香檸檬精油抗偽結(jié)核棒狀桿菌作用及機制研究

符雪珍,李鑫燦,錢虹宇,呂 紅,吳嬋玉,王曉涵,王小華,王芝英,周作勇*

(1.西南大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,重慶 402460;2.精華藥業(yè)(成都)有限公司,成都 641423)

偽結(jié)核棒狀桿菌(Corynebacteriumpseudotuberculosis,Cp)是一種兼性胞內(nèi)寄生革蘭陽性菌,能引起小反芻動物,尤其是綿羊和山羊患病,是慢性傳染病干酪性淋巴結(jié)炎(CLA)的主要病原[1]。CLA以引起被感染動物頭頸部體表淋巴結(jié)及肝、脾、肺和腎等內(nèi)臟器官的膿腫及干酪樣病變?yōu)樘卣?嚴(yán)重?fù)p害動物身體健康和動物肉制品質(zhì)量[2]。Cp感染致病病程長,發(fā)展緩慢,經(jīng)常會伴隨終生。一旦該病在某一地區(qū)發(fā)生,Cp就會通過各種方式擴散,從而導(dǎo)致該地環(huán)境出現(xiàn)持續(xù)性污染[3],極難根除,給養(yǎng)羊業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此,研究對該病原菌感染的有效防控措施具有重要意義。目前,主要有三種手段防控Cp感染:1)接種疫苗。雖然接種疫苗可有效降低Cp感染率,但是我國目前尚無有效的商品化疫苗可用;2)手術(shù)治療。這種方法僅針對出現(xiàn)體表淋巴結(jié)膿腫的病例,需將膿腫組織切開排膿[4],但其操作繁瑣且排出的膿液極易造成環(huán)境的污染,增加其他易感羊的發(fā)病率;3)藥物防治。雖然Cp對多種化學(xué)藥物和抗生素敏感,但這些藥物不易進(jìn)入膿腫部位,臨床治療效果較差,且我國自2020年7月1日畜禽飼料“禁抗令”規(guī)定,飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑(中藥類除外)的商品飼料,因此尋找新型的飼料添加劑成為預(yù)防Cp感染新的思路。

植物精油(essentials oils,EOs)是一類具有揮發(fā)性的油狀物質(zhì),屬植物次生代謝物質(zhì),主要從芳香植物的花、葉、根、莖、種子、果實或皮中提取獲得[5]。EOs具有顯著的選擇性抗菌活性,它作為一種新型飼料添加劑可起部分替代抗生素的作用,具有較好的應(yīng)用前景。研究發(fā)現(xiàn),葡萄柚精油對金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌具有較強的抗菌活性[6]。薄荷精油對金黃色葡萄球菌具有較強的抗菌和抗生物膜活性[7]。甜橙精油對枯草芽胞桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用[8]。目前,EOs是否具有Cp的活性尚不明確,因此篩選能有效抑殺Cp的植物精油對該病原防控有重要價值。本試驗選取4種來源廣泛的EOs,進(jìn)行Cp抑菌效果研究,并篩選出抗菌活性較強的香檸檬精油(bergamot essential oil,BEO),進(jìn)一步評價其體內(nèi)外抗Cp效果及機制,為后期臨床上通過添加BEO,以降低Cp對家畜的感染和危害提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、細(xì)胞及主要試劑

昆明系(KM)小鼠購自重慶萊比特生物技術(shù)有限公司;J774A.1小鼠巨噬細(xì)胞由四川大學(xué)李和賢博士饋贈;RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT reagent kit和TB Green Premix Ex Taq II均購自TaKaRa公司;香檸檬精油(生產(chǎn)批號:S21-08375)、甜橙精油(生產(chǎn)批號:S20-07005)、檸檬精油(生產(chǎn)批號:2105190218)、肉桂醛(生產(chǎn)批號:21CAL030E)均購自南京九隆匯香料有限公司;刃天青購自酷爾化學(xué)科技(北京)有限公司。

1.2 試驗菌株及培養(yǎng)

