ACE2對豬流行性腹瀉病毒體外感染傳代豬小腸上皮細胞的影響

任莉鑫,張靜怡,徐沙沙,楊 柳,張興翠*,宋振輝,3*

(1.西南大學動物醫(yī)學院,重慶 402460;2.重慶市畜牧科學院,重慶 402460;3.西南大學醫(yī)學研究院免疫學研究中心,重慶 402460)

豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是引起豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea, PED)的病原,它所引起的傳染病臨床上以新生仔豬水樣腹瀉、脫水、嘔吐等為特征,病理變化主要集中在仔豬小腸,如小腸發(fā)脹透明,小腸絨毛萎縮壞死等。PED具有傳染速度快、傳染方式多、發(fā)病速度快等特點,發(fā)病仔豬死亡率接近100%[1]。PEDV屬于冠狀病毒科α冠狀病毒屬,是有囊膜的單股正鏈RNA病毒。病毒顆粒呈多形性,偏向于圓形,直徑95～190 nm[2]。病毒基因組全長約28 kb,具有7個開放閱讀框(open reading frame, ORF),分別編碼4個結構蛋白,即纖突蛋白(S)、膜蛋白(M)、核衣殼蛋白(N)、包膜蛋白(E)和兩個非結構蛋白[3]。目前,PEDV在全球范圍呈現(xiàn)流行趨勢,給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重經(jīng)濟損失。

血管緊張素轉換酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)的調節(jié)因子,負責維持血壓穩(wěn)態(tài)和水鹽平衡,ACE2不僅影響心血管系統(tǒng),亦在其他器官組織中發(fā)揮作用,例如肝、腸道和骨骼肌功能等[4-6]。目前有研究表明,ACE2是新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的特定功能受體[7],Wan等[8]發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2和嚴重急性呼吸綜合征病毒(SARS-CoV)都通過與ACE2結合進入宿主細胞并感染。且ACE2表達水平與病毒復制水平相關。上調ACE2表達會增強 SARS-CoV-2感染,降低ACE2表達會減輕SARS-CoV-2感染[9-10]。PEDV與SARS-CoV-2同為冠狀病毒科病毒,ACE2有可能與PEDV進入宿主細胞這一過程有關。小腸作為PEDV攻擊的靶器官,ACE2在仔豬胃腸道中的mRNA水平有較高表達,提示ACE2可能參與了斷奶仔豬胃腸系統(tǒng)的生長發(fā)育[11]。另一項研究發(fā)現(xiàn),ACE2主要分布在小腸皺襞和絨毛處,且在空腸上皮細胞的刷狀緣、漿膜層和肌層均有顯著表達,在腸絨毛中多定位于上皮細胞頂端[12]。而PEDV的復制水平上下變化是否與豬腸道ACE2表達水平有關,目前尚未完全定論。

