妊娠相關(guān)糖蛋白的生物學(xué)功能及其在畜牧生產(chǎn)中的研究進展

鐘朱夏,胡修忠,向 敏,余 婕,劉辰暉,趙勝蘭,萬平民,王定發(fā),周 源,程 蕾

(武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,武漢 430208)

盡早確定母畜妊娠與否以及診斷并預(yù)測妊娠過程中胚胎丟失,以盡快對未孕母畜進行再授精,可提高母畜繁殖效率,縮短母畜產(chǎn)犢-受孕間隔,對于提高養(yǎng)殖農(nóng)場的經(jīng)濟效益至關(guān)重要。妊娠相關(guān)糖蛋白(pregnancy associated glycoproteins,PAGs)是胎盤滋養(yǎng)層細胞合成和分泌的一類龐大的糖蛋白家族,屬于天冬氨酸蛋白酶家族成員[1-2]。在妊娠期間,反芻動物胎兒胎盤單核滋養(yǎng)層細胞以無細胞分裂的連續(xù)核分裂形成雙核滋養(yǎng)層細胞,向母體子宮上皮細胞遷移、融合形成三核細胞所替代,并通過胞吐作用釋放包括PAGs等顆粒物質(zhì)傳遞到母體血液循環(huán)中[3-4],常作為早期妊娠診斷的生物標(biāo)志物[5-6]。目前,PAGs在妊娠期間的功能尚不清楚。因此,本文主要綜述PAGs的生物學(xué)功能及其在家畜生產(chǎn)中的應(yīng)用研究進展,為進一步深入研究PAGs功能和開發(fā)推廣PAGs在畜牧生產(chǎn)中應(yīng)用提供參考。

1 PAGs家族起源及特征

Butler等[7]在1982年利用免疫電泳法首次從妊娠牛胎盤中分離純化得到分子量大小為47～53 ku,等電點為4.0～4.4的妊娠特異性蛋白,并將其命名為妊娠特異性蛋白B(pregnancy specific protein B,PSPB)。隨后,1991年Zoli等[8]從妊娠2～6月齡的牛胎盤子葉中分離純化出分子量大小為67 ku的蛋白,命名為PAG1。PAGs屬于天冬氨酸蛋白酶超家族(aspartic proteinases superfamily,AP)的一類糖蛋白[1],其特征是識別位點周圍存在天冬氨酸殘基,具有典型的兩個雙葉的三級結(jié)構(gòu)(酶催化中心位于該結(jié)構(gòu)內(nèi)),與胃蛋白酶、腎素、組織蛋白酶D、組織蛋白酶E和凝乳酶氨基酸序列相似性達50%以上[9-10]。Hughes等[11]根據(jù)PAGs出現(xiàn)時間將其分為“古代組”和“現(xiàn)代組”兩個類群,“古代組”起源于8 700萬年前,經(jīng)進化在5 200萬年前形成“現(xiàn)代組”。但是,“現(xiàn)代組”中大多數(shù)PAGs的酶催化中心關(guān)鍵堿基發(fā)生突變,使其失去了催化活性,如boPAG1中甘氨酸被丙氨酸所取代而不具有酶活性[12-13];“古代組”PAGs保留了酶催化中心的關(guān)鍵堿基,可能仍具有酶活性[14-15],而PAGs在母胎界面的蛋白水解酶活性在妊娠期間的功能仍不清楚,值得進一步深入挖掘。

Green等[16]發(fā)現(xiàn),“古代組”PAGs在整個滋養(yǎng)外胚層細胞和子宮內(nèi)膜的連接處表達包括oPAG-2、bPAG-2、bPAG-8、bPAG-10和bPAG-11,同時發(fā)現(xiàn)bPAG-1,bPAG-6和bPAG-7在妊娠中期至晚期都存在,而bPAG-4、bPAG-5和bPAG-9在妊娠第25天開始表達,但不存在于妊娠晚期,而“現(xiàn)代組”PAGs表達局限于雙核滋養(yǎng)層巨細胞,表明PAGs在妊娠期間存在時空表達特異性。在反芻動物中,PAGs基因家族數(shù)量龐大且復(fù)雜。在牛、綿羊、山羊、鹿和水牛中分別鑒定出22個boPAG[1,16-18]、11個ovPAG[13-17]、12個caPAG[18-19]、10個cePAG[20]和20個wtPAG成員[6,21],可能存在更多的PAGs基因有待進一步發(fā)現(xiàn)。

