致腦膜炎豬鏈球菌2型的分子分型鑒定及其生物學(xué)特性

李芃緒,李世景,孫 駿,項(xiàng) 維,趙苗苗,侯天牧,李華明,廣 敏,陳瑞格,徐夢(mèng)然,吳曉敏,姜合祥,雷連成,,張付賢*

(1.長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,荊州 434023;2.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,長(zhǎng)春 130062)

豬鏈球菌(Streptococcussuis,SS)是一種重要的革蘭陽(yáng)性人畜共患病原菌,在世界各地廣泛分布,可通過(guò)侵入黏膜和傷口等途徑感染牛、馬、狗和魚等多種動(dòng)物和人[1-2]?；诓煌那v膜多糖抗原,SS目前主要被分為29個(gè)血清型;感染豬的SS血清型主要是1～9型、1/2型和14型,亞洲主要流行血清型2、3和4等,血清型9主要在歐洲流行[3-6]。多序列位點(diǎn)分型(multilocus sequence typing,MLST)也常被用于豬鏈球菌的分類依據(jù),目前已超過(guò)1 000個(gè)STs 被鑒定[7]。在已報(bào)道的豬鏈球菌感染病例中,豬鏈球菌2型(Streptococcussuisserotype 2,SS2)是臨床分離比例最高、也被認(rèn)為是毒力最強(qiáng)的血清型。SS2在感染人和豬時(shí)具有感染率高、發(fā)病急、感染宿主可導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的后遺癥等特點(diǎn),其在嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的同時(shí),也給公共衛(wèi)生安全帶來(lái)了潛在的巨大威脅[4-5]。

SS2通常定植在被感染豬的呼吸道、扁桃體等部位,通過(guò)口鼻感染、接觸傳播,引起敗血癥、心內(nèi)膜炎,關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等病癥,嚴(yán)重的可引發(fā)腦膜炎、敗血癥甚至致死[8-9];近年來(lái)從臨床上人和豬感染SS2病例中,腦膜炎型豬鏈球菌病的比例有明顯上升趨勢(shì)[10-11]。但是臨床的病例,鮮見(jiàn)對(duì)豬源致腦膜炎SS2進(jìn)行MLST分子分型鑒定,以及致病性和耐藥性系統(tǒng)性研究的報(bào)道。本研究從湖北某養(yǎng)殖場(chǎng)患呼吸道病豬的腦組織中分離到一株SS2,命名為PX0923。通過(guò)MLST對(duì)其進(jìn)行分型鑒定,結(jié)合致病性、生物被膜形成能力和抗生素、中藥敏感性分析系統(tǒng)性研究分離菌株的生物學(xué)特性,為進(jìn)一步探究SS2的致腦膜炎機(jī)理和臨床上SS2感染的防控、精確診斷和有效治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和中藥藥材

牛腦心浸出液(BHI)培養(yǎng)基、瓊脂粉等購(gòu)自國(guó)藥基團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;胰酪胨大豆羊血瓊脂購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司;細(xì)菌基因組提取試劑盒,病毒基因組提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;DL2000 DNA Marker購(gòu)自北京聚合美生物科技有限公司;革蘭氏染色劑購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司;Taq酶購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;抗生素藥敏片均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司;實(shí)驗(yàn)所使用相關(guān)引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

33種中草藥:羌活、蘇子、板藍(lán)根、羅漢果、桑皮、桔梗、丁香、金銀花、胖大海、天竹黃、川貝母、連翹、魚腥草、半夏、鶴藤、秦皮、朱砂、大青葉、黃連、炒僵蠶、黃芩、檳榔、蒲公英、灸白附子、五倍子、荊芥、款冬花、薄荷、烏梅、熟大黃、三七、菊花和全蝎,以上中藥均購(gòu)自南京同仁堂大藥房。

1.2 病例描述

2021年12月至2022年2月,湖北某生豬養(yǎng)殖場(chǎng),部分仔豬出現(xiàn)精神沉郁、氣喘、呼吸困難肌肉抽搐和后肢震顫、滑動(dòng)等臨床表現(xiàn)。剖檢病死豬,可見(jiàn)胸腔和腹腔積液,肺臟充血水腫,脾臟出血,腦膜明顯充血、出血。使用抗生素慶大霉素和卡那霉素的治療效果不理想,反復(fù)用藥后病情不穩(wěn)定。

1.3 病原檢測(cè)