在實驗室前期研究中,對感染PEDV的仔豬小腸組織進行轉錄組分析。結果表明,感染PEDV后ACE2表達水平下調。本研究用PEDV感染IPEC-J2細胞,分別檢測ACE2在mRNA及蛋白水平上表達情況,再通過過表達與抑制ACE2檢測PEDV的感染變化水平,從而探究ACE2與PEDV感染之間的聯(lián)系,為后續(xù)研究PEDV感染機制,防制豬流行性腹瀉病奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細胞及毒株 非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)購自武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心;IPEC-J2細胞購自上海素爾生物技術有限公司;PEDV-LJX株、PEDV-N抗體由中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所惠贈。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、青鏈霉素均購自美國Gibco公司;澳洲胎牛血清購自上海素爾科技有限公司;轉染試劑購自北京全式金生物技術有限公司;RIPA(強)細胞裂解液、蛋白酶抑制劑(PMSF)、BCA蛋白濃度檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司;兔抗ACE2多克隆抗體、鼠抗β-actin單克隆抗體、HRP-山羊抗鼠IgG(H+L)、HRP-山羊抗兔IgG(H+L)均購自美國Proteintech公司;RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT Master Mix、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 轉錄組學測序 將6頭3日齡無TGEV和PEDV感染的榮昌豬分為兩組,即對照組和PEDV感染組,每組各3頭。PEDV組仔豬灌喂PEDV病毒液10 mL(1×107TCID50·mL-1),連續(xù)灌喂兩次,每次間隔4 h,同時對照組仔豬灌喂10 mL 0.9% NaCl。待PEDV 感染組仔豬出現(xiàn)明顯癥狀后,對各組仔豬進行剖殺,分別取健康仔豬和發(fā)病腹瀉仔豬的空腸,并用PBS溶液將腸道內容物清洗干凈,液氮速凍后送往杭州聯(lián)川生物技術股份有限公司進行轉錄組學測序,所得數(shù)據(jù)上傳至聯(lián)川生物云平臺(https://www.omicstudio.cn/)進行分析。仔豬整個試驗過程的處理按照西南大學動物倫理委員會制定的指南進行(CQLA-2020-0117)。

1.2.2 PEDV感染IPEC-J2細胞 將IPEC-J2細胞以每孔1.2×106細胞密度接種于6孔板中,直至細胞融合度達到約90%,棄掉培養(yǎng)液,用 PBS洗滌細胞2次,每孔加入 PEDV 病毒液(MOI=0.1),每組設3個重復,培養(yǎng)2 h后,棄去病毒液,PBS洗滌2次后,每孔加入2 mL新鮮的1640基礎培養(yǎng)基。

1.2.3 RT-qPCR法測定ACE2、PEDVN基因表達水平 按照RNAiso Plus說明書對細胞總RNA進行提取,測定RNA濃度后將提取的RNA根據(jù) TaKaRa公司PrimeScriptTMRT Master Mix說明書反轉錄擴增合成cDNA,并按照100 ng·μL-1進行稀釋。以稀釋后的cDNA為模板,按照 TaKaRa公司SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ說明書利用特異性引物(表1)進行檢測,每組樣品設立3個重復,并設立陰性對照。取平均Ct值,采用2-△△Ct法分析試驗數(shù)據(jù)。

表1 qPCR引物序列

1.2.4 Western blot法測定ACE2、PEDV N蛋白表達水平 使用RIPA(強)細胞裂解液從細胞中提取總蛋白,并使用BCA蛋白濃度檢測試劑盒確定蛋白濃度。蛋白樣品通過5%濃縮膠、8%分離膠進行SDS-PAGE電泳,并轉移到PVDF膜上。利用5%脫脂奶粉進行封閉,隨后將一抗過夜孵育,最后分別用HRP偶聯(lián)山羊抗鼠 IgG、HRP偶聯(lián)山羊抗兔IgG作為二抗進行孵育。利用VILBER FX5成像系統(tǒng)獲得曝光圖像。分析目的蛋白及內參蛋白的灰度值,計算蛋白的相對表達量。

1.2.5 重組表達質粒的構建與鑒定,shRNA干擾質粒的構建與選擇 重組表達質粒與shRNA干擾質粒由武漢金開瑞生物工程有限公司進行構建。重組表達質粒利用雙酶切法進行鑒定。利用限制性核酸內切酶BamHⅠ、NheⅠ對pEGFP-ACE2進行酶切,酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

根據(jù)ACE2的全長序列設計shRNA干擾片段并構建干擾質粒,選擇評分最高的3個分別連接到pLVX質粒上,shRNA序列如表2。

表2 shRNA干擾片段序列

1.2.6 質粒轉染 將細胞瓶中融合度為85%～95%且形態(tài)良好的 IPEC-J2細胞以每孔1.2×106細胞接種于6孔細胞板中,待細胞密度達到70%時,根據(jù)全式金公司TransIntro?EL Transfection Reagent轉染試劑的使用說明將ACE2過表達與干擾質粒進行轉染,6 h后棄去轉染復合物,用PBS洗滌細胞2次,并更換為維持培養(yǎng)基。