Cp ATCC19410購自廣東微生物菌種保藏中心,Cp萬州株(WZ)和宣漢株(XH02)由實驗室前期分離保存,表達(dá)超折疊綠色熒光蛋白菌株(ATCC19410-pXMJ19-sfGFP)由實驗室前期構(gòu)建保存。將Cp接種到含5%兔血的LB平板上,37 ℃培養(yǎng)48 h,挑取單個菌落于BHI肉湯培養(yǎng)24 h,使用濁度儀測定并調(diào)整細(xì)菌濃度備用。

1.3 體外篩選能高效抑殺Cp的EOs

1.3.1 不同EOs對Cp的抑菌作用 參考文獻(xiàn)報道的方法[9],采用濾紙片法檢測檸檬精油(lemon essential oil,LEO)、甜橙精油(orange essential oil,OEO)、香檸檬精油(bergamot essential oil,BEO)、肉桂醛(cinnamaldehyde,CA)對Cp抑菌效果。取100 μL Cp WZ (1×107CFU·mL-1)菌懸液均勻涂布在血瓊脂平板上,其上等距放置空白藥敏紙片,向紙片上緩慢滴加10 μL精油,對照組滴加等量滅菌PBS,37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h,觀察抑菌效果。選擇抑菌效果最優(yōu)的精油進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.3.2 BEO對Cp 最小抑菌濃度測定 參考文獻(xiàn)報道的方法[10],以刃天青顯色法測定BEO對Cp的最小抑菌濃度(MIC)。將BEO溶于含1% Tween 80 的BHI肉湯中,于第2列加入180 μL、第3～9列每孔加入100 μL BHI肉湯;同時于第2列中加入20 μL BEO溶液,混勻,取100 μL加入到第3列孔,混勻后,取100 μL加入第4列孔,按此法依次稀釋至第8列,第8列每孔棄去100 μL;取100 μL Cp菌懸液(1×105CFU·mL-1)加入第2～8列孔,即得BEO體積分?jǐn)?shù)分別為50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78 μL·mL-1的培養(yǎng)液。第9列孔加入菌懸液作為陽性對照,第10列加入BHI肉湯作為陰性對照。37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h;向所有孔內(nèi)加入20 μL刃天青溶液(終濃度為25 μg·mL-1),37 ℃恒溫孵育2 h,觀察顏色變化。

1.4 BEO對Cp體外感染小鼠巨噬細(xì)胞的影響

按照CCK8試劑盒說明書檢測BEO對小鼠巨噬細(xì)胞J774A.1活性的影響。在96孔板中按5×103細(xì)胞·孔-1鋪板,過夜貼壁培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)液,以PBS洗滌細(xì)胞,換新鮮培養(yǎng)液;設(shè)置無細(xì)胞的空白對照組、BEO不同濃度處理組(終濃度為2.4、2.8、3.2 μL·mL-1)和未處理對照組,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)12 h,加入10 μL CCK-8溶液,孵育1 h,測定OD450 nm。按公式計算:

細(xì)胞存活率(%)=

將J774A.1按2×105細(xì)胞·孔-1接種于24孔板,過夜培養(yǎng),棄去培養(yǎng)液,用PBS洗滌細(xì)胞,以ATCC19410-pXMJ19-sfGFP按感染復(fù)數(shù)為1(MOI=1)感染J774A.1,1 h后棄培養(yǎng)液,以PBS液洗3次,以含或不含BEO (1 MIC)的培養(yǎng)液培養(yǎng)5 h,棄培養(yǎng)液后,PBS液洗3次。在熒光顯微鏡下照相觀察,統(tǒng)計被ATCC19410-pXMJ19-sfGFP感染J774A.1的比例。

