表達(dá)外源基因SPAM1重組CAV-2溶瘤病毒的構(gòu)建與拯救

高 龍,常心怡,李 程,趙曉亞,李汶潔,范浩謙,馬靜云

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,廣州 510642)

目前,腫瘤已經(jīng)是僅次于心血管疾病的第二大人類主要疾病死亡原因,根據(jù)世衛(wèi)組織的數(shù)據(jù)顯示,2020年約有近2 000萬例的新發(fā)患者和近1 000萬例的死亡患者[1]。癌癥同時(shí)也是犬貓死亡的主要原因之一,10歲以上的老年犬有50%是因腫瘤相關(guān)疾病死亡,中國(guó)目前已有超過6 000萬只家養(yǎng)犬,而腫瘤相關(guān)疾病的治療方案除了傳統(tǒng)的手術(shù)治療外目前尚無其他系統(tǒng)有效的療法面世[2]。腫瘤相關(guān)的傳統(tǒng)治療方式亟待革新與突破,目前腫瘤的治療已經(jīng)不限于手術(shù)、化療和放射性治療等傳統(tǒng)療法,包括CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)[3-4]、溶瘤病毒、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)治療、質(zhì)子療法、嵌合抗原受體T細(xì)胞(CAR-T)療法等新型治療手段均在快速發(fā)展。其中溶瘤病毒、嵌合抗原受體T細(xì)胞(CAR-T)、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)治療等免疫療法,是目前發(fā)展較為迅速且十分具有發(fā)展前景的治療方式。

溶瘤病毒是指使用天然的或通過基因工程改造后的病毒,可以通過腫瘤特異性受體或抗病毒通路缺失等靶向腫瘤細(xì)胞,并在腫瘤細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制,通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞焦亡和壞死性死亡等多種機(jī)制誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡[5]。溶瘤病毒當(dāng)前已有4款藥物獲批上市:Latima公司研發(fā)的Rigvir;三維生物研發(fā)的安柯瑞;Amgen公司研發(fā)的T-Vec;Daiichi Sankyo公司研發(fā)的Delytact (teserpaturev/G47Δ)。與此同時(shí)全球還有眾多的溶瘤病毒產(chǎn)品處于臨床試驗(yàn)中,主要有皰疹病毒科、腺病毒科、痘病毒科、細(xì)小病毒科、副黏病毒科等[6],各種溶瘤病毒產(chǎn)品的作用方式和其作用機(jī)制各不相同。但溶瘤病毒行業(yè)整體呈現(xiàn)快速發(fā)展的趨勢(shì)。

腺病毒是溶瘤病毒臨床試驗(yàn)中最主要的病毒載體之一,但很多患者具有預(yù)存抗體對(duì)人腺病毒具有一定程度的耐受,因此對(duì)其作用效果產(chǎn)生了影響[7],而犬腺病毒-2型(canine adenovirus type 2,CAV-2)則具備解決該問題的潛能,因?yàn)镃AV-2在人體內(nèi)幾乎不存在預(yù)存抗體,并且可以實(shí)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制且不引起患者機(jī)體致病[8-9],具有一定的安全性,使其在溶瘤病毒領(lǐng)域具備了潛在的應(yīng)用前景。CAV-2基因組全長(zhǎng)約為32 kb,其可以插入7 kb以上的外源基因片段,易于純化[10],有利于使用CAV-2攜帶治療基因進(jìn)入腫瘤細(xì)胞進(jìn)而獲得更好的抗瘤效果。

腫瘤微環(huán)境通過透明質(zhì)酸的合成和降解發(fā)生重塑[11-12]。透明質(zhì)酸維持實(shí)體瘤高內(nèi)壓的腫瘤微環(huán)境,為腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移提供有利條件[13],構(gòu)筑腫瘤免疫逃逸的物理屏障,嚴(yán)重阻礙了抗腫瘤藥物的瘤內(nèi)遞送與治療。透明質(zhì)酸酶可以降解透明質(zhì)酸,生殖簇中編碼的精子黏附因子(SPAM1)是基因組編碼的6種透明質(zhì)酸酶中結(jié)構(gòu)和功能最優(yōu)的[14]。在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)SPAM1蛋白可以降解透明質(zhì)酸從而增強(qiáng)抗瘤藥物的瘤內(nèi)彌散以及Th1型免疫細(xì)胞的瘤內(nèi)浸潤(rùn)、重塑腫瘤微環(huán)境破壞腫瘤免疫逃逸物理屏障系統(tǒng)性增強(qiáng)抗瘤效應(yīng)[15-16]。