1.2.7 TCID50測定PEDV病毒滴度 將生長良好的Vero細胞按每孔4×104細胞接種于96孔板,于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞至 90%左右時,用PBS輕輕洗滌3次。分別用DMEM基礎培養(yǎng)基將收集的病毒液按10-1～10-7的稀釋度進行倍比稀釋,于96孔板中每孔加入100 μL稀釋后的病毒液,設立3組重復,每組設立6個復孔,從高至低濃度加入,同時設立陰性對照組。37 ℃、5%CO2孵育2 h后,棄去病毒液,用PBS清洗3次后更換為100 μL維持液繼續(xù)培養(yǎng),72 h后記錄每個稀釋度病變孔數(shù),按照 Reed-Muench公式計算各組的TCID50。

1.3 統(tǒng)計分析

所有計算均使用 GraphPad Prism 7.0進行。所有數(shù)據(jù)均用帶有來自3個獨立試驗的平均值的標準誤差表示。采用單因素方差分析(ANOVA)和t檢驗確定多組間的統(tǒng)計學差異。P<0.05表示差異顯著(*),P<0.01表示差異極顯著(**)。

2 結 果

2.1 轉錄組學分析

PEDV感染仔豬腸道轉錄組學數(shù)據(jù)分析結果顯示,與對照組相比,PEDV感染組ACE2表達水平顯著下降(圖1a)。對轉錄組結果進行驗證,采用仔豬腸道組織進行RT-qPCR,檢測PEDV感染前后ACE2 mRNA表達水平的變化。結果顯示,感染PEDV后ACE2轉錄水平顯著下降(圖1b)。

A. PEDV感染仔豬腸道轉錄組學分析ACE2熱圖;b. RT-qPCR驗證ACE2 mRNA表達水平, **. P<0.01a. Transcriptomic analysis of the intestinal tract of PEDV-infected piglets ACE2 heat map; b. RT-qPCR to verify ACE2 mRNA expression level, **. P<0.01

2.2 PEDV感染IPEC-J2細胞對ACE2表達的影響

通過對4個時間點(12、24、36、48 h)的2個試驗組(陰性對照組、PEDV-LJX組)進行RT-qPCR檢測。結果顯示,與陰性對照組相比,PEDV感染組ACE2 mRNA表達水平下降,在24、36 h時PEDV感染顯著下降(P<0.05,P<0.01)(圖2a)。Western blot結果顯示,與陰性對照組相比,PEDV感染組ACE2 蛋白表達水平下降,在36 h時PEDV感染組顯著下降(P<0.01)。綜上所述,PEDV感染IPEC-J2細胞后,ACE2的表達水平降低(圖2b、c)。

A. RT-qPCR法測定PEDV感染IPEC-J2細胞后ACE2 mRNA表達量;b. Western blot法測定PEDV感染IPEC-J2細胞后ACE2 蛋白結果圖;c. 蛋白灰度分析ACE2表達量。*. P<0.05,**. P<0.01a. Determination of ACE2 mRNA expression after PEDV infection of IPEC-J2 cells by RT-qPCR; b. Western blot assay for ACE2 protein after PEDV infection of IPEC-J2 cells; c. Protein grayscale analysis of ACE2 expression. *. P<0.05,**. P<0.01

2.3 重組表達質粒 pEGFP-ACE2鑒定

由于構建的過表達質粒中有NheⅠ與BamHⅠ酶切位點,利用限制性核酸內切酶NheⅠ與BamHⅠ對pEGFP-ACE2重組質粒進行雙酶切鑒定。結果如圖3所示,在5 314和2 451 bp處各有一條帶,重組質粒pEGFP-ACE2構建成功。測序結果表明ACE2片段插入位點正確。