1.5 BEO對Cp體內(nèi)感染小鼠的影響

1.5.1 BEO對Cp感染小鼠臟器載菌量及抗菌肽表達(dá)的影響 將KM小鼠隨機分Control、BEO、Tween 80+Cp和BEO+Cp共4組,每組3只。BEO組和BEO+Cp組小鼠灌胃BEO 600 mg·(kg·d)-1,Tween 80+Cp和Control組灌胃2% Tween 80,連續(xù)灌胃5 d。BEO+Cp組和Tween 80+Cp組腹腔接種WZ 1×106CFU·(0.2 mL·只)-1,BEO組和Control組注射0.2 mL生理鹽水。參考文獻(xiàn)[11]方法,攻毒3 d后,無菌采集脾(僅用于提取RNA)、肝、腎和腹水,采用涂布平板法檢測肝、腎和腹水中的Cp水平。按試劑盒說明書,用qPCR檢測脾組織中小鼠β防御素1～4(mBD1-4)、Cathelicidin相關(guān)抗菌肽(Cramp)和殺菌滲透性增強蛋白1(Bpifa1)的mRNA的表達(dá)量。qPCR的體系為10 μL,反應(yīng)程序:95 ℃ 60 s;95 ℃5 s, 60 ℃30 s, 40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因,按2-ΔΔCt計算目的基因mRNA相對表達(dá)量。

1.5.2 BEO對Cp感染小鼠生存曲線的影響 將28只KM 小鼠隨機分為未感染(UI)組、Tween 80+Cp組、LBEO(低濃度BEO)+Cp組和HBEO(高濃度BEO)+Cp組,每組7只。UI組和Tween 80+Cp組灌胃2% Tween 80,LBEO+Cp組和HBEO+Cp組分別灌胃300 mg·(kg·d)-1和1 200 mg·(kg·d)-1的 BEO,均連續(xù)灌胃5 d;除 UI組注射0.2 mL生理鹽水外,其余組小鼠均腹腔接種WZ 1×106CFU·(0.2 mL·只)-1。連續(xù)觀察20 d,記錄每組小鼠存活情況。

1.6 BEO抗Cp機制初步探索

1.6.1 BEO作用對Cp菌體形態(tài)的影響 參考文獻(xiàn)[12]方法,用不同濃度BEO(1/2和1 MIC)在37 ℃下處理Cp WZ 6 h,將菌懸液在3 500 r·min-1離心10 min,棄上清液,加入2.5%戊二醛固定液,懸浮固定。后續(xù)步驟由里來生物科技有限公司完成,方法如下:固定好的樣本經(jīng)ddH2O清洗3次,經(jīng)1%鋨酸固定1 h,再經(jīng)ddH2O清洗3次,分別使用30%、50%和70%的乙醇依次梯度脫水15 min。最后,用70%的乙醇浸泡過夜。用90%乙醇再次洗滌,然后分別用無水乙醇和叔丁醇洗滌3次,持續(xù)15 min。將樣品進(jìn)行噴鍍處理,用掃描電子顯微鏡觀察細(xì)菌的形態(tài)變化。

1.6.2 BEO作用Cp釋放DNA到上清液中的測定 參考文獻(xiàn)[13]方法,調(diào)整對數(shù)生長期的WZ菌懸液濃度為1×108CFU·mL-1,分別用1/2、1和2 MIC的BEO處理,未經(jīng)BEO處理的細(xì)菌作為對照。在37 ℃下培養(yǎng)2、4、6 h后,4 ℃下離心(8 000×g)5 min,收集上清液。使用Nano Drop 2000紫外-可見分光光度計在260 nm處,測定釋放到上清液中的DNA含量。

1.6.3 BEO作用對Cp毒力基因表達(dá)水平的影響 挑取WZ株單菌落,接種于含0.1% Tween 80的BHI肉湯培養(yǎng)20 h,然后按1∶50將菌液接種于50 mL BHI肉湯,37 ℃、200 r·min-1震蕩培養(yǎng)12 h。離心棄上清,分別用含或不含BEO(1 MIC)的BHI肉湯培養(yǎng)6 h,4 000 r·min-1離心10 min,棄上清。按試劑盒說明書,利用RNAiso Plus提取Cp總RNA,以PrimeScriptTMRT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄為cDNA。參考文獻(xiàn)及引物[14-15],利用TB Green Premix Ex Taq II以qPCR檢測磷脂酶D (pld,89 bp)、耐銅蛋白C(copC,242 bp)、寡肽透過酶A(oppA,237 bp)、鋅依賴性超氧化物歧化酶(sodC,270 bp)編碼基因的mRNA表達(dá)水平,以16S rRNA(92 bp)為內(nèi)參,按2-ΔΔCt計算目的基因mRNA相對表達(dá)量。