2 PAGs的生物學(xué)功能

2.1 免疫調(diào)節(jié)作用

“古代組”PAGs主要在母胎界面微絨毛連接處表達,能夠促進胚胎滋養(yǎng)層細胞和子宮上皮細胞相連接,建立免疫屏障;“現(xiàn)代組”PAGs主要在滋養(yǎng)外胚層巨細胞中表達,具有調(diào)節(jié)母體免疫系統(tǒng)的作用[22]。研究發(fā)現(xiàn),使用濃度為2 400 ng·mL-1的bPAG處理骨髓祖細胞能夠抑制其增殖[23]。Roberts等[10]研究表明,PAGs可能能夠與肽競爭性被主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)識別和結(jié)合以抑制T淋巴細胞的激活從而在母胎界面發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。有研究表明,PAGs在體外能夠與綿羊子宮絲氨酸蛋白酶抑制劑(ovine uterine serpin,ovUS-1)結(jié)合,可能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)活性[24]。Telugu等[14-15]發(fā)現(xiàn)重組表達的poPAG-1和poPAG-2具有蛋白水解活性,可能參與刺激局部生長因子的生成[25-26]。Austin等[27]研究發(fā)現(xiàn),PSPB可以誘導(dǎo)牛子宮內(nèi)膜細胞中嗜中性粒細胞趨化蛋白2(granulocyte chemotactic protein-2,GCP-2)的分泌,可能參與早期植入過程中胚胎黏附、炎癥反應(yīng)和血管生成。Barbato等[28]利用RT-qPCR研究發(fā)現(xiàn),PAG-2 mRNA在人工授精后18 d妊娠牛外周血單核細胞和粒細胞中表達,并且人工授精后14、18、28和40 d妊娠牛外周血單核細胞和粒細胞中PAG-2 mRNA表達水平高于空懷牛,且妊娠牛粒細胞中PAG-2 mRNA表達水平高于外周血單核細胞。Casano等[29]發(fā)現(xiàn),在圍著床期直至妊娠40 d水牛外周血單核細胞和多形核白細胞中IFN-τ和干擾素刺激基因(OAS1、MX2和ISG15)mRNA表達水平高于未妊娠水牛,且與外周血漿中PAGs的濃度呈顯著正相關(guān),說明PAGs可能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用參與妊娠識別與建立過程。Wallace等[30]從妊娠150 d牛胎盤子葉組織中分離出PAG-4、PAG-6和PAG-9蛋白分別處理人工授精后18 d的妊娠和空懷牛子宮外植體,發(fā)現(xiàn)未妊娠和妊娠牛子宮外植體中子宮重塑相關(guān)基因(EMMPRIN、MMP1、MMP3、MMP7、MMP9、PLAU和TIMP2)和干擾素刺激基因(IFI6和ISG15)mRNA表達水平在PAGs處理24或96 h后上調(diào)表達,同樣地,CXCL5和PTGES基因mRNA也上調(diào)表達,與Austin等[27]的研究結(jié)果相一致,說明PAGs通過影響子宮內(nèi)膜中細胞外基質(zhì)周轉(zhuǎn)參與子宮重塑和胎兒侵襲從而形成一個有利于胎盤形成的微環(huán)境。Hooshmandabbasi等[31]研究發(fā)現(xiàn),與胎盤正常娩出的奶牛相比,胎盤滯留奶牛個體中PAGs陽性雙核滋養(yǎng)層細胞數(shù)量和“現(xiàn)代組”PAGsmRNA表達水平更高,而在血清中無顯著差異,可能沉積在母體間隔基質(zhì)中的“現(xiàn)代組”PAGs發(fā)揮局部的免疫抑制作用進而延遲胎盤的脫落進程。以上研究表明PAGs可能參與妊娠的識別與建立、妊娠維持以及產(chǎn)犢前后免疫功能的抑制。