無(wú)菌條件下解剖病死豬,采集病豬的肺、肝、腦和脾等病變組織(約200 mg)于RNase free的1.5 mL EP管中研磨加無(wú)菌PBS勻漿,使用細(xì)菌與病毒基因提取試劑盒提取樣品的基因組。合成的豬常見(jiàn)呼吸道疾病病原:豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、副豬嗜血桿菌(HPS)、多殺性巴氏桿菌(Pm)和胸膜肺炎放線桿菌(APP)的特異性引物[12-13]以及用于擴(kuò)增豬鏈球菌gdh基因和recN基因的特異性引物[14](表1),使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄病毒RNA,以細(xì)菌和病毒DNA以及反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為病原檢測(cè)模板,采用20 μL PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系: DNA模板1 μL,上下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL,2×Taq PCR Master Mix酶 10 μL,ddH2O 8 μL。PCR的擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,退火1 min,72 ℃延伸30 s,循環(huán)數(shù)34;72 ℃終延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5% 瓊脂糖凝膠電泳,120 V電泳30 min。

表1 PCR鑒定豬常見(jiàn)病原的引物序列

1.4 細(xì)菌分離和鑒定

取病豬的腦組織劃線接種于含5% 胎牛血清的BHI固體培養(yǎng)基中,于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。根據(jù)病原檢測(cè)結(jié)果按細(xì)菌形態(tài)挑選可疑菌落再次PCR鑒定,按照鑒定結(jié)果挑取可疑菌落純化3代,觀察其菌落形態(tài)。取純化3代后的疑似豬鏈球菌菌落涂板并進(jìn)行革蘭染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)特征。收集純化后的疑似豬鏈球菌菌液,無(wú)菌PBS清洗3次后,棄液,使用2.5%戊二醛重懸并于4 ℃冰箱中固定過(guò)夜,ddH2O清洗3次后冷凍干燥,在掃描電鏡下觀察其形態(tài)。

1.5 病原菌的16S rRNA基因測(cè)序以及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

根據(jù)病原檢測(cè)以及形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果取純化三代后的疑似豬鏈球菌菌落,以細(xì)菌16S rRNA基因通用引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′與1492R:5′-TACGCTACCTTGTTACGACTT-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用50 μL反應(yīng)體系:DNA模板1 μL;2×Taq PCR Master Mix酶25 μL,上、下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL,ddH2O 22 μL。擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,50 ℃退火1 min,72 ℃延伸30 s,循環(huán)數(shù)34;72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5% 瓊脂糖凝膠電泳后,目的條帶切膠回收送武漢生物工程有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果使用NCBI BLAST網(wǎng)站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行比對(duì)分析。選取與分離菌株同源性強(qiáng)且為豬鏈球菌屬的其他菌株16S rRNA基因序列,通過(guò)Mega.11軟件的MUSCLE功能對(duì)多重序列進(jìn)行對(duì)齊排列,并使用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建分離菌株基于16S rRNA基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),Bootstrap 1 000次檢查進(jìn)化樹(shù)可信度,在ITOL網(wǎng)站(https://itol.embl.de/)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.6 病原菌的血清型鑒定

合成針對(duì)谷氨酸脫氫酶基因(glutamic acid dehydrogenase,gdh)的引物(表2),根據(jù)PCR產(chǎn)物大小鑒別豬鏈球菌的血清型[15-16]:如果條帶為575 bp,表明分離菌株是2型或1/2型;條帶為440 bp,表明分離菌株為1型或14型;條帶為250 bp,表明為7型;條帶為390 bp,表明分離菌株為9型。鑒于普通PCR無(wú)法區(qū)分血清2型和血清1/2型,也無(wú)法區(qū)分1型和14型,采用基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-restriction fragment length polymorphism, RCR-RFLP)的cpsK基因多態(tài)性檢測(cè)方法進(jìn)行鑒別[17];合成SS2莢膜抗原基因簇cpsK的特異性引物(表2),以提取的分離菌株的基因組為模板進(jìn)行PCR,擴(kuò)增產(chǎn)物以限制性核酸內(nèi)切酶BstNⅠ進(jìn)行酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)1.5% 瓊脂糖凝膠電泳。判定標(biāo)準(zhǔn):如果酶切后僅出現(xiàn)大小為486 bp的一條帶,則表明分離菌株血清型為1/2型或1型;如果酶切產(chǎn)物出現(xiàn)大小為347 bp與139 bp的兩條帶,則表明分離菌株的血清型為2型或14型;綜合上述兩種方法判定分離菌株的血清型。

表2 PCR鑒定分離株血清型引物的序列

1.7 Multilocus sequence typing (MLST)分析

檢索MLST數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站(https://pubmLst.org/organisms/streptococcus-suis)合成用于擴(kuò)增豬鏈球菌的7個(gè)管家基因aroA、cpn60-L、dpr、gki、mutS、recA和thrA的引物[18],PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果上傳至MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中查找等位基因的編號(hào),進(jìn)而確定分離菌株的 ST 型別,并利用PHYLOViZ Online網(wǎng)站(https://online.phyloviz.net/index)對(duì)豬鏈球菌的ST 型進(jìn)行分組和聚類,繪制MLST最小生成樹(shù)。

1.8 致病性試驗(yàn)