1.7 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 BEO對Cp抑菌圈的測定

如圖1所示,滴加BEO和肉桂醛精油組血瓊脂平板上無Cp生長,其抑菌圈直徑在60 mm以上。滴加甜橙精油、檸檬精油抑菌結(jié)果與PBS對照組相似,無抑菌作用。表明BEO和肉桂醛精油對Cp有較好的抑殺效果,而檸檬精油和甜橙精油對Cp無抑菌作用。

A. PBS; B. 肉桂醛; C. 香檸檬精油; D. 甜橙精油; E. 檸檬精油A. PBS; B. Cinnamaldehyde; C. Bergamot essential oil; D. Orange essential oil; E. Lemon essential oil

2.2 BEO對Cp 最小抑菌濃度的測定

利用刃天青顯色法檢測發(fā)現(xiàn),BEO對所檢測Cp菌株的最小抑菌濃度(MIC)為0.78～1.56 μL·mL-1,其中對XH02抑菌效果最好,MIC為 0.78 μL·mL-1,對ATCC19410 和WZ抑菌效果相似,MIC均為1.56 μL·mL-1(圖2)。

以刃天青顯色法測定BEO對Cp的最小抑菌濃度(MIC);1. BHI 肉湯;2～8. BEO的體積分?jǐn)?shù)分別為50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56和0.78 μL·mL-1;9.不含BEO的菌液對照;10. 不含菌BHI肉湯對照;三角形表示相應(yīng)菌株的MIC孔The minimum inhibitory concentration (MIC) of BEO on Cp was determined by resazurin; 1. BHI broth; 2-8.The volume fractions of BEO were 50.00, 25.00, 12.50, 6.25, 3.13, 1.56, and 0.78 μL·mL-1, respectively; 9. Bacterial solution without BEO; 10. Non bacterial BHI broth control; Triangles represent the MIC pores of the corresponding strains

2.3 BEO對Cp體外感染小鼠巨噬細(xì)胞的影響

用含不同濃度BEO的培養(yǎng)基培養(yǎng)J774A.11巨噬細(xì)胞12 h,CCK-8檢測發(fā)現(xiàn),與對照組相比,BEO處理組J774A.1細(xì)胞活力無顯著變化(圖3A),表明以所用濃度的BEO對J774A.1細(xì)胞活性無明顯影響。進(jìn)一步檢測Cp感染巨噬細(xì)胞比例,發(fā)現(xiàn)以1 MIC的BEO處理后,與未處理對照組相比,Cp感染巨噬細(xì)胞比例顯著下降(圖3B、C)。

A. 不同濃度BEO對J774A.1細(xì)胞活性影響;B. 在有或無BEO 條件下ATCC19410-pXMJ19-sfGFP感染J774A.1后,在明場和熒光下照相的merge圖片;C. BEO對Cp感染J774A.1比例統(tǒng)計結(jié)果;Cp. ATCC19410-pXMJ19-sfGFP;ns.差異不顯著;*.P<0.05,差異顯著 A. Effect of BEO with different concentration on viability of J774A.1;B. Merge images of ATCC19410-pXMJ19-sfGFP infection of J774A. 1 under bright field and fluorescence conditions with or without BEO; C. Effect of BEO on rate of J774A.1 infected by Cp;Cp ATCC19410-pXMJ19-sfGFP;ns. Not significant;*.P<0.05,significant difference

A. 肝;B. 腎;C. 腹水;BEO.香檸檬精油;Cp.偽結(jié)核棒狀桿菌WZ株;**.P<0.01,差異極顯著A. liver; B. kidney; C. ascites; BEO.Bergamot essential oil; Cp.C. pseudotuberculosis WZ strain;**.P<0.01,significant difference