M. DNA相對分子質量標準;1.雙酶切(NheⅠ、BamHⅠ)重組pEGFP-ACE2質粒;2.重組pEGFP-ACE2質粒M. DNA marker; 1. Double digestion (NheⅠ, BamHⅠ) of recombinant pEGFP-ACE2 plasmid; 2. Recombinant pEGFP-ACE2 plasmid

2.4 pEGFP-ACE2轉染結果與過表達效率

使用倒置熒光顯微鏡觀察pEGFP-ACE2轉染的IPEC-J2細胞。結果顯示,在質粒轉染后12～96 h內ACE2蛋白在IPEC-J2細胞中穩(wěn)定表達(圖4a)。Western blot結果顯示,與未轉染組相比,轉染pEGFP-ACE2組ACE2表達水平顯著上調(P<0.05)(圖4b、c),重組質粒在48 h內可在IPEC-J2細胞中表達,能夠用于后續(xù)試驗。

A. 不同時間pEGFP-ACE2在IPEC-J2細胞的表達情況;b、c. Western blot法測定pEGFP-ACE2在IPEC-J2細胞表達ACE2蛋白水平,*. P<0.05a. Expression of pEGFP-ACE2 in IPEC-J2 cells at different times; b, c. Western blot assay to determine pEGFP-ACE2 in IPEC-J2 cells expressing ACE2 protein level, *. P<0.05

2.5 過表達ACE2后PEDV感染情況的變化

2.5.1 RT-qPCR檢測過表達ACE2后PEDVN基因表達水平的變化 通過對4個時間點(12、24、36、48 h)的2個試驗組(PEDV-LJX組、pEGFP-ACE2+PEDV-LJX組)進行RT-qPCR檢測。結果顯示,與對照組相比,在4個時間點過表達ACE2組PEDVNmRNA表達水平均顯著上調(P<0.05,P<0.01)(圖5)。

*. P<0.05,**. P<0.01

2.5.2 過表達ACE2后PEDV N蛋白表達水平的變化 采用Western blot對4個時間點(12、24、36、48 h)的2個試驗組(PEDV-LJX組、pEGFP-ACE2+PEDV-LJX組)總蛋白檢測。結果顯示,與對照組相比,過表達ACE2組PEDV N蛋白表達水平呈上升趨勢,并在24 h時顯著上升(P<0.05)(圖6)。綜上所述,過表達ACE2后PEDV N表達水平升高。

A.過表達ACE2后PEDV N蛋白表達量變化Western blot結果圖;b. 蛋白灰度分析PEDV N蛋白表達量變化情況,*. P<0.05a. Western blot results of changes in PEDV N protein expression after overexpression of ACE2; b. Protein grayscale analysis of PEDV N protein expression changes, *. P<0.05

2.5.3 TCID50測定ACE2過表達后PEDV病毒滴度 對4個時間點(12、24、36、48 h)的2個試驗組(PEDV-LJX組、pEGFP-ACE2+PEDV-LJX組)進行TCID50試驗。結果顯示(圖7),ACE2過表達組的病毒滴度升高,且在12、48 h時顯著高于PEDV攻毒組(P<0.05,P<0.01)。

*. P<0.05,**. P<0.01

2.6 ACE2 shRNA干擾質粒 pLVX-shRNA鑒定

為了篩選出干擾效果最好的干擾質粒,將pLVX-shRNA-1、pLVX-shRNA-2、pLVX-shRNA-3分別轉染至IPEC-J2細胞中,穩(wěn)定表達24 h后,收集細胞總蛋白,利用Western blot檢測細胞中ACE2的表達量變化情況。結果如圖8b、c顯示,與未轉染組相比,轉染了pLVX-shRNA-2質粒的ACE2表達量下降最為顯著(P<0.05),表明干擾質粒pLVX-shRNA-2能夠使細胞內的ACE2表達水平下降。將pLVX-shRNA-2質粒轉染至IPEC-J2細胞中,使用倒置熒光顯微鏡觀察干擾質粒熒光表達情況,結果表示在12～96 h內質?？梢苑€(wěn)定表達(圖8a)。綜上所述,pLVX-shRNA-2可用于后續(xù)試驗中驗證調控ACE2對PEDV感染IPEC-J2細胞的影響。