1.8.1 毒力基因檢測(cè) 合成豬鏈球菌的8種毒力基因:細(xì)胞外蛋白因子(extracellular protein factor,EPF),溶菌酶釋放蛋白(muramidase-released protein,MRP),溶血素(suilyin,SLY),甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH),表面膜蛋白(fibronectin binding proteins,FBPS),orf2,sao和89K的特異性引物[19-20],以及與豬鏈球菌2型的毒力相關(guān)基因簇nmt的引物nadR、pnuC、nutT[21](表3),以提取的分離株的DNA為模板,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5% 瓊脂糖凝膠電泳。

表3 ST7型豬鏈球菌的部分信息

1.8.2 溶血性試驗(yàn) 取分離株純培養(yǎng)物,用接種環(huán)劃線接種于胰酪胨大豆羊血瓊脂平板上,37 ℃孵育48 h后觀察平板的溶血情況,分析分離株產(chǎn)生溶血素的能力。

1.8.3 小鼠感染試驗(yàn) 健康SPF昆明系雄性小鼠60只,體重25 g±1.8 g,購(gòu)自湖北宜昌三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;暫養(yǎng)3 d,檢測(cè)確認(rèn)無(wú)特定病原后用于人工感染試驗(yàn)。挑取分離菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600 nm=0.6,5 h),進(jìn)行梯度稀釋和活菌計(jì)數(shù)后,4 000 r·min-1離心10 min收集菌體,用無(wú)菌PBS重復(fù)洗滌3次,最后以無(wú)菌PBS重懸調(diào)整至攻毒濃度:4.3×1010、4.3×109、4.3×108、4.3×107、4.3×106CFU·mL-1。將小鼠隨機(jī)分為6組,每只腹腔注射0.5 mL菌液,對(duì)照組腹腔注射同體積無(wú)菌PBS。攻毒后連續(xù)觀察7 d,記錄顯著的臨床癥狀和死亡情況,根據(jù)改良寇氏法統(tǒng)計(jì)分離菌株的 LD50[22]。解剖死亡小鼠,采集死亡小鼠的病變組織,進(jìn)行致病菌的分離和鑒定;無(wú)菌條件下采集死亡小鼠的心、肝、脾、肺、腎和腦,勻漿后以平板法統(tǒng)計(jì)組織細(xì)菌載量;固定具有典型病變的腦、肺、肝組織,制成石蠟切片后鏡檢觀察。

1.9 耐藥性試驗(yàn)

1.9.1 生物被膜形成能力測(cè)定 采用剛果紅瓊脂培養(yǎng)基法分析分離菌株是否有形成生物被膜的能力[23]。以大腸桿菌O157作為質(zhì)檢菌,檢測(cè)剛果紅瓊脂實(shí)驗(yàn)的有效性;取10 μL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液,均勻滴在剛果紅瓊脂上,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)。如果菌落形態(tài)呈鋸齒狀或光滑的白色則表明菌株缺乏胞外多糖基質(zhì)和纖維蛋白的生成,沒(méi)有生成生物被膜的能力;如果菌落形態(tài)為紅色或黑色、干燥且邊緣卷曲則說(shuō)明菌株形成胞外多糖基質(zhì)和纖維蛋白較多,具有生成生物被膜的能力。同時(shí)以結(jié)晶紫染色法來(lái)定量測(cè)定分離菌株形成生物被膜的能力。取200 μL對(duì)數(shù)期的菌液加入96孔細(xì)菌培養(yǎng)板,37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后棄去培養(yǎng)基,加入200 μL 4%多聚甲醛固定15 min,清洗風(fēng)干后加入200 μL 0.1%結(jié)晶紫室溫染色10 min,經(jīng)無(wú)水乙醇脫色后使用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的OD570 nm值。依據(jù)ODc的值(ODc的值為對(duì)照組OD570 nm的平均值)判定分離菌株生物被膜形成能力:OD≤ODc,為無(wú)成膜能力;ODc4ODc,為強(qiáng)成膜能力。

1.9.2 耐藥基因檢測(cè) 合成針對(duì)各種抗生素耐藥基因的引物[24-29]:四環(huán)素的tetC、tetM、tetA基因,氟喹諾酮的grvA、grvB基因,紅霉素的ermF、ereD基因,氨基糖苷類的aadA1、aadB基因,磺胺類的sul1、sul2基因,β-內(nèi)酰胺類的bla-IMP、bla-TEM、bla-SHV、bla-CTX、bla-OXA、bla-DHA、β-KPC、β-HDM基因,林可霉素的1nuH基因,PCR的方法來(lái)篩查分離株耐藥基因攜帶情況。

