位移（RMS Displacement）：2.0000×10-3bohr。達(dá)到各收斂限度且振動分析無虛頻即證明優(yōu)化完成的結(jié)構(gòu)為分子的最穩(wěn)定形態(tài)。優(yōu)化后的結(jié)構(gòu)采用相同的計算級別進(jìn)行激發(fā)態(tài)能量的計算，計算的激發(fā)類型為垂直吸收，得到的激發(fā)能和吸收強(qiáng)度擬合得到氨基酸的紫外-可見吸收光譜。

4 結(jié)果討論與分析

為了討論分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，選擇市面上常見的商用傳統(tǒng)紫外分光光度計（日本島津UV-3150）測定了配置好的氨基酸溶液，圖2是L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的紫外-可見光譜圖，直線為量化計算擬合得到的光譜圖，點線和劃線分別為實驗搭建的紫外-可見光譜儀與紫外分光光度計（日本島津UV-3150）測定得到的光譜圖。

圖2 L-苯丙氨酸(上)和L-酪氨酸(下)的紫外-可見光譜測定曲線與計算曲線

由表1可知，量化計算結(jié)果表明L-苯丙氨酸在275 nm處出現(xiàn)了紫外吸收峰。在0.010 g/L的濃度下通過搭建的紫外-可見光譜儀測量的L-苯丙氨酸紫外吸收峰位置在265 nm，此時濃度較低，由于自搭建儀器信噪比差，導(dǎo)致與計算結(jié)果比較偏差最大，偏差為3.6%。在實驗教學(xué)過程中，同時利用商用紫外分光光度計（日本島津UV-3150）進(jìn)行測試比對，發(fā)現(xiàn)測得的峰位置偏差在2%以內(nèi)。L-酪氨酸的紫外吸收峰量化計算結(jié)果在260 nm處。濃度為0.010 g/L時，自搭建儀器測得峰位置與計算結(jié)果最大偏差為2.3%，其余濃度時與紫外分光光度計（日本島津UV-3150）測得的峰位置平均偏差為2%以內(nèi)。通過與商用分光光度計測試結(jié)果和量化計算結(jié)果很好地驗證了自搭建紫外可見分光光度計的準(zhǔn)確性。

表1 L-苯丙氨酸與L-酪氨酸不同濃度下的紫外-可見吸收峰，括號內(nèi)為日本島津UV-3150測定結(jié)果，括號外為自搭建儀器測定結(jié)果

5 結(jié)束語

本教改實驗的研究目標(biāo)是搭建紫外-可見光譜并引入量子化學(xué)計算的教學(xué)模型，旨在提高本科階段學(xué)生對于分子結(jié)構(gòu)和光譜分析的理解能力。通過將實踐與計算模擬相結(jié)合的形式有效地提升了學(xué)生在分子光譜學(xué)中的學(xué)習(xí)體驗和學(xué)術(shù)水平。通過在教學(xué)中引入光譜模擬軟件和量子化學(xué)計算工具，我們構(gòu)建了一個全面的教學(xué)模型，使學(xué)生能夠在計算機(jī)上模擬和分析不同分子的光譜圖像。這種基于實踐的學(xué)習(xí)方法，大幅度提高了學(xué)生對光譜原理和分析方法的理解和掌握能力，在具體的操作實踐中，使學(xué)生更加深刻地理解紫外光譜儀的工作原理。總之，本教改研究工作為化學(xué)教育領(lǐng)域的教學(xué)改革提供了一種創(chuàng)新的教學(xué)模型，并取得了積極的成果。我們相信，通過更廣泛地推廣和應(yīng)用這種基于紫外-可見光譜和量子化學(xué)計算的教學(xué)模型，將會對培養(yǎng)優(yōu)秀的化學(xué)學(xué)生和提升化學(xué)教育質(zhì)量起到積極的推動作用。