本研究以CAV-2病毒作為載體,構(gòu)建缺失E3區(qū)域并插入外源基因SPAM1序列的P15A-CAV-2-mCMV-SPAM1-SV40 polyA感染性克隆質(zhì)粒,并拯救重組病毒,以獲得能夠穩(wěn)定表達(dá)外源基因SPAM1的重組病毒CAV-2-DelE3-SPAM1。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒與細(xì)胞 GBdir-pir116-gyrA462、GBred-A462-CAV-2、GB08-red工程菌均來自實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建與保存。R6K-amp-mCMV-eGFP-SV40 polyA-kmccd質(zhì)粒來自實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建與保存。MDCK-E1A細(xì)胞系來自本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑NheI、AscI、EcoR V、NcoI內(nèi)切酶購(gòu)自NEB。質(zhì)粒大提試劑盒購(gòu)自天根。膠回收試劑盒、PCR擴(kuò)增酶、病毒總核酸提取試劑盒、DNAmarke購(gòu)自諾唯贊。Lipo3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自賽默飛。所有引物由上海生工合成。TBST,脫脂奶粉購(gòu)自康為世紀(jì)。CAV、SPAM1多克隆抗體購(gòu)自AbcamIgG二抗- DyLight 594IgG二抗-iFluor 488購(gòu)自艾美捷。CCK8試劑,3D細(xì)胞微球制備板(SpheroXTM96Ukit)購(gòu)自碧云天。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 在本研究中用到的PCR擴(kuò)增引物及熒光定量擴(kuò)增引物以及用于敲除反向篩選基因的段引物如表1所示。

表1 引物信息

1.2.2 R6K-amp-mCMV-eGFP-SV40 polyA-kmccdB中間載體構(gòu)建及鑒定NheI酶切使質(zhì)粒R6K-amp-mCMV-eGFP-SV40 polyA-kmccdB線性化,并回收線性片段。使用引物F2、R2擴(kuò)增SPAM1目的基因片段b并回收擴(kuò)增片段。在GBdir-pir116-gyrA462工程菌中進(jìn)行同源重組構(gòu)建攜帶外源基因的重組質(zhì)粒R6K-amp-mCMV-SPAM1-SV40 polyA-kmccdB。以F1、R1為引物進(jìn)行外源基因測(cè)序并使用NcoI對(duì)中間載體進(jìn)行酶切驗(yàn)證。

PCR反應(yīng)體系20 μL:2 × Phanta? Flash Master Mix(Dye Plus) 10 μL,上、下游引物各1 μL,質(zhì)粒模板1 μL,ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)條件:98 ℃預(yù)變性30 s;98 ℃變性10 s,55 ℃退火5 s,72 ℃延伸30s,共30個(gè)循環(huán);72 ℃徹底延伸1 min,使用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 感染性克隆的構(gòu)建及鑒定AscI酶切R6K-amp-mCMV-SPAM1-SV40 polyA-kmccdB重組質(zhì)粒,回收酶切后的質(zhì)粒片段,在GBred-A462-CAV-2中進(jìn)行同源重組。使用F3、R3進(jìn)行檢測(cè)并使用EcoR Vd對(duì)P15A-CAV-2-mCMV-SPAM1-SV40 polyA-kmccdB質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證。

再利用合成引物del kmccdB-mCMV進(jìn)行反向篩選表達(dá)盒的敲除,并使用F3、R3進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證P15A-CAV-2-mCMV-SPAM1-SV40 polyA感染性克隆構(gòu)建。