1.9.3 抗生素敏感性試驗(yàn) 采用Kirb-Bauer(K-B)紙片擴(kuò)散法分析分離菌株對(duì)不同抗生素的敏感性。在以金黃色葡萄球菌ATCC25923驗(yàn)證藥敏片的有效性后,取分離純化后菌株的純培養(yǎng)物均勻涂布在BHI瓊脂平板上,將抗生素藥敏片分別貼在培養(yǎng)基標(biāo)記處,于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。測(cè)量形成抑菌圈的直徑,藥敏試驗(yàn)重復(fù)3次,根據(jù)抑菌圈直徑大小判斷分離菌株對(duì)藥物的敏感程度。

1.9.4 中藥抑菌和最小抑菌濃度(minimal inhibit concentration,MIC)的測(cè)定 分別稱取中草藥,以煎煮法制備終濃度為1 g·mL-1的中藥藥液,經(jīng)121 ℃、滅菌20 min,4 ℃保存?zhèn)溆?。將空白藥敏紙片浸泡在中藥藥液?待浸透后風(fēng)干備用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的分離菌株涂布平板,將含中藥的紙片均勻貼在平板上,并以含抗生素的藥敏片作為對(duì)照;37 ℃ 靜置培養(yǎng) 24 h,分別測(cè)量抑菌圈直徑;試驗(yàn)重復(fù)3次,計(jì)算平均值,評(píng)估分離菌株對(duì)中藥藥液的敏感性;以96孔板微量稀釋法測(cè)定待測(cè)中草藥對(duì)分離菌株的MIC[30]。

2 結(jié) 果

2.1 病原的分離和鑒定

病豬組織的病原篩查PCR結(jié)果顯示,病料中胸膜肺炎放線桿菌、多殺巴氏桿菌、豬圓環(huán)病毒2型、副豬嗜血桿菌均為陰性,豬鏈球菌的gdh基因和recN基因的檢測(cè)均呈陽(yáng)性反應(yīng),且條帶大小與陽(yáng)性模板所擴(kuò)增出的條帶大小一致(圖1A),判定該豬場(chǎng)病豬疑似由豬鏈球菌感染引起。革蘭染色結(jié)果表明,分離菌株為革蘭陽(yáng)性菌,多為成對(duì)或成鏈狀排列的菌體(圖1B);在平板上可見(jiàn)灰白色邊緣整齊的圓形菌落(圖1C);掃描電鏡下,分離菌株似卵圓形或短桿狀,呈鏈狀平行延伸(圖1D);分離菌株的形態(tài)及生長(zhǎng)特性與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中豬鏈球菌的特性相符。將16S rRNA引物所擴(kuò)增出的1 500 bp左右大小的條帶進(jìn)行測(cè)序,基因序列進(jìn)行同源序列比對(duì)分析結(jié)果如圖1E所示,在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中分離株與三株豬鏈球菌(115737.1、038918.1和117504.1)匯成一支,親緣關(guān)系最近;與2型豬鏈球菌S735(GenBank No.:NR 036918.1)相似性達(dá)到99%以上,基因序列的相似性最高;結(jié)合分離菌株的形態(tài)、生理生化結(jié)果,確定分離菌株為豬鏈球菌,命名為PX0923。

表4 分離菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表5 中藥抑菌結(jié)果

2.2 豬鏈球菌的血清學(xué)鑒定

血清型鑒定的PCR結(jié)果如圖2A所示,以PX0923基因組為模板,gdh的引物擴(kuò)增出575 bp左右的條帶,表明分離菌株P(guān)X0923為豬鏈球菌血清2或1/2型,排除14型;cpsK的特異性引物擴(kuò)增出486 bp的條帶,酶切后電泳呈現(xiàn)出大小為347 bp與139 bp的兩條帶(圖2B),表明分離菌株的血清型為2型或14型;綜合上述兩種血清型鑒定結(jié)果,判定豬鏈球菌PX0923的血清型為2型。

A. gdh基因擴(kuò)增結(jié)果(M1. DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. gdh基因陰性對(duì)照;2. 分離菌株);B. PCR-RFLP結(jié)果(M2. DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);3. cpsK基因陰性對(duì)照;4. PCR結(jié)果;5. BstNⅠ酶切結(jié)果)A. gdh gene amplification results (M1. DL2000 DNA marker; 1. gdh gene negative control; 2. Isolated strain); B. PCR-RFLP results (M2. DL2000 DNA marker; 3. cpsK gene negative control; 4. PCR result; 5. Digestion result by BstNⅠ)

2.3 MLST分型

對(duì)分離株P(guān)X0923的管家基因(aroA、cpn60-L、dpr、gki、mutS、recA、thrA)進(jìn)行測(cè)序, 結(jié)果上傳至MLST網(wǎng)站,7個(gè)等位基因的編號(hào)分別為1、1、1、1、1、1、3,確定PX0923屬于ST7型豬鏈球菌。數(shù)據(jù)庫(kù)中ST7型豬鏈球菌株主要分布在中國(guó),宿主為人和豬(表3)。在MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中下載186個(gè)菌株信息包括166種ST型別,使用 PHYLOViZ 軟件對(duì)豬鏈球菌進(jìn)行分組聚類分析,結(jié)果如圖3 所示,ST7型與ST1型豬鏈球菌(ID:3150)匯聚為一支,二者具有較近的親緣關(guān)系。

