lncRNA KCNQ1OT1靶向調(diào)控miR-132-5p對(duì)帕金森病細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制

付琨燕 劉慧斌 蘇男 李斯琴

帕金森病是一種黑質(zhì)多巴胺隨年齡增長(zhǎng)而呈退行性變的疾病,故發(fā)病人群以>60歲為主,目前尚未有根治手段,研究該病的發(fā)生、發(fā)展作用機(jī)制,對(duì)其治療具有重要意義[1-3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)的非編碼RNA分子,可作為帕金森治療的潛在靶點(diǎn),但lncRNA KCNQ1OT1可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)而參與腫瘤、糖尿病腎病及心肌病的發(fā)生、發(fā)展,但在帕金森中相關(guān)作用機(jī)制目前尚不明確[4]。miRs在神經(jīng)細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)過程中均發(fā)揮重要作用,miR-132在帕金森病中呈高表達(dá),可參與應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)[5]。1-甲基-4-苯基吡啶陽(yáng)離子(MMP+)是一種在帕金森病細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒅袘?yīng)用較為廣泛的神經(jīng)毒素,可造成多巴胺能神經(jīng)元氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡[6]。筆者發(fā)現(xiàn)lncRNA KCNQ1OT1、miR-132-5p在帕金森病模型細(xì)胞中的作用和關(guān)系尚不明確,基于此,本研究通過MMP+誘導(dǎo)建立帕金森病模型細(xì)胞,以下調(diào)lncRNA KCNQ1OT1、miR-132-5p表達(dá)的方法明確其對(duì)帕金森病模型細(xì)胞損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 研究材料 (1)研究細(xì)胞:人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SH-SY5Y細(xì)胞來(lái)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù),本研究經(jīng)巴彥淖爾布醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。(2)主要試劑:RPMI-1640培養(yǎng)基(武漢益普生物科技有限公司),活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)檢測(cè)試劑盒(北京索寶科技有限公司),lncRNA KCNQ1OT1抑制劑(anti-lncRNA KCNQ1OT1)、模擬物(lncRNA KCNQ1OT1)、miR-132-5p抑制劑(anti-miR-132-5p)、模擬物(miR-132-5p)、陰性對(duì)照(KCNQ1OT1-NC、miR-NC、si-lncRNA KCNQ1OT1、pcDNA)、miR-132-5p的野生及突變型雙熒光素酶載體均購(gòu)自南通百奧邁科生物公司,流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司),BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司),Bcl-2蛋白、Bax蛋白抗體(SCBT公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):將人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SH-SY5Y細(xì)胞放入RPMI-1640培養(yǎng)液(10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/ml酶聯(lián)素)中,之后將其放入培養(yǎng)箱(溫度37℃、5%CO2)中進(jìn)行培養(yǎng),每3天更換1次培養(yǎng)液,密度達(dá)80%～90%時(shí),將培養(yǎng)基除去,進(jìn)行傳代培養(yǎng),取3～5代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 模型建立:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SH-SY5Y細(xì)胞分為Con組(正常培養(yǎng)),MMP+組(將濃度為100 μmol/L的MMP+加入培養(yǎng)液中,誘導(dǎo)24 h進(jìn)行轉(zhuǎn)染)。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:取對(duì)數(shù)MMP+培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞,稀釋至1×106個(gè)細(xì)胞/mL,后接種于6孔板上,200 μL/孔(1×106個(gè)/孔),待細(xì)胞融合度達(dá)80%,以Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染,分組:lncRNA KCNQ1OT1抑制組(轉(zhuǎn)染anti-KCNQ1OT1-NC和anti-lncRNA KCNQ1OT1),miR-132-5p抑制組(轉(zhuǎn)染anti-miR-132-5p-NC和anti-miR-132-5p),lncRNA KCNQ1OT1過表達(dá)組(轉(zhuǎn)染KCNQ1OT1-NC+lncRNA KCNQ1OT1),lncRNA KCNQ1OT1低表達(dá)和miR-132-5p過表達(dá)(轉(zhuǎn)染anti-KCNQ1OT1+pcDAN和anti-KCNQ1OT1+pcDAN+miR-132-5p),野生型和突變型雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)(轉(zhuǎn)染KCNQ1OT1-NC+WT-miR-132-5p、lncRNA KCNQ1OT1+WT-miR-132-5p、KCNQ1OT1-NC+MUT-miR-132-5p、lncRNA KCNQ1OT1+MUT-miR-132-5p),轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 lncRNA KCNQ1OT1、miR-132-5p表達(dá)量檢測(cè):SH-SY5Y細(xì)胞lncRNA KCNQ1OT1、miR-132-5p表達(dá)量采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測(cè),采用TRIzol試劑盒提取和純化RNA,使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄處理,獲得總cDNA,采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列,啟動(dòng)PCR儀,反應(yīng)條件:95℃、94℃、59℃、72℃分別為5 min、30 s、45 s、45 s,45個(gè)循環(huán),采用2-ΔΔCt方法計(jì)算出lncRNA NEAT1表達(dá)量。