PCR反應(yīng)體系20 μL:2 × Phanta? Flash Master Mix(Dye Plus) 10 μL,上、下游引物各1 μL,質(zhì)粒模板1 μL,ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)條件:98 ℃預(yù)變性30 s;98 ℃變性10 s,55 ℃退火5 s,72 ℃延伸30 s,共30個(gè)循環(huán);72 ℃徹底延伸1 min,使用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 病毒拯救及鑒定 提取P15A-CAV-2-mCMV-SPAM1-SV40 polyA質(zhì)粒,用AscI酶切并回收CAV-2-mCMV-SPAM1-SV40 polyA線性片段,使用Lipo3000轉(zhuǎn)染MDCK-E1A細(xì)胞系?；厥誔1～P15代病毒樣品并提取病毒核酸,使用F2、R2、F3、R3進(jìn)行PCR檢測(cè)。

PCR反應(yīng)體系20 μL:2 × ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL,上、下游引物各0.5 μL,質(zhì)粒模板1 μL,ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,共40個(gè)循環(huán);溶解曲線95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s。

1.2.5 重組病毒株生長(zhǎng)曲線測(cè)定 以MOI=0.1接種CAV、CAV-2-DelE3-SPAM1于12孔板中,并于6、12、24、30、36、42、48、54、60、66、72 h收樣,使用病毒總核酸提取試劑盒提取病毒核酸,使用F5、R5檢測(cè)病毒拷貝數(shù),繪制病毒一步生長(zhǎng)曲線圖。

1.2.6 外源蛋白表達(dá)間接免疫熒光(IFA)鑒定 將重組病毒CAV-2-DelE3-SPAM1按照 MOI=0.1接種 MDCK-E1A細(xì)胞,接種后48 h收獲病毒上清繼續(xù)傳代。取P15代重組病毒CAV-2-DelE3-SPAM1,以MOI=1接種6孔板培養(yǎng)的 MDCK-E1A,感染24 h后收獲細(xì)胞樣品。使用1 mL 4%的多聚甲醛4 ℃固定30 min,PBS浸洗3次,加入1 mL 0.1%Triton X-100常溫作用15 min,PBS洗滌3次,之后加入1 mL 5%脫脂奶粉封閉液,封閉1 h,PBS洗滌3次后,加入CAV-2、SPAM1多克隆抗體4 ℃過夜。PBS洗滌3次后加入熒光二抗孵育1 h后再用PBS洗滌3次加入適量的DAPI覆蓋后于倒置熒光顯微鏡觀察。

1.2.7 重組溶瘤病毒CAV-2-DelE3-SPAM1 2D與3D體外溶瘤效應(yīng)觀察 將重組病毒CAV-2-DelE3-SPAM1、野生型毒株CAV-2 按MOI=10接種 A72犬癌細(xì)胞系,接種后48 h顯微鏡下觀察野生毒株與重組毒株的2 D殺傷效應(yīng)。

在3D細(xì)胞球制備板(SpheroXTM96Ukit)中每孔加入100 μL抗黏附包被液,置于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置過夜。棄去抗黏附包被液后以每孔5 000個(gè)A72細(xì)胞的密度進(jìn)行細(xì)胞接種。待A72細(xì)胞形成球體后棄去培養(yǎng)液,按照 MOI=10接種重組病毒CAV-2-DelE3-SPAM1、野生型毒株CAV-2,在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),并于48 h顯微鏡下觀察A72 3 D細(xì)胞球殺傷情況。

1.2.8 重組溶瘤病毒CAV-2-DelE3-SPAM1 CCK8細(xì)胞殺傷檢測(cè) 在96孔板中每孔鋪5 000個(gè)A72細(xì)胞,置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞密度為90%。棄去培養(yǎng)液后使用PBS洗滌,使用不同的MOI(MOI=0.1、1、10)將重組病毒CAV-2-DelE3-SPAM1、野生型毒株CAV-2接種感染A72細(xì)胞,不加病毒的細(xì)胞孔作為對(duì)照組,不接種細(xì)胞的空白孔作為空白組。接毒后繼續(xù)培養(yǎng)48 h,棄去培養(yǎng)液每孔加入含10% CCK8的100 μL維持混合溶液,孵育20 min,使用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量其吸光度(OD)值。細(xì)胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]*100%,其中As為試驗(yàn)組在450 nm處的OD值,Ab、Ac為空白組、對(duì)照組在450 nm處的OD平均值。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)”表示。采用 GraphPad Prism 8.0 軟件對(duì)細(xì)胞存活率檢測(cè)CCK8試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析,顯著性用P值表示,P<0.05代表差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因擴(kuò)增