2.4 BEO對Cp感染小鼠后腹水及臟器載菌量的影響

與Tween 80+Cp相比,BEO處理后極顯著降低被感染小鼠腹水和臟器中Cp水平,其中BEO處理組肝中Cp數(shù)量降低99.06%,腎中Cp數(shù)降低99.95%,腹水中Cp數(shù)降低93.37%(圖4)。

2.5 BEO對Cp感染小鼠脾抗菌肽基因表達(dá)的影響

與空白組相比,BEO組抗菌肽基因Bpifal1、mBD2、mBD3的mRNA表達(dá)水平顯著增加(P<0.05,P<0.01),提示小鼠灌胃BEO能上調(diào)上述抗菌肽基因的表達(dá)。與Tween+Cp組相比,BEO+Cp組Cramp、Bpifal1、mBD2、mBD3的mRNA表達(dá)水平顯著增加(P<0.01),提示小鼠灌胃BEO能上調(diào)Cp感染小Cramp、Bpifa1、mBD2、mBD3和mBD4的mRNA表達(dá)水平(圖5)。

A. 殺菌滲透性增強蛋白1(Bpifa1); B. Cathelicidin相關(guān)抗菌肽(Cramp); C～F. 小鼠β防御素1～4 (mBD1-4); BEO. 香檸檬精油;Cp. 偽結(jié)核棒狀桿菌WZ株;ns. 差異不顯著;**.P<0.01和 *.P<0.05,差異顯著A. Bactericidal-permeability increasing protein 1 (Bpifa1); B. Cathelicidin-related antimicrobial peptide (Cramp); C-F. mouseβ-defensin 1-4 (mBD1-4); BEO. Bergamot essential oil; Cp. C. pseudotuberculosis WZ strain; ns. Not significant; **.P<0.01 and *.P<0.05: significant difference

2.6 BEO對Cp感染小鼠存活率的影響

為進(jìn)一步評價BEO對宿主抵御Cp感染的作用,本研究觀察了BEO灌胃對Cp感染小鼠的生存曲線的影響。結(jié)果顯示,灌胃低濃度BEO小鼠在感染后20 d內(nèi)死亡率為14.29%(1/7);灌胃高濃度BEO小鼠在感染后20 d內(nèi)死亡率為0%(0/7);灌胃Tween 80在感染后20 d內(nèi)死亡率為57.14%(4/7)(圖6),提示BEO可顯著降低Cp感染KM小鼠的死亡率。

LBEO. 低濃度香檸檬精油;HBEO. 高濃度香檸檬精油;Cp. 偽結(jié)核棒狀桿菌WZ株;UI. 未感染對照組;*.P<0.05,差異顯著LBEO. Low concentration of Bergamot essential oil; HBEO. High concentration of Bergamot essential oil; Cp.C. pseudotuberculosis WZ strain;*.P<0.05: significant difference

2.7 BEO作用對Cp菌體形態(tài)的影響

掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn),對照組Cp呈棒狀或線狀,長度均一,菌體結(jié)構(gòu)飽滿,未見皺縮,細(xì)胞膜表面光滑、平整。1/2 MIC BEO處理組部分Cp呈豆?fàn)?長度略顯變短,小部分菌體結(jié)構(gòu)皺縮,大部分菌體結(jié)構(gòu)飽滿。1 MIC BEO處理組Cp大部分呈豆?fàn)?長度明顯變短,約50%菌體皺縮,局部細(xì)胞膜輕度凹陷,細(xì)胞膜表面略顯粗糙(圖7)。表明BEO對Cp的菌體形態(tài)破壞作用明顯,使細(xì)胞膜受到不同程度的損傷。

箭頭表示Cp菌體(WZ株)皺縮、細(xì)胞膜凹陷或破壞;放大倍數(shù)為20 000×Arrows indicate shrinkage, cell membrane depression, or destruction of C. pseudotuberculosis WZ strain; magnification times, 20 000×

2.8 BEO作用Cp后上清液中DNA濃度測定

當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞膜受損時,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物如小離子、蛋白質(zhì)和核苷酸會浸出細(xì)胞膜外。與對照組相比,加入不同濃度的BEO處理2、4、6 h,Cp泄漏到上清液中DNA均顯著增高,其中BEO處理Cp在最初的2 h內(nèi)立即迅速增加,且BEO濃度越高,Cp泄漏DNA程度越明顯(圖8)。

MIC. 最小抑菌濃度;*.P<0.05, 差異顯著MIC. Minimum Inhibitory Concentration; *.P<0.05, significant difference.