1.2.5 ROS、SOD、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α水平檢測(cè):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)SH-SY5Y細(xì)胞,接種于6孔板,孵育過后通過酶標(biāo)儀對(duì)ROS、SOD、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α水平進(jìn)行檢測(cè),孔中加入10 μL待測(cè)樣品、40 μL待測(cè)樣品稀釋液,搖勻,加入酶標(biāo)試劑100 μL,封板并孵育60 min(37℃),將孔中液體棄去,Wash Sohltion重復(fù)清洗后加入50 μL顯色劑,搖勻,顯色處理15 min(37℃),后加入終止液50 μL,OD值在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)ROS、SOD、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.2.6 細(xì)胞凋亡率檢測(cè):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)SH-SY5Y細(xì)胞,接種于6孔板上,2×104個(gè)/孔,培養(yǎng)48 h后將培養(yǎng)液棄去,PBS進(jìn)行洗滌,共2次,后將結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞(200 μL)、AnnexinV-異硫氰酸熒光素(5 μL)、PI(5 μL)加入,結(jié)合緩沖液在孵育15 min后加入,共300 μL,后通過流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞凋亡率進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7 Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)檢測(cè):細(xì)胞中蛋白依照細(xì)胞蛋白提取試劑盒說(shuō)明進(jìn)行萃取,Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)量通過Western blot法進(jìn)行檢測(cè),SDS-PDGE電泳于每孔加入80 μg蛋白后進(jìn)行,電泳結(jié)束后將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%脫脂奶粉對(duì)PVDF膜進(jìn)行封閉,Bcl-2、Bax蛋白一抗(1∶1 000)于搖床上室溫孵育,120 min,完成后采用TBST洗膜3次,5 min/次,后將Bcl-2、Bax蛋白K二抗(1∶1 000)于搖床上室溫孵育,60 min,完成后采用TBST洗膜3次,10 min/次,化學(xué)發(fā)光顯影采用ECL,以GAPDH為內(nèi)參,相對(duì)條帶灰度光密度值采用Image J軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA KCNQ1OT1和miR-132-5p在MMP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞損傷中的表達(dá) 與Con組相比,MMP+組lncRNA KCNQ1OT1、miR-132-5p表達(dá)量較高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 lncRNA KCNQ1OT1和miR-132-5p在MMP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞損傷中的表達(dá)

2.2 lncRNA KCNQ1OT1低表達(dá)對(duì)MMP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥損傷及凋亡的影響 與Con組比較,MMP+組lncRNA KCNQ1OT1、ROS、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α水平、凋亡率、Bax蛋白表達(dá)均升高,SOD水平、Bcl-2蛋白表達(dá)均降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與MMP++KCNQ1OT1-NC組比較,MMP++si-lncRNA KCNQ1OT1組lncRNA KCNQ1OT1、ROS、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α水平、凋亡率、Bax蛋白表達(dá)均降低,SOD水平、Bcl-2蛋白表達(dá)均升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2,圖1。

圖1 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

表2 lncRNA KCNQ1OT1低表達(dá)對(duì)MMP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥損傷及凋亡的影響

2.3 干擾miR-132-5p表達(dá)對(duì)MMP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥損傷及凋亡的影響 與Con組比較,MMP+組miR-132-5p表達(dá)量、ROS、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α水平、凋亡率、Bax蛋白表達(dá)均升高,SOD水平、Bcl-2蛋白表達(dá)均降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與MMP++miR-NC組相比,MMP++si-miR-132-5p組miR-132-5p表達(dá)量、ROS、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α水平、凋亡率、Bax蛋白表達(dá)均下降,SOD水平、Bcl-2蛋白表達(dá)均上升,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2,表3。