通過使用F2、R2引物擴(kuò)增SPAM1目的基因,PCR結(jié)果顯示獲得1條1 653 bp的目的條帶與預(yù)期相符(圖1A),成功擴(kuò)增出攜帶中間載體同源臂的SPAM1目的基因。

A. SPAM1目的基因PCR鑒定;B. R6K-amp-mCMV-SPAM1-SV40 polyA-kmccdB中間載體酶切鑒定;C. 感染性克隆P15A-CAV-2-mCMV-SPAM1-SV40 polyA酶切鑒定;D. P15A-CAV-2-mCMV-SPAM1-SV40 poly-kmccdB質(zhì)粒PCR鑒定,泳道1、2、3為重復(fù)單克隆;E. 感染性克隆P15A-CAV-2-mCMV-SPAM1-SV40 poly陽性菌PCR鑒定,泳道1、2、3為重復(fù)單克隆,泳道4、5、6為重復(fù)單克隆A. PCR identification of SPAM1 target gene; B. Identification of R6K-amp-mCMV-SPAM1-SV40 polyA-kmccdB intermediate vector by restriction enzyme digestion; C. Cloning and identification of infectious clone P15A-CAV-2-mCMV-SPAM1-SV40 polyA; D. P15A-CAV-2-mCMV-SPAM1-SV40 poly-kmccdB plasmid was identified by PCR, and lane 1, 2, 3 were duplicate monoclonal; E. The infectious clone P15A-CAV-2-mCMV-SPAM1-SV40 poly-positive bacteria was identified by PCR, and lane 1, 2, 3 were duplicate monoclonal,lane 4, 5, 6 were duplicate monoclonal

2.2 R6K-amp-mCMV-SPAM1-SV40 polyA-kmccdB中間載體PCR與酶切鑒定

使用限制性內(nèi)切酶NcoI對(duì)構(gòu)建的中間載體R6K-amp-mCMV-SPAM1-SV40 polyA-kmccdB進(jìn)行酶切電泳,酶切結(jié)果顯示分別獲得了在2 864、1 416、700、235處的4條目的條帶(圖1B),結(jié)果符合預(yù)期。通過測(cè)序酶切陽性菌結(jié)果顯示成功構(gòu)建出攜帶SPAM1外源基因的中間載體R6K-amp-mCMV-SPAM1-SV40 polyA-kmccdB。

2.3 P15A-CAV-2-mCMV-SPAM1-SV40 polyA感染性克隆PCR與酶切鑒定

使用限制性內(nèi)切酶EcoR V對(duì)構(gòu)建的感染性克隆P15A-CAV-2-mCMV-SPAM1-SV40 polyA進(jìn)行酶切電泳,酶切結(jié)果顯示分別獲得了在11 115、8 116、5 356、2 940、1 730、849、789 bp處的7條目的條帶(圖1C),結(jié)果符合預(yù)期。

2.4 重組感染性克隆PCR與測(cè)序驗(yàn)證

使用F3、R3為引物,構(gòu)建的P15A-CAV-2-mCMV-SPAM1-SV40 poly-kmccdB質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR結(jié)果顯示獲得一條4 955 bp的目的條帶,符合預(yù)期(圖1D)。分別使用F1、R1和F3、R3為引物,感染性克隆P15A-CAV-2-mCMV-SPAM1-SV40 poly酶切陽性菌為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR結(jié)果顯示分別獲得1 748、3 492 bp的目的條帶與預(yù)期相符(圖1E),并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證,證明攜帶外源基因SPAM1的感染性克隆P15A-CAV-2-mCMV-SPAM1-SV40 poly構(gòu)建成功。