2.2 促黃體生成作用

研究顯示,反芻動物妊娠期間孕酮的來源是黃體和胎盤,前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)發(fā)揮著抗黃體溶解和促黃體生成的作用[32]。Del Vecchio等[33]用PSPB或與催產(chǎn)素一起對發(fā)情周期第16天的子宮內(nèi)膜外植體進行處理,發(fā)現(xiàn)前列腺素E2和前列腺素F2α(prostaglandin F2α,PGF2α)的分泌增加[34],同時研究發(fā)現(xiàn)用PSPB處理牛黃體細胞后不影響催產(chǎn)素的產(chǎn)生,但會促進孕酮和PGE2的分泌,PGF2α分泌量也升高[35]。Weems等[36]也發(fā)現(xiàn),PSPB處理妊娠88～90 d綿羊黃體細胞顯著提高PGE2和孕酮的分泌,進一步研究發(fā)現(xiàn)PSPB可能通過刺激卵巢黃體、胎盤和子宮肉阜組織中PGE2分泌來調(diào)節(jié)妊娠50～90 d黃體中孕酮分泌[37-39]。上述結(jié)果表明,PSPB作為一種促黃體生成因子通過刺激胎盤/子宮肉阜中PGE2分泌進而調(diào)節(jié)黃體中孕酮的合成以維持妊娠。

綜上所述,PAGs可能參與母胎界面的免疫調(diào)節(jié)以保護胎兒免受免疫排斥以及妊娠終止時胎兒的及時娩出,同時也參與妊娠相關(guān)激素的合成來為胚胎提供成功著床的條件和穩(wěn)定發(fā)育的環(huán)境。

3 PAGs在家畜生產(chǎn)中的應(yīng)用

3.1 診斷妊娠與否

在規(guī)?；?、現(xiàn)代化牧場的飼養(yǎng)管理中,提高母畜產(chǎn)犢率、保持理想的產(chǎn)犢間隔決定著養(yǎng)殖企業(yè)的經(jīng)濟效益。母畜配種后,及時且準(zhǔn)確的妊娠診斷可以有效縮短配種期進而保證較短的空懷周期,從而有效地提高繁殖效率。即使由經(jīng)驗豐富的技術(shù)人員進行直腸觸診,而直至人工授精后35～40 d仍難以準(zhǔn)確判斷妊娠與否。

近年以來,由于分子生物學(xué)方法的快速發(fā)展,已有許多學(xué)者嘗試鑒定牛羊等妊娠的生物標(biāo)志物。PAGs一直是主要的研究對象,且商業(yè)化的妊娠診斷試劑盒已經(jīng)應(yīng)用于牛羊等早期妊娠診斷[40-42],目前,美國IDEXX和BioTracking公司均有基于PAGs或PSPB的ELISA商品化試劑盒,均能在配種28 d后檢測奶牛是否妊娠。Commun等[43]利用基于2種妊娠相關(guān)糖蛋白的ELISA方法對人工授精后16、30、41和53 d奶牛血清、血漿和牛奶進行檢測,發(fā)現(xiàn)人工授精后30～53 d檢測妊娠準(zhǔn)確度較高。Barbato等[44]利用RT-qPCR對水牛人工授精后0、18、28、40和75 d血細胞中PAG-2 mRNA進行檢測,發(fā)現(xiàn)PAG-2 mRNA在妊娠18 d、D28(+)D40(-)和D28(-)D40(-)組中表達,但其水平低于D28(+)D40(+)組,且與PAG-1相比更早地在外周血細胞中被檢測到,可用于研究早期妊娠和胚胎死亡。據(jù)報道,PAG-1在母體血清中表現(xiàn)出較長的半衰期,可在產(chǎn)后80～100 d檢測到,從而使在產(chǎn)后60 d內(nèi)配種的動物中產(chǎn)生假陽性[45]。Lu等[46]利用血清輔助的指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)獲得ovPAG7特異性結(jié)合的DNA單鏈適配體,將其用于人工授精后22和28 d母羊血清檢測發(fā)現(xiàn)診斷靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性較高,是檢測母羊妊娠的有效方法。李志明等[47-48]通過原核表達方式獲得PAG-6蛋白制備了多克隆抗體,建立了一種牛妊娠相關(guān)糖蛋白6快速檢測試紙條方法,用于奶牛早期妊娠診斷效果良好。