圖2 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

表3 干擾miR-132-5p表達(dá)對(duì)MMP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥損傷及凋亡的影響

2.4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果顯示,與KCNQ1OT-NC組比較,過表達(dá)lncRNA KCNQ1OT組野生型WT-miR-132-5p的熒光從熒光素酶相對(duì)活性較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.708,P<0.05),而突變型MUT-miR-132-5p無(wú)顯著變化,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.5 miR-132-5p過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了lncRNA KCNQ1OT1低表達(dá)對(duì)MMP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥損傷及凋亡的影響 與MMP++KCNQ1OT1-NC組比較,MMP++si-lncRNA KCNQ1OT1組miR-132-5p表達(dá)量、

ROS、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α水平、凋亡率、Bax蛋白表達(dá)均降低,SOD水平、Bcl-2蛋白表達(dá)均增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與MMP++si-lncRNA KCNQ1OT1+pcDNA組比較,MMP++si-lncRNA KCNQ1OT1+pcDNA+miR-132-5p組miR-132-5p表達(dá)量、ROS、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α水平、凋亡率、Bax蛋白表達(dá)均上升,SOD水平、Bcl-2蛋白表達(dá)均下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5,圖3。

圖3 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

表5 miR-132-5p過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了lncRNA KCNQ1OT1低表達(dá)對(duì)MMP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥損傷及凋亡的影響

3 討論

帕金森病是發(fā)病隱秘、病程進(jìn)展緩慢的老年疾病,臨床癥狀多表現(xiàn)為肢體震顫、活動(dòng)期間姿態(tài)笨拙,且部分患者可伴隨步態(tài)障礙或運(yùn)動(dòng)緩慢等癥狀,進(jìn)而對(duì)患者正常機(jī)體活動(dòng)造成了不利影響[7-9]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元氧化應(yīng)激及炎性損傷、細(xì)胞凋亡為帕金森病發(fā)病的主要原因,因此尋找可有效抑制神經(jīng)元氧化應(yīng)激及炎性損傷、細(xì)胞凋亡的分子靶點(diǎn)對(duì)臨床診治具有關(guān)鍵意義[10-12]。

研究有明,帕金森病病理機(jī)制中l(wèi)ncRNA具有重要的調(diào)控作用,如lncRNA NEAT1可通過調(diào)控RAB3IP、miR-212-5p表達(dá)而減輕MMP+引發(fā)的細(xì)胞毒性及凋亡,lncRNA UCA1可通過抑制P13K/AKT激活而減輕氧化應(yīng)激炎性反應(yīng),lncRNA H19可通過激活Wnt/β-catenin、調(diào)控HPRT1表達(dá)而減輕神經(jīng)元細(xì)胞損傷,lncRNA KCNQ1OT1作為新型lncRNA可參與內(nèi)脂應(yīng)激、神經(jīng)元損傷及凋亡調(diào)節(jié),在腦缺血再灌注損傷、缺血性腦卒中、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等腦部相關(guān)疾病中均發(fā)揮重要作用[13-15]。近年來(lái)研究表明,lncRNA可通過調(diào)控miRNA表達(dá)而對(duì)下游效應(yīng)分子功能進(jìn)行調(diào)節(jié),而miRNA可通過靶向調(diào)控蛋白表達(dá)、抑制或靶向降解其靶mRNA而參與人類疾病的發(fā)生、發(fā)展,miR-132在帕金森病中呈高表達(dá),且與患者疾病嚴(yán)重程度、疾病分期密切相關(guān),而抑制miR-132表達(dá)可減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡,增加細(xì)胞存活量[16]。本研究顯示,miR-132-5p在MMP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞中呈高表達(dá),雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-132-5p為lncRNA KCNQ1OT1的靶基因,lncRNA KCNQ1OT1可正向調(diào)控miR-132-5p表達(dá),表明lncRNA KCNQ1OT1可靶向調(diào)控miR-132-5p表達(dá)。