2.5 病毒拯救及鑒定

以提取的P1～P16代重組病毒CAV-2-SPAM1的基因組為模板,分別使用F1、R1和F3、R3為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR結(jié)果顯示分別獲得1 748、3 492 bp的目的條帶與預(yù)期相符(圖2),說明成功拯救出1株攜帶外源基因SPAM1的重組病毒,并且該重組病毒具有基因組遺傳穩(wěn)定性。

A. 以F3、R3為引物重組病毒CAV-2-SPAM1: P1～P15. PCR結(jié)果;M.5 000 bp的DNA marker;1.陽性對(duì)照組;2.陰性對(duì)照組。B. 以F1、R1為引物重組病毒CAV-2-SPAM1: P1～P15. PCR結(jié)果; M.2 000 bp的DNA marker;1.陽性對(duì)照組;2.陰性對(duì)照組A. Recombinant virus CAV-2-SPAM1 used F3 and R3 as primers: P1-P15. PCR results; M. 5 000 bp DNA marker; 1. Positive control group; 2. Negtive control group. B. Recombinant virus CAV-2-SPAM1 used F1 and R1 as primers: P1-P15. PCR results; M. 2 000 bp DNA marker; 1.Positive control group; 2. Negtive control group

2.6 重組毒株生長(zhǎng)曲線測(cè)定

以MOI=0.1進(jìn)行接毒每隔6 h收樣,收取至72 h的樣品進(jìn)行一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定,結(jié)果顯示,野生型毒株在54 h到達(dá)平臺(tái)期,重組毒株在60 h到達(dá)平臺(tái)期(圖3),總體趨勢(shì)上野生毒株與重組毒株沒有顯著差異,最大增殖滴度無顯著差異。

CAV. 接種CAV病毒的CAV組;CAV-PH20. 接種CAV-PH20的CAV-PH20組(PH20為SPAM1基因的別名)。下同CAV. Group infected with CAV virus, named CAV group; CAV-PH20. Group infected with CAV-PH20, named CAV-PH20 group(PH20 is the alias of SPAM1 gene). The same as below

2.7 外源蛋白表達(dá)間接免疫熒光IFA檢測(cè)

以MOI=1接種6孔板培養(yǎng)的 MDCK-E1A,感染24 h后進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè),結(jié)果顯示,在沒有接種毒的空白對(duì)照組中與綠色熒光指示的CAV-2和紅色熒光指示的SPAM1均無反應(yīng)。在接種親本毒CAV-2的對(duì)照組中與綠色熒光指示的CAV-2有特異熒光反應(yīng)且與紅色熒光指示的SPAM1無反應(yīng)。在接種重組病毒CAV-2-DelE3-SPAM1的實(shí)驗(yàn)組中與綠色熒光指示的CAV-2和紅色熒光指示的SPAM1均有反應(yīng)。且可以發(fā)現(xiàn)紅色熒光指示的SPAM1有胞間彌散分布的特點(diǎn),不完全被局限于病毒感染的細(xì)胞中(圖4)。

NC. 空白對(duì)照組;CAV. 接種原毒試驗(yàn)組;CAV-2-DelE3-SPAM1. 接種重組毒試驗(yàn)組;SPAM1. 重組基因抗體顯色通道;DAPI.染核染料顯色通道;CAV. 病毒結(jié)合抗體顯色通道;Merge. 三通道融合顯色圖NC. Blank control group; CAV. Experimental group inoculated with the original virus; CAV-2-DelE3-SPAM1. Experimental group inoculated with the recombinant virus; SPAM1. Recombinant gene antibody color channel; DAPI. Nuclear dye color channel; CAV. Virus-binding antibody color channel; Merge. Three-channel fusion color image

2.8 重組溶瘤病毒體外溶瘤效應(yīng)檢測(cè)