A. 不同時間經(jīng)pLVX-shRNA-2干擾后ACE2在IPEC-J2細胞表達情況;b. 3個pLVX-shRNA在IPEC-J2細胞干擾表達ACE2 蛋白后Western blot結果圖;c. 蛋白灰度分析ACE2蛋白表達量變化情況,*. P<0.05a. ACE2 expression in IPEC-J2 cells after pLVX-shRNA-2 interference at different times; b. Plot of Western blot results of three pLVX-shRNAs after interference with ACE2 protein expression in IPEC-J2 cells; c. Protein grayscale analysis of changes in ACE2 protein expression, *. P<0.05

2.7 干擾ACE2表達后對PEDV感染IPEC-J2的影響

2.7.1 RT-qPCR檢測干擾ACE2表達后PEDVN基因表達變化 通過 RT-qPCR 對不同時間點(12、24、36、48 h)對照組(PEDV-LJX組)和試驗組(pLVX-shRNA2+PEDV-LJX組)的mRNA進行檢測,以探究 pLVX-shRNA2處理IPEC-J2細胞后對PEDV 感染細胞的影響。分析結果如圖9所示,可以發(fā)現(xiàn)與對照組相比,pLVX-shRNA2+PEDV-LJX組PEDVNmRNA表達水平下降,且在12、24、36、48 h時均顯著下降(P<0.01)。意味著ACE2下調能夠抑制PEDV感染IPEC-J2細胞。

**. P<0.01

2.7.2 Western blot檢測干擾ACE2表達后PEDV N蛋白表達變化 采集4個時間點(12、24、36、48 h)3個試驗組(空白對照組、PEDV-LJX組、pLVX-shRNA-2+PEDV-LJX組)的總蛋白并進行 Western blot 試驗以檢測細胞內PEDV N蛋白表達的變化。結果如圖10所示,與對照組相比,pLVX-shRNA-2+PEDV組PEDV N蛋白表達量呈下降趨勢,并在12、24、36、48 h時分別顯著下降(P<0.05,P<0.01),意味著通過抑制ACE2表達能夠下調PEDV感染IPEC-J2細胞水平。

A.干擾ACE2表達后PEDV N蛋白表達量變化Western blot結果圖;b. 蛋白灰度分析PEDV N蛋白表達量變化情況, *. P<0.05,**. P<0.01a. Western blot results of PEDV N protein expression changes after interference with ACE2 expression; b. Protein grayscale analysis of changes in PEDV N protein expression, *. P<0.05,**. P<0.01

2.7.3 TCID50測定干擾ACE2表達后PEDV病毒滴度 采集4個時間點(12、24、36、48 h)2個試驗組(PEDV-LJX組、pLVX-shRNA-2+PEDV組)細胞上清液進行TCID50測定。結果如圖11顯示,相對于PEDV-LJX組,pLVX-shRNA-2+PEDV組病毒滴度有所下降,且在24、48 h時顯著低于PEDV-LJX組(P<0.05,P<0.01)。即再次確證降低ACE2表達水平可抑制PEDV感染IPEC-J2細胞水平。