2.9 BEO作用對Cp毒力基因mRNA表達(dá)的影響

毒力基因轉(zhuǎn)錄水平檢測顯示,與Cp WZ株相比,BEO處理Cp的CopC、SodC和OppAmRNA表達(dá)水平無顯著差異,但是pld的mRNA表達(dá)水平極顯著降低(P<0.01)(圖9)。

Cp. 偽結(jié)核棒狀桿菌WZ株;**.P<0.01, 差異極顯著;ns. 差異不顯著Cp. C. pseudotuberculosis WZ strain; **.P<0.01, significant difference; ns. Not significant

3 討 論

3.1 刃天青顯色法評價BEO抗菌作用依據(jù)及其抗Cp作用分析

本研究首先采用紙片擴散法篩選出對Cp具有抑菌效果的BEO,進(jìn)一步以刃天青指示劑微量肉湯稀釋法測定了其對Cp標(biāo)準(zhǔn)株ATCC19410和臨床分離株(WZ和XH02)的MIC值。刃天青是一種無毒的氧化還原染料,可在多種還原酶的作用下由藍(lán)色態(tài)被還原為紅色,在該過程中,刃天青的減少與細(xì)菌數(shù)量的增加存在直接關(guān)系[16],因此廣泛用于細(xì)菌的藥物敏感性評價研究中[10,16-17]。據(jù)報道刃天青在2.5～40.0 μg·mL-1濃度范圍內(nèi),吸光值變化與其濃度呈正相關(guān)關(guān)系[16]。本研究選擇1×105CFU·mL-1的Cp菌液濃度、25 μg·mL-1的刃天青終濃度和2 h的顯色時間,即可靈敏檢測出BEO的抗菌效果。本研究證實BEO具有抗Cp的活性,其MIC值為0.78～1.56 μL·mL-1,這與已有研究報道BEO對常見的胃腸道或皮膚疾病的細(xì)菌(如幽門螺桿菌、空腸彎曲桿菌、大腸桿菌0157、單核細(xì)胞增多性李斯特菌、蠟樣芽胞桿菌和金黃色葡萄球菌)具有抗菌作用的結(jié)果相似[18]。

Cp是一種兼性胞內(nèi)寄生菌,該病原在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活和擴散傳播是其重要特征。本研究發(fā)現(xiàn)BEO可顯著降低Cp對巨噬細(xì)胞J774A.1的感染比例,這可能與BEO抑殺Cp減少了該病原從J774A.1釋放并再次感染新的巨噬細(xì)胞有關(guān)。進(jìn)一步的體內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn),BEO可降低被感染小鼠的腹水、肝和腎中的Cp 數(shù)量,提高被感染小鼠的成活率,提示BEO可抑制Cp體內(nèi)感染的致病作用。BEO的活性化學(xué)成分包括 α-蒎烯、月桂烯、檸檬烯、α-香檸檬亭、β-甜沒藥烯、芳樟醇、乙酸芳樟酯、橙花醇、橙花醇乙酸酯、香葉醇、香茅醇乙酸酯和α-松醇等物質(zhì)[19],具體是哪種(些)活性成分發(fā)揮抗Cp作用尚待進(jìn)一步研究。