圖3 MLST分析Fig.3 MLST analysis

2.4 致病性分析

2.4.1 毒力基因檢測(cè)結(jié)果 根據(jù)各對(duì)毒力基因引物的擴(kuò)增結(jié)果顯示,分離株P(guān)X0923攜帶有7種毒力基因:epf、mrp、sly、gapdh、fbps、orf2和sao,其毒力基因型為:epf+/mrp+/sly+/gapdh+/fbps+/orf2+/sao+/89K-(圖4A);與此同時(shí),PX0923的nadR、pnuC和nutT基因均擴(kuò)增出相應(yīng)條帶,表明PX0923同時(shí)攜帶有豬鏈球菌2型特有的nmt毒力基因簇,進(jìn)一步確定分離株P(guān)X0923為豬鏈球菌2型,且PX0923可能具有一定的致病性。

A. 分離株毒力基因與毒力基因簇的篩查結(jié)果(M. DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. epf;2 mrp;3. sly;4. orf;5. gapdh;6. fbps;7. sao;8.89K;9. nadR;10. pnuC;11. nutT);B. 血平板溶血試驗(yàn)結(jié)果;C. 攻毒組小鼠狀態(tài);D. 攻毒組小鼠眼部;E. 對(duì)照組小鼠狀態(tài);F. 對(duì)照組小鼠眼部;G. 組織細(xì)菌載量;H. 存活曲線A. Screening results of virulence genes and virulence gene cluster of isolates (M. DL2000 DNA marker; 1, epf; 2. mrp; 3. sly; 4. orf; 5. gapdh; 6. fbps; 7. sao; 8. 89K; 9. nadR; 10. pnuC; 11. NutT); B. Blood plate hemolysis test results; C. The status of mice in the challenged group; D. Eyelids of mice in the challenged group; E. The status of mice in the control group; F. The eyelids of control group mice; G. Tissue bacterial load; H. Survival curve

A. 對(duì)照組與攻毒組(4.3×1010CFU·mL-1)腹腔與胸腔觀察;B. 對(duì)照組、低劑量組(4.3×107CFU·mL-1)和高劑量組(4.3×1010CFU·mL-1)肺、腦和肝觀察;C. 對(duì)照組與攻毒組(4.3×1010CFU·mL-1)肺(100×)、腦(100×)和肝(400×)組織切片觀察A. Control group and drug attack group (4.3×1010CFU·mL-1) observation of abdominal and thoracic cavities; B. Observation of the lung, brain, and liver in the control group, low-dose group (4.3×107CFU·mL-1), and high-dose group (4.3×1010CFU·mL-1); C. Observation of lung (100×), brain (100×), and liver (400×) tissue sections in the control group and the attack group (4.3×1010CFU·mL-1)

2.4.2 溶血性試驗(yàn)結(jié)果 分離株P(guān)X0923在綿羊血平板上37 ℃培養(yǎng)48 h后,在菌落周圍形成直徑0.5 ～1 mm、草綠色的圓形溶血環(huán)(圖4B),該區(qū)域紅細(xì)胞未完全溶解,呈現(xiàn)出α型溶血的典型特點(diǎn),表明分離菌株P(guān)X0923在綿羊血平板上具有α溶血活性。

2.4.3 回歸試驗(yàn)結(jié)果 攻毒12 h后,4.3×1010CFU·mL-1攻毒組小鼠出現(xiàn)明顯的精神沉郁、被毛凌亂,肛門處出現(xiàn)糞便黏著(圖4C),眼瞼有黏性分泌物(圖4D);攻毒24 h后,對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)正常,未出現(xiàn)死亡(圖4E、F);4.3×1010CFU·mL-1攻毒組小鼠全部死亡,4.3×109CFU·mL-1攻毒組共計(jì)死亡小鼠8只;其他攻毒組小鼠出現(xiàn)輕微的臨床癥狀,未見(jiàn)小鼠死亡(圖4H);經(jīng)統(tǒng)計(jì),分離株P(guān)X0923的LD50為1.08×109CFU·小鼠-1。從死亡小鼠的肝、脾、肺、腎和腦組織中分離出致病菌,經(jīng)鑒定為攻毒菌株P(guān)X0923,對(duì)照組中未發(fā)現(xiàn)攻毒菌株;死亡小鼠心、肝、脾、肺、腎和腦的組織菌載量分別為9.35×105、6.48×105、3.81×106、1.53×106、2.14×106和5.28×104CFU·mg-1,其中脾中的組織載量最高(圖4G),表明PX0923具有一定的組織嗜性。