如圖5,顯微鏡明場(chǎng)下觀察2D細(xì)胞殺傷模型和CCK8細(xì)胞殺傷檢測(cè)試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn),缺失E3區(qū)域表達(dá)外源基因SPAM1的重組溶瘤病毒對(duì)A72犬癌細(xì)胞系有強(qiáng)烈的溶瘤殺傷效應(yīng)與野毒相比沒有明顯差異,且腫瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng)具有劑量依賴性(圖6),說明重組改造沒有影響腺病毒載體對(duì)腫瘤細(xì)胞的體外殺傷活性。在3D細(xì)胞模型上可以觀察到接種野生型CAV毒株比起NC組細(xì)胞微球邊緣彌散,微球長(zhǎng)徑略有回縮,說明野生型CAV毒株對(duì)A72 3D微球具有一定的殺傷效應(yīng)。而CAV-2-DelE3-SPAM1重組毒比CAV野生型毒株顯著減小了A72 3D細(xì)胞微球的體積。

下行圖比例尺為均5 μm,3D細(xì)胞微球直徑從左到右依次為:17.63、15.85、12.27 μmThe scale of the pictures on the lower line is 5 μm, the diameters of 3D cell microsphere from left to right are 17.63, 15.85, 12.27 μm, respectively

*. P<0.05,***. P<0.001

3 討 論

溶瘤病毒為腫瘤治療提供了更安全有效的治療方法,某些天然的溶瘤病毒本身特異性靶向腫瘤細(xì)胞以及對(duì)人體的弱毒性均為溶瘤病毒治療方案提供了安全保障[17]。但是單純依靠天然溶瘤病毒去徹底殺傷清除腫瘤細(xì)胞是非常困難的。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展以及對(duì)病毒基因結(jié)構(gòu)和功能的深入了解,目前已經(jīng)可以對(duì)天然病毒基因組進(jìn)行編輯[17-18]。在病毒序列中插入外源基因,如Ma等[19]在單純皰疹病毒中刪除與病毒緊密關(guān)聯(lián)的ICP34.5/ICP0基因,插入治療基因GM-CSF(粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子),王立朋等[20]在流感病毒中插入PD1(程序性細(xì)胞死亡蛋白)序列等,獲得對(duì)腫瘤具有多能效應(yīng)的溶瘤病毒從而提高其溶瘤效果。當(dāng)前應(yīng)用的抗瘤外源基因,主要具有刺激抗瘤免疫應(yīng)答、重塑腫瘤微環(huán)境、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等功能[21],從多方面加強(qiáng)溶瘤病毒的治療效果。

SPAM1可以通過降解透明質(zhì)酸,破壞腫瘤免疫逃逸物理屏障,重塑腫瘤微環(huán)境從而增加溶瘤病毒的瘤內(nèi)擴(kuò)散,以及促進(jìn)樹突狀細(xì)胞激活腫瘤特異細(xì)胞毒性T細(xì)胞并促進(jìn)Th1型免疫細(xì)胞的瘤內(nèi)浸潤(rùn)從而提高抗腫瘤效果[22-25]。本研究首次采用犬腺病毒CAV-2作為溶瘤載體表達(dá)SPAM1蛋白,構(gòu)建拯救的重組病毒CAV-2-DelE3-SPAM1能夠高表達(dá)SPAM1蛋白,并且通過共定位關(guān)系可以發(fā)現(xiàn)SPAM1隨著細(xì)胞裂解可以被釋放并廣泛分布于所有細(xì)胞間隙不局限于病毒感染的區(qū)域,這預(yù)示著在實(shí)體瘤中SPAM1可以隨著彌散作用廣泛作用于實(shí)體瘤的腫瘤微環(huán)境實(shí)現(xiàn)其促進(jìn)抗瘤免疫效應(yīng)的目的。在體外腫瘤細(xì)胞殺傷試驗(yàn)中可以觀察到其對(duì)犬癌細(xì)胞系A(chǔ)72強(qiáng)烈的殺傷效果,與野生型毒株無顯著差異。說明缺失E3區(qū)域和SPAM1外源基因的表達(dá)沒有影響毒株對(duì)癌細(xì)胞的殺傷效率。進(jìn)一步在3D細(xì)胞微球模型中可顯著減低A72細(xì)胞微球體積,證明重組毒CAV-2-DelE3-SPAM1在實(shí)體瘤殺傷效應(yīng)上有顯著改善。