3.2 BEO抗Cp作用機制探討

EOs的成分大多為脂溶性,這些成分特性可對細(xì)菌細(xì)胞膜和胞內(nèi)物質(zhì)產(chǎn)生不利影響,如滲透細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜,從而導(dǎo)致細(xì)胞膜生物特性發(fā)生改變,破壞細(xì)胞膜或致使胞內(nèi)重要物質(zhì)外漏,進(jìn)而達(dá)到抗菌效果[20-21]。崔海英等[22]報道丁香精油能溶解單核細(xì)胞增生性李斯特菌細(xì)胞膜,導(dǎo)致細(xì)胞膜破損,內(nèi)容物流出。Song等[21]報道柑橘精油處理后,金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜表現(xiàn)出不可逆的損傷。本研究發(fā)現(xiàn)BEO可以破壞Cp菌體的完整結(jié)構(gòu),表現(xiàn)為菌體皺縮、細(xì)胞膜凹陷或破裂,導(dǎo)致被處理Cp的DNA的泄漏,且BEO濃度越高對Cp影響越大,這與Tang等[12]報道EOs以劑量依賴的形式使細(xì)菌表面發(fā)生不可逆的皺縮和粗糙,即破壞細(xì)菌的細(xì)胞形狀以及內(nèi)外結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致細(xì)菌死亡相似。Cp致病與其攜帶多種毒力因子有關(guān),其中PLD是Cp最關(guān)鍵的毒力因子之一[23],本文發(fā)現(xiàn)BEO作用顯著降低的該病原pldmRNA表達(dá)水平,但對CopC、SodC和OppAmRNA表達(dá)水平無顯著影響。綜上提示,BEO可能通過破壞Cp的菌體形態(tài),使其細(xì)胞膜受到不同程度的損傷,使胞內(nèi)DNA泄漏,從而造成Cp死亡,同時可降低該病原pld基因表達(dá)水平,從而減輕Cp對被感染小鼠的致病作用。

此外,本文還評價了BEO對Cp感染小鼠抗菌肽表達(dá)的影響。抗菌肽是機體經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的小分子量、抗菌活性廣、具有免疫調(diào)節(jié)性能的多肽[24],是機體抵御病菌感染過程中不可或缺的“化學(xué)屏障”。郭志強等[25]研究發(fā)現(xiàn),飼喂添加抗菌肽的日糧,能顯著提高肉雞IgM、IgG和補體C3含量從而提高機體免疫力;Chong等[26]研究發(fā)現(xiàn)小鼠抗菌肽mBD4降低了甲型流感病毒的傳染性,并增強了病毒感染后的先天免疫力?？咕脑谒拗鞯挚笴p感染過程中也發(fā)揮了重要的作用,韓曉芳[27]報道抗菌肽可以降低Cp感染引起皮下膿腫的嚴(yán)重程度;Zhou等[14]報道給予丁酸鈉的Cp感染小鼠脾Cramp表達(dá)顯著上調(diào)從而減輕感染。本研究發(fā)現(xiàn),BEO可上調(diào)Cp感染小鼠脾臟抗菌肽Bpifa1、mBD2和mBD3的mRNA水平,提示BEO可能通過上調(diào)相關(guān)抗菌肽基因的表達(dá)提高小鼠對該病原的抵御能力。

綜上,本文首先發(fā)現(xiàn)BEO對Cp具有良好的抗菌作用,其原因可能有:1)BEO損傷Cp的細(xì)胞膜促進(jìn)其DNA釋放,以及降低毒力基因pld表達(dá),從而致死或降低Cp致病力;2)BEO通過上調(diào)機體抗菌肽表達(dá)從而增強機體免疫力。其次,作者發(fā)現(xiàn)BEO能顯著提高Cp感染后小鼠的存活率,提示BEO極具畜牧生產(chǎn)中應(yīng)用于防控Cp感染的潛力。BEO成分的揮發(fā)性是其應(yīng)用于動物臨床時需要重點關(guān)注的問題,如何確保其穩(wěn)定性?以何種劑型給予才能更好地發(fā)揮其抑菌作用是需要進(jìn)一步探索的問題。

4 結(jié) 論

香檸檬精油能抑殺偽結(jié)核棒狀桿菌(Cp),改善Cp對小鼠的感染程度,其機制可能與BEO損傷Cp細(xì)胞膜造成DNA泄漏并降低毒力基因pld的mRNA表達(dá),以及促進(jìn)Cp感染小鼠抗菌肽Cramp、Bpifal1、mBD2、mBD3和mBD4的表達(dá)有關(guān)。