剖檢死亡小鼠,發(fā)現(xiàn)其腹腔、胸腔內(nèi)有大量淡紅色液體,4.3×107CFU·mL-1組與4.3×1010CFU·mL-1組小鼠的肺和腦組織均出現(xiàn)不同程度的出血,4.3×107CFU·mL-1組小鼠肝上出現(xiàn)白色干酪樣病變,4.3×1010CFU·mL-1組呈現(xiàn)黃白相間的花紋樣肝(圖5A、B)。病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),攻毒組小鼠肺泡壁增厚且肺泡囊中充滿紅細(xì)胞;軟腦膜充滿大量紅細(xì)胞;肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性,胞質(zhì)呈現(xiàn)空泡狀且細(xì)胞核偏向一側(cè)(圖5C),表明感染分離菌株P(guān)X0923具有一定的致病性,可導(dǎo)致小鼠腦膜炎、肺和肝等組織嚴(yán)重的損傷。

2.5 耐藥性分析

2.5.1 生物被膜形成能力 大腸桿菌O157在在剛果紅瓊脂上生成灰白色、邊緣鋸齒狀的菌落(圖6A),表明大腸桿菌O157沒(méi)有生成生物被膜的能力,證明剛果紅瓊脂有效。如圖6B所示,分離株P(guān)X0923在剛果紅瓊脂上形成了暗紅色且邊緣卷曲、隆起、干燥的菌落,表明分離株P(guān)X0923具有生成生物被膜的能力。結(jié)晶紫染色試驗(yàn)顯示,在無(wú)水乙醇脫色后測(cè)得分離株P(guān)X0923組OD570 nm的平均值為0.406,對(duì)照組OD570 nm的平均值為0.167(圖6C),判定分離菌株P(guān)X0923具有中等成膜能力。

A. 大腸桿菌O157在剛果紅瓊脂平板上的菌落形態(tài);B. 分離株P(guān)X0923在剛果紅瓊脂平板上的菌落形態(tài);C. 結(jié)晶紫試驗(yàn)結(jié)果;D. 分離株耐藥基因篩查結(jié)果(M. DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. tetC;2. tetM;3. tetA;4. gryA;5. gryB;6. ermF;7. ereD;8. aadA1;9. aadB;10. sul1;11. sul2;12. bla-IMP;13. bla-TEM;14. bla-SHV;15. bla-CTX;16. bla-OXA;17. bla-DHA;18. β-KPC;19. β-HDM;20. lnuH)A. Colony morphology of Escherichia coli O157 on Congo red agar plate; B. Colony morphology of the isolated strain on Congo red agar plate; C. Results of crystal violet experiment; D. Screening results of drug resistance genes in strain (M. DL2000 DNA marker; 1. tetC; 2. tetM; 3. tetA; 4. gryA; 5. gryB; 6. ermF; 7. ereD; 8. aadA1; 9. aadB; 10. Sul1; 11. Sul2; 12. bla-IMP; 13. bla-TEM; 14. bla-SHV; 15. bla-CTX; 16. bla-OXA; 17. bla-DHA; 18. β-KPC; 19. β-HDM; 20. lnuH)

2.5.2 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 耐藥基因篩查結(jié)果顯示,分離菌株P(guān)X0923攜帶aadA1和bla-TEM2種耐藥基因,其余耐藥基因的篩查結(jié)果為陰性(圖6 D),表明該分離株P(guān)X0923具有一定的耐藥性。

2.5.3 抗生素敏感性試驗(yàn)結(jié)果 金黃色葡萄球菌 (ATCC25923)為質(zhì)控菌株進(jìn)行的藥敏試驗(yàn),結(jié)果證實(shí)藥敏片有效。抑菌圈直徑測(cè)量發(fā)現(xiàn),慶大霉素、卡那霉素、新霉素、阿米卡星、克林霉素、多黏菌素、呋喃唑酮、多西環(huán)素、四環(huán)素、美滿霉素、麥迪霉素和頭孢拉定等12種藥物對(duì)PX0923的抑菌圈直徑均≤15 mm,表明PX0923菌株對(duì)以上抗生素均耐藥;對(duì)諾氟沙星、青霉素、阿莫西林、頭孢他啶和氨芐西林5種抗生素中介;對(duì)環(huán)丙沙星、氧氟沙星、頭孢哌酮和頭孢唑林4種抗生素的抑菌圈直徑均>20 mm,表明分離菌株P(guān)X0923菌株對(duì)上述4種抗生素均敏感;以上結(jié)果表明,分離菌株P(guān)X0923為多重耐藥菌株。

2.5.4 中藥抑菌試驗(yàn)結(jié)果 中藥體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示,全蝎對(duì)分離菌株的抑菌直徑為25 mm,大于20 mm,表明其對(duì)PX0923抑菌作用較強(qiáng),為極度敏感;三七的抑菌直徑為14 mm,對(duì)PX0923抑菌作用為中度敏感;在中藥最小抑菌濃度的試驗(yàn)中,全蝎的最小抑菌濃度為3.91 mg·mL-1,三七的最小抑菌濃度為125 mg·mL-1;其余中藥提取液對(duì)分離菌株P(guān)X0923無(wú)顯著抑制效果。