**. P<0.01

3 討 論

目前,豬流行性腹瀉(PED)已被國家農業(yè)農村部列為二類疫病,自20世紀70年代出現(xiàn)以來,PED在世界大部分地區(qū)流行,引起以嘔吐、腹瀉和脫水為特征的傳染性腸道疾病,導致新生仔豬死亡率高。在經(jīng)過長時間的廣泛傳播后,PEDV進化出具有毒力、傳染性和致病性更強的突變毒株,給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的損失[13]。但市面上已有的疫苗保護效果較差,難以從根源上防控該病[14-15],而特效治療藥物尚未研發(fā)成功,且該病傳染性強,藥物治療也將耗資巨大,并且更令人關注的是,病毒的變異性以及藥物交叉保護的影響、耐藥性的產(chǎn)生也是要面臨的一大困難[16]。由此可見,加快對PEDV感染機制的研究,為研發(fā)抗病毒疫苗及有效藥物奠定理論基礎顯得十分重要[17-18]。

PEDV進入細胞是通過其S蛋白與宿主細胞受體結合開始的,受體識別是病毒宿主范圍和細胞嗜性的關鍵決定因素。先前的研究普遍認為,豬氨基肽酶(pAPN)是PEDV進入宿主細胞的受體[19-21],PEDV S蛋白通過與pAPN結合介導PEDV進入宿主細胞,而近幾年的研究表明并非如此。Li等[22]認為pAPN不是豬流行性腹瀉病毒進入細胞所必需的,此結論在Ji等[23]的研究中也得到了證實,因此pAPN可能僅在PEDV感染過程中發(fā)揮輔助性作用,真正的功能性受體還有待進一步探究。而目前已有研究表明,ACE2是SARS-CoV-2的特定功能受體[7]。在冠狀病毒的傳播中發(fā)揮重要作用。作為RAS的關鍵調節(jié)蛋白,ACE2除了能維持心血管功能的穩(wěn)定性,還在調節(jié)先天免疫并影響腸道微生物群的組成,協(xié)助腸道物質的運輸從而抵抗炎性損傷等方面發(fā)揮著重要作用[24]。ACE2在豬鼻黏膜中均無表達,但在豬小腸中廣泛存在,尤其是上皮細胞的刷狀緣和小腸絨毛的頂端,這使得其主要在腸道中發(fā)揮作用,因此可能更傾向于作為與豬腸道冠狀病毒相結合的受體[25]。在先天免疫方面,有研究顯示ACE2在豬小腸上皮細胞中作為跨膜蛋白表達,ACE2通過抑制NF-kB途徑中p65的磷酸化水平和MAPK途徑中的ERK1/2來發(fā)揮抗炎作用[26]。以上研究表明ACE2可以在腸道發(fā)揮作用且可以應答冠狀病毒感染。

為了明確ACE2在冠狀病毒PEDV感染過程中是否也發(fā)揮了一定的作用,本試驗室前期通過轉錄組測序發(fā)現(xiàn)了在感染PEDV后,仔豬腸道中ACE2表達顯著下調,基于此,作者研究了ACE2蛋白在PEDV感染后的表達水平。結果顯示,PEDV感染IPEC-J2細胞后,ACE2的表達水平顯著下降,與轉錄組測序結果一致。將ACE2過表達后PEDV感染上升,這與沈海燕等[27]研究結果相似,即PEDV在穩(wěn)定表達ACE2的IPEC-J2細胞中比在IPEC-J2細胞中的增殖能力明顯升高;而干擾ACE2表達會抑制PEDV在IPEC-J2細胞中的感染,使PEDV復制水平降低。試驗結果提示,ACE2可能與PEDV感染有關,ACE2在PEDV感染過程中發(fā)揮重要作用。但ACE2在調控PEDV感染過程中的作用機制及PEDV S蛋白是否參與其中的互作或識別尚不明確,有待進一步研究。

4 結 論

豬流行性腹瀉病毒(PEDV)感染豬小腸上皮細胞(IPEC-J2)后血管緊張素轉換酶2(ACE2)在mRNA及蛋白水平表達均顯著下調,過表達ACE2組能提高PEDV復制水平,抑制ACE2的表達,可降低PEDV復制水平。