3.2 預(yù)測和診斷胚胎附著、胚胎丟失、胚胎數(shù)量以及性別

研究顯示,在胚胎附植至妊娠期間胎盤雙核滋養(yǎng)層細胞約占所有滋養(yǎng)層細胞數(shù)量的20%,而在妊娠末期數(shù)量降低[49]。胎盤發(fā)育因胎兒的數(shù)量、性別、大小和體重而異,胎盤雙核滋養(yǎng)層細胞的數(shù)量隨著胎盤質(zhì)量和胎兒數(shù)量的增加而增加。Middleton等[50]使用BioPRYN ELISA試劑盒對人工授精后15～35 d的小母牛和泌乳奶牛血清中PSPB進行檢測,發(fā)現(xiàn)與泌乳奶牛相比,小母牛的PSPB濃度增加時間更早,循環(huán)濃度更高,以血清PSPB的OD水平從基線開始升高≥10%且隨后2 d從基線繼續(xù)升高≥10%的那一天作為胚胎附著的標(biāo)志,與初產(chǎn)或經(jīng)產(chǎn)奶牛相比,未生育小母牛的胚胎附著時間更早。El Amiri等[51]使用放射免疫系統(tǒng)對人工授精后0～49 d母羊血漿和羊奶中PAGs濃度進行測定,發(fā)現(xiàn)在人工授精后20 d的妊娠母羊血漿和羊奶中可檢測到PAGs存在且雙胎妊娠血漿和羊奶中PAGs濃度顯著高于單胎妊娠。Alkan等[52]利用IDEXX試劑盒對179頭妊娠40～60 d母羊進行檢測,發(fā)現(xiàn)在妊娠早期40～50 d雙胎妊娠母羊PAGs濃度高于單胎妊娠母羊,而在不同妊娠時間攜帶雄性和雌性胎兒的母羊中PAGs濃度之間無顯著差異,可能是雙胎妊娠具有多個附植部位,胎盤體積增大,雙核滋養(yǎng)層細胞數(shù)量增加,導(dǎo)致PAGs分泌量增加。Ranilla等[53]發(fā)現(xiàn),在懷孕第19、20和21周雄性胎兒的母羊的PAGs濃度高于攜帶雌性胎兒的母羊,與Alkan等[52]的研究結(jié)果不一致,可能與不同的妊娠時期有關(guān)。

在妊娠期間,胚胎死亡可能發(fā)生在早期或晚期,被認(rèn)為是造成繁殖失敗的主要原因[54]。研究顯示,在接受胚胎移植和人工授精后28～30 d妊娠成功建立并維持妊娠至60～72 d的奶牛血清中bPAGs濃度顯著高于同一時間妊娠成功建立但未維持妊娠[55]。Pohler等[56]利用邏輯回歸模型發(fā)現(xiàn),在肉牛妊娠28 d血清中bPAGs濃度大于7.9或低于0.72 ng·mL-1時預(yù)測胚胎維持至第95天存活或死亡的準(zhǔn)確率高達95%以上,可作為牛晚期胚胎死亡的標(biāo)志物。Peixoto等[57]發(fā)現(xiàn),人工授精后37 d雙胎妊娠和胚胎丟失荷斯坦奶牛血漿PAGs的濃度無明顯變化且其不能有效地預(yù)測荷斯坦奶牛胚胎丟失和雙胎妊娠的閾值。以上研究表明,不同的抗體組合能夠識別不同的PAGs或不同數(shù)量的PAGs異構(gòu)體,檢測方法不同和抗體特異性差異可能會影響妊娠丟失診斷的準(zhǔn)確性。此外,Panasiewicz等[58]對雜交母豬pPAG2-Ls基因研究共發(fā)現(xiàn)196個SNPs,包括9個外顯子和8個(A～H)內(nèi)含子,其中位于第6外顯子雙倍型(657C>T/749G>C)導(dǎo)致多肽前體中氨基酸替換(Asp220→Asn和Ser250→Thr)與產(chǎn)活仔豬數(shù)量增加有關(guān),內(nèi)含子F中504G>A與產(chǎn)活仔豬數(shù)和斷奶仔豬數(shù)增加有關(guān),可為豬選種選育提供重要參考。