3 討 論

豬鏈球菌在感染人的病例中,主要以SS2感染居多,少數(shù)為1、4、5、9、14、16、21、24和31血清型所致[26,31-32]。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)前在SS的諸多MLST型別中,世界范圍內(nèi)流行的豬鏈球菌主要是ST1、ST7和ST28,其中ST1和ST7是感染人的主要菌株型[8]。除此之外,最近在我國(guó)的不同地方發(fā)現(xiàn)了豬鏈球菌新的ST型,如ST658、ST242、ST377、ST1131和ST665等;這些新發(fā)現(xiàn)的ST型目前僅出現(xiàn)在人類感染的病例中,尚無(wú)人與人之間傳播和流行的直接證據(jù)[28]。本研究從患呼吸道疾病豬腦組織中分離的PX0923經(jīng)16S rRNA測(cè)序、PCR和PCR-RFLP鑒定為SS2,這與流行病學(xué)調(diào)查中亞洲主要流行血清型2、3和4的研究結(jié)果相一致。分離菌株P(guān)X0923進(jìn)一步經(jīng)分子分型鑒定為ST7型,這也與SS在世界范圍內(nèi)的分子分型的流調(diào)結(jié)果一致[7,29]。在已報(bào)道的ST7型豬鏈球菌中,均分布在國(guó)內(nèi),來(lái)源于人和豬的組織。2022年,熊衍峰等[33]首次發(fā)現(xiàn)江西省贛州市人源ST7型豬鏈球菌(血清2型)病例;本研究從患病豬的腦組織中分離出可導(dǎo)致腦膜炎的ST7型豬鏈球菌(血清2型),目前尚未見(jiàn)報(bào)道。豬源和人源ST7型豬鏈球菌(血清2型)病例的發(fā)現(xiàn),提示SS2作為一種人獸共患病病原,不管是經(jīng)典菌株型,還是新型菌株,其在人和動(dòng)物及環(huán)境中的傳播,結(jié)合其致病性和耐藥性的潛在威脅,應(yīng)引起高度的重視,開(kāi)展深入、系統(tǒng)的流調(diào)和致病機(jī)制研究,防患于未然。

據(jù)統(tǒng)計(jì),豬鏈球菌可產(chǎn)生百余種不同的毒力因子,主要分為四大類:細(xì)菌表面成分/分泌分子、酶、轉(zhuǎn)錄因子/調(diào)節(jié)系統(tǒng)、轉(zhuǎn)運(yùn)因子/分泌系統(tǒng)。EPF、MRP和FBPS屬胞外蛋白,MRP是SS主要的黏附素,FBPS是細(xì)菌黏附的底物,這些毒力因子均與細(xì)菌的侵染相關(guān);研究發(fā)現(xiàn),毒力基因型為mrp+epf+的菌株大多為強(qiáng)毒株,常引起豬典型的腦膜炎和關(guān)節(jié)炎。SLY是一種巰基活化類毒素,研究發(fā)現(xiàn)其可能在SS侵入和裂解細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮重要作用;GAPDH與SS黏附宿主細(xì)胞有關(guān)[34-35]。本研究的分離的豬源ST7型分離株P(guān)X0923攜帶7種毒力基因[36]:epf、mrp、sly、gapdh、fbps、orf2和sao,以及SS2特有的毒力基因簇nmt。人工感染試驗(yàn)中,攻毒組小鼠腹腔、胸腔內(nèi)有大量淡紅色液體,肺組織出現(xiàn)顯著病變,這與自然發(fā)病豬胸、腹腔積液的臨床癥狀相一致。分離菌株所攜帶毒力因子的致病作用與本研究致病性試驗(yàn)中小鼠的臨床癥狀相符合。豬源ST7型分離株P(guān)X0923可致小鼠出現(xiàn)腦膜炎、脾和肝出血等多器官損傷,這可能與其攜帶的毒力因子mrp、epf、sly和gapdh有關(guān),也與分離菌株本身具有的α溶血活性相關(guān)。經(jīng)病理組織學(xué)分析,分離菌株能夠?qū)е履X和肺等組織器官出血、肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性和細(xì)胞質(zhì)空泡化等病理變化,進(jìn)一步說(shuō)明分離菌株具有一定的致病性。高劑量感染分離株P(guān)X0923可導(dǎo)致小鼠死亡,同時(shí)從死亡小鼠的脾、肺、肝等器官中均可分離到攻毒菌株,印證了豬源ST7型豬鏈球菌(血清2型)與湖北某豬場(chǎng)暴發(fā)的呼吸道疾病的關(guān)聯(lián)性。