氧化應(yīng)激反應(yīng)易對(duì)大腦造成影響,故臨床多認(rèn)為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病與氧化應(yīng)激反應(yīng)存在密切聯(lián)系[17]。ROS為線粒體產(chǎn)物,其低水平表達(dá)與正常細(xì)胞功能維持存在密切聯(lián)系,當(dāng)抗氧化防御系統(tǒng)與ROS平衡遭到破壞時(shí),可引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng),繼而推動(dòng)了帕金森病的發(fā)生、發(fā)展[18-19]。SOD作為抗氧化酶,具有清除自由基的作用,其水平過低可造成ROS在機(jī)體內(nèi)累及,進(jìn)而促進(jìn)了酮基、MDA等降解產(chǎn)物的產(chǎn)生,因此MDA可對(duì)細(xì)胞損傷程度進(jìn)行間接反映,同時(shí)過表達(dá)的MDA可對(duì)線粒體膜造成損傷,進(jìn)而對(duì)其流動(dòng)性、通透性造成影響,使得線粒體內(nèi)Cyt C釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),最終造成細(xì)胞凋亡[20-21]。本研究表明,低表達(dá)lncRNA KCNQ1OT1、干擾miR-132-5p表達(dá)均可減輕降低ROS、MDA水平,提升SOD水平,而lncRNA KCNQ1OT1低表達(dá)和miR-132-5p過表達(dá)可提升ROS、MDA水平,降低SOD表達(dá),表明低表達(dá)lncRNA KCNQ1OT1、干擾miR-132-5p表達(dá)均可抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,而miR-132-5p過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)lncRNA KCNQ1OT1低表達(dá)產(chǎn)生的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷保護(hù)。

帕金森病的主要病理生理標(biāo)志之一為慢性神經(jīng)炎癥,慢性神經(jīng)炎癥可通過激活小膠質(zhì)細(xì)胞核星形膠質(zhì)細(xì)胞而加重多巴胺能神經(jīng)元變性[22]。IL-1β、IL-6、TNF-α均為具有促炎作用的小膠質(zhì)細(xì)胞活化M1表型,可通過激活細(xì)胞凋亡信號(hào)而造成器官損壞甚至衰竭,且可促進(jìn)線粒體產(chǎn)生ROS并釋放細(xì)胞色素,最終造成細(xì)胞凋亡[23]。細(xì)胞凋亡為涉及凋亡相關(guān)基因表達(dá)及產(chǎn)物相互影響、作用、一個(gè)基因級(jí)聯(lián)反應(yīng)的細(xì)胞自我消亡過程,Bcl-2、Bax蛋白均為細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白,分別具有抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用,兩者表達(dá)量與神經(jīng)細(xì)胞凋亡存在密切聯(lián)系[24-25]。本研究表明,低表達(dá)lncRNA KCNQ1OT1、干擾miR-132-5p表達(dá)均可減輕降低IL-1β、IL-6、TNF-α水平、Bax表達(dá),提升Bcl-2表達(dá),而lncRNA KCNQ1OT1低表達(dá)和miR-132-5p過表達(dá)可提升IL-1β、IL-6、TNF-α水平、Bax表達(dá),降低Bcl-2表達(dá),表明低表達(dá)lncRNA KCNQ1OT1、干擾miR-132-5p表達(dá)均可抑制細(xì)胞炎性損傷及凋亡,而miR-132-5p過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)lncRNA KCNQ1OT1低表達(dá)產(chǎn)生的細(xì)胞保護(hù)。

本文通過轉(zhuǎn)染lncRNA KCNQ1OT1抑制劑成功下調(diào)lncRNA KCNQ1OT1表達(dá)后發(fā)現(xiàn)MMP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥損傷及凋亡受抑,同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-132-5p干擾序列后上調(diào)miR-132-5p表達(dá)后發(fā)現(xiàn)lncRNA KCNQ1OT1低表達(dá)造成的細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥損傷及凋亡抑制作用減弱,提示lncRNA KCNQ1OT1低表達(dá)可靶向miR-132-5p而抑制MMP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥損傷及凋亡,發(fā)揮保護(hù)帕金森病細(xì)胞損傷的機(jī)制。說(shuō)明lncRNA KCNQ1OT1、miR-132-5p是帕金森病的潛在分子靶點(diǎn),可為帕金森病臨床診治提供指導(dǎo)。