在Cloquell等[26]研究中使用CAV17進(jìn)行臨床試驗(yàn)治療10只自發(fā)腦膠質(zhì)瘤的患犬,無嚴(yán)重不良反應(yīng),僅有2只出現(xiàn)了疾病進(jìn)行性進(jìn)展,9只在外周血中檢出了循環(huán)CAV17。在Martín-Carrasco等[27]的研究中使用CAV15進(jìn)行臨床試驗(yàn)治療上皮源性的腫瘤患犬,有75%的患犬疾病被有效控制。在Cloquell等[26]和Martín-Carrasco等[27]的研究中均證明了犬腺病毒作為腫瘤患犬治療手段具有廣泛的安全性、有效性以及臨床應(yīng)用前景。在Kremer等[28]的研究中,證明了CAV2可以在體內(nèi)體外對(duì)犬高發(fā)骨肉瘤產(chǎn)生有效的殺傷效應(yīng)。CAV2作為一種病理生理學(xué)上類人Ad2、Ad5型腺病毒,若在犬腫瘤臨床治療上取得有意義的進(jìn)展,通過比較腫瘤學(xué),深入評(píng)估其對(duì)人源性腫瘤疾病的臨床治療應(yīng)用前景[29],有望為解決人體內(nèi)預(yù)存人源腺病毒抗體影響溶瘤病毒療效以及難以重復(fù)治療的問題提供新思路。

酶切連接的基因編輯技術(shù)連接效率較低并受限于天然病毒基因組單酶切位點(diǎn)的數(shù)量和位置不能進(jìn)行病毒所有基因組區(qū)域的廣泛編輯與改造,而且酶切連接由于酶切位點(diǎn)的限制不能實(shí)現(xiàn)無痕重組,非必要的堿基殘留可能會(huì)影響病毒的生物學(xué)特性增加病毒的復(fù)制負(fù)擔(dān)[30-31]。本研究使用RED/ET同源重組作為反向遺傳操作的主要基因編輯技術(shù),可以通過同源臂的設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)在病毒全基因組的所有區(qū)域進(jìn)行無痕插入,最大程度減少不必要的堿基接入,降低基因重組對(duì)病毒生物學(xué)特性的影響[32]。通過重組病毒一步生長(zhǎng)曲線可以發(fā)現(xiàn),由于外源基因的存在以及E3區(qū)域的缺失,野生毒株在54 h到達(dá)復(fù)制平臺(tái)期而重組病毒則在72 h到達(dá)復(fù)制平臺(tái)期,達(dá)峰時(shí)間延緩但病毒的最大增殖滴度未受影響,和野生型毒株一致。

在井匯源等[33]的研究中使用PRRSV作為病毒載體,在病毒基因的基因組穩(wěn)定性評(píng)估中發(fā)現(xiàn),隨著連續(xù)傳代外源基因表達(dá)量有逐漸降低的趨勢(shì)并且最大病毒增殖滴度也低于野生型毒株。CAV-2是一種雙鏈DNA病毒,具有穩(wěn)定的病毒基因組不會(huì)發(fā)生與宿主基因組的整合事件,具有臨床應(yīng)用安全性與穩(wěn)定性的優(yōu)勢(shì)。通過P1～P15的連續(xù)傳代以及PCR檢測(cè)可以發(fā)現(xiàn),外源基因在重組病毒基因組中并未發(fā)生丟失、突變重組等事件,在P15代的間接免疫熒光試驗(yàn)中可以發(fā)現(xiàn),外源基因的高表達(dá)沒有因連續(xù)傳代而丟失[34-35]。

4 結(jié) 論

本研究以CAV-2為親本株成功構(gòu)建缺失E3區(qū)域并表達(dá)外源基因SPAM1的重組CAV-SPAM1,該重組毒株具有對(duì)犬癌細(xì)胞系A(chǔ)72強(qiáng)烈的體外溶瘤活性。