3.3 監(jiān)測胎兒的生長發(fā)育和胎盤功能

PAGs除了作為妊娠診斷的生物標(biāo)志物外,也可用于監(jiān)測胎兒的生長發(fā)育和胎盤的功能。Lpez-Gatius等[59]研究發(fā)現(xiàn),感染犬新孢子蟲發(fā)生流產(chǎn)和木乃伊胎兒的奶牛血清中PAG-1濃度較低或無法檢測,說明PAG-1可能是評估胎兒-胎盤狀態(tài)的有效指征。García-Ispierto等[60]發(fā)現(xiàn),妊娠120 d荷斯坦奶牛血漿PAG-2濃度可以作為感染犬新孢子蟲流產(chǎn)風(fēng)險的指標(biāo),當(dāng)數(shù)值<4.5 ng·mL-1表明慢性感染的動物流產(chǎn)風(fēng)險高。Mur-Novales等[61-62]對妊娠110 d懷孕母牛感染犬新孢子蟲進行研究,發(fā)現(xiàn)未流產(chǎn)母牛在感染14 d內(nèi)血漿PAG-1和PAG-2水平呈現(xiàn)下降,感染42 d單核和雙核滋養(yǎng)層細胞比例減少以及胎兒羊水和尿囊中PAG-1和PAG-2濃度顯著高于未感染胎兒,且受感染流產(chǎn)母牛血漿中PAGs濃度急劇降低,說明PAGs可能與感染后不同程度的胎盤損傷和無法維持的妊娠有關(guān)。此外,Lear等[63]對妊娠65 d母羊接種非細胞病變性牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)株1b,發(fā)現(xiàn)妊娠80 d感染BVDV的母羊和胎兒血清中PAG-1濃度明顯降低以及滋養(yǎng)細胞損傷,表明PAG-1濃度可作為BVDV感染期間評估胎盤功能的指標(biāo)。越來越多的研究表明,PAGs濃度變化與胎兒存活和胎盤健康有關(guān),但仍需進一步研究母體-胎兒不良妊娠結(jié)局與PAGs產(chǎn)生及功能改變之間的關(guān)系進而闡明PAGs作為評估母胎單位的生物標(biāo)志物。

4 展 望

PAGs是偶蹄目動物胎盤產(chǎn)生的特異性糖蛋白家族,其作為妊娠診斷的生物標(biāo)志物具有妊娠早期特異性表達和能夠進入母體血液循環(huán)等特點,近年來被廣泛研究。雖然PAGs在胎盤-子宮界面發(fā)揮多種生物學(xué)功能,但是大多數(shù)PAGs家族成員在妊娠期間的表達表現(xiàn)為復(fù)雜的時間和空間表達模式,并且釋放到母體血液中為作用于靶組織和靶細胞提供了眾多的可能性,并且提純單一PAGs家族成員難度較大。目前已有多種PAGs分子診斷試劑被開發(fā),但因面臨其靈敏度、準(zhǔn)確性和特異性不強等問題,制約了PAGs在畜牧生產(chǎn)中的發(fā)展應(yīng)用。針對這一問題,可通過對妊娠不同時期表達的PAGs進行天然提純,制備并篩選單克隆抗體雜交瘤細胞以獲得不同PAGs成員抗體或核酸適配體,對不同PAGs成員抗體或核酸適配體進行組裝實現(xiàn)對母畜妊娠診斷和監(jiān)測胎兒生長發(fā)育。隨著生物技術(shù)的不斷創(chuàng)新與發(fā)展,可利用基因組、蛋白組、代謝組等多組學(xué)技術(shù)對雙核或多核滋養(yǎng)層細胞進行研究以鑒定新的妊娠診斷標(biāo)志物;可利用生物信息學(xué)等技術(shù)豐富PAGs分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及探究PAGs家族在妊娠維持和胎盤發(fā)育中的功能,這將對于畜牧業(yè)的長遠發(fā)展具有十分深遠的意義。