鑒于養(yǎng)殖場(chǎng)呼吸道疾病抗生素治療效果不理想的情況,本研究通過(guò)藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ST7型豬鏈球菌(血清2型)PX0923菌株是一株多重耐藥菌,對(duì)慶大霉素、卡那霉素、新霉素、阿米卡星等12種抗生素耐藥,且攜帶aadA1和bla-TEM2種耐藥基因。研究發(fā)現(xiàn),生物被膜的形成與細(xì)菌耐藥有著密切關(guān)系,生物被膜的特殊屏障滲透作用使得豬鏈球菌對(duì)多種抗生素產(chǎn)生強(qiáng)的耐藥性。生物被膜試驗(yàn)結(jié)果顯示,分離菌株P(guān)X0923能夠生成生物被膜,且具有中等的生物被膜形成能力,這與其在藥敏試驗(yàn)中表現(xiàn)的多重耐藥情況相符。鑒于致腦膜炎豬源ST7型豬鏈球菌(血清2型)PX0923菌株的血清型和致病性,應(yīng)及早開(kāi)展系統(tǒng)性的流行病學(xué)調(diào)查和溯源工作,深入研究不同來(lái)源豬鏈球菌的血清型、多位點(diǎn)序列分型、毒力和致病機(jī)理,為豬鏈球菌的源頭控制和精準(zhǔn)防控奠定基礎(chǔ)。

中藥歷史悠久、藥源廣泛、低毒、功效明確且不易產(chǎn)生耐藥性,在抗致病菌、病毒感染和提高機(jī)體的免疫力方面有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì),特別是在當(dāng)前禁抗、減抗的大背景下,篩選針對(duì)耐藥菌株有效的中藥成為研究熱點(diǎn)[37-38]。Li等[39]發(fā)現(xiàn)黃連提取物在體外對(duì)豬鏈球菌具有抑制作用;馮沙沙等[40]發(fā)現(xiàn)黃連、黃柏、黃芩、丹參等29種中藥對(duì)豬鏈球菌具有顯著的抑制效果;陳儉清等[41]確定大黃、 黃芩水提物對(duì)豬鏈球菌生物被膜具有極顯著的干預(yù)作用;詹佳飛等[42]研究發(fā)現(xiàn)毛蕊花糖苷在不影響2型豬鏈球菌生長(zhǎng)活性的情況下,可通過(guò)抑制溶血素活性來(lái)降低2型豬鏈球菌對(duì)小鼠的致病性。唐陽(yáng)[43]通過(guò)提取大黃素,發(fā)現(xiàn)大黃素可有效抑制溶血素蛋白產(chǎn)生,抑制豬鏈球菌的溶血能力,同時(shí)引起毒力基因表達(dá)量下調(diào),發(fā)揮對(duì)豬鏈球菌抑菌活性。本研究發(fā)現(xiàn),中藥全蝎和三七對(duì)分離菌株的抑菌效果最佳,其中全蝎對(duì)分離菌株極度敏感,這與前人的研究結(jié)果存在不同,可能與中藥的產(chǎn)地、中藥的采集部位、炮制方法、菌株的毒力及耐藥性等原因有關(guān)。中藥的種類和成分繁多,可通過(guò)多種靶點(diǎn)抑制病原菌生長(zhǎng)、破壞病原菌結(jié)構(gòu)或殺死病原;本研究?jī)H進(jìn)行了體外抑菌試驗(yàn),后續(xù)開(kāi)展中藥組方、生物被膜清除劑和中西藥聯(lián)合用藥,發(fā)掘中藥全蝎和三七在動(dòng)物體內(nèi)的對(duì)豬鏈球菌的抑菌效果及抑菌機(jī)制,為開(kāi)發(fā)和利用中藥治療耐藥鏈球菌感染奠定理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)證實(shí)從患腦膜炎病豬腦組織中分離出一株豬鏈球菌(血清2型),ST型為ST7,具有多重耐藥特性,且攜帶epf、mrp、sly、gapdh、fbps、orf2和sao7種毒力基因;在綿羊血平板上呈現(xiàn)α型溶血特點(diǎn),能導(dǎo)致小鼠患腦膜炎、肺炎等癥狀,具有一定的致病性,對(duì)公共衛(wèi)生安全具有潛在威脅;其攜帶aadA1和bla-TEM2種耐藥基因,對(duì)慶大霉素、卡那霉素、新霉素、阿米卡星等12種藥物耐藥,對(duì)環(huán)丙沙星、氧氟沙星、頭孢哌酮、頭孢唑林4種藥物敏感;中藥全蝎和三七在體外試驗(yàn)中對(duì)分離菌株P(guān)X0923均有顯著抑菌作用。相關(guān)結(jié)果旨在為致腦膜炎豬源ST7型豬鏈球菌(血清2型)的研究提供科學(xué)參考。