H3亞型禽流感病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

毛秋艷,周淑寧,劉 朔,彭 程,尹 馨,張雅馨,周婉婷,李金平,侯廣宇,蔣文明*,宋厚輝*,劉華雷,*

(1.浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院·動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,杭州 311300;2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,青島 266109;3.中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心,青島 266032;4.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,呼和浩特 010018)

禽流感(avian influenza,AI)是由禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)引起的一種禽類烈性傳染病,主要感染野生鳥類和家禽,偶爾也會(huì)傳播給人類等哺乳動(dòng)物宿主[1-2]。AIV屬于正黏病毒科、甲型流感病毒屬成員,核酸類型為單股負(fù)鏈分節(jié)段的RNA,病毒基因組內(nèi)含8條片段,編碼10種病毒必需蛋白和一些輔助蛋白[3-4]。目前已知AIV可依據(jù)表面蛋白血凝素(hemagglutinin,HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase,NA)抗原性的不同劃分為16種HA亞型和9種NA亞型[5],此外在蝙蝠上有H17N10、H18N11亞型流感病毒的報(bào)道[6]。由于各亞型病毒對(duì)宿主的致病力不盡相同,又可將AIV分為兩類:高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus, HPAIV)和低致病性禽流感病毒(low pathogenic avian influenza virus, LPAIV)[7],其中H3亞型AIV是野生鳥類和家禽中最常見的LPAIV之一[8],它可以長期存在于家禽體內(nèi)而不易被發(fā)現(xiàn),因常導(dǎo)致呼吸道癥狀、蛋雞產(chǎn)蛋率下降等問題而嚴(yán)重影響著我國養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展[9]。與此同時(shí),該亞型毒株能與其他亞型AIV發(fā)生基因重排使得其致病性發(fā)生改變,進(jìn)而增加了病毒突破物種傳播至人類的風(fēng)險(xiǎn)[10-11],對(duì)人類公共衛(wèi)生構(gòu)成極大的威脅。自2022年相繼出現(xiàn)兩起H3亞型AIV感染人類事件以來[12-13],世界衛(wèi)生組織(WHO)于2023年4月再次報(bào)道了中國第三例人感染H3N8亞型AIV確診病例,患者因出現(xiàn)急性呼吸道感染而死亡[14],這一事件使得人們對(duì)禽流感存在的大流行潛力而感到擔(dān)憂。雖然當(dāng)前流行的新型H3亞型AIV尚未獲得在人際間持續(xù)傳播的能力[15],但病毒不斷重組進(jìn)化的特性可能會(huì)導(dǎo)致其在禽類與哺乳動(dòng)物間的傳播特性發(fā)生改變[16],因此需要高度重視這些新型的禽流感病毒株對(duì)家禽養(yǎng)殖業(yè)和人類健康所帶來的風(fēng)險(xiǎn)和挑戰(zhàn),強(qiáng)調(diào)了當(dāng)前行之有效的檢測(cè)方法對(duì)病毒監(jiān)測(cè)的重要性,以此達(dá)到預(yù)防控制禽流感疫病暴發(fā)和降低大流行發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的目的。

目前實(shí)驗(yàn)室針對(duì)禽流感的檢測(cè)主要有以下3種方法:病毒分離與鑒定、病毒核酸檢測(cè)和血清學(xué)試驗(yàn)[17-18],其中病毒核酸檢測(cè)中的熒光定量RT-PCR方法因具有省時(shí)特異、高效靈敏、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)而被廣泛推薦應(yīng)用于臨床檢測(cè)和監(jiān)測(cè)工作中。本研究以近期在中國流行的H3亞型AIV的HA基因作為靶序列,設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物和熒光標(biāo)記探針,建立一種針對(duì)H3亞型AIV的熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法,為H3亞型AIV的臨床診斷及常規(guī)監(jiān)測(cè)提供快速可靠的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株 A/Californa/04/2009(H1N1)、A/duck/Guangdong/G2037/2022(H3N2)、A/chicken/Jiangsu/NT0322/2023(H3N3)(簡(jiǎn)稱CK/JS/NT0322/23)、A/duck/Hunan/K1354/2022(H3N6)、A/chicken/Jiangxi/P1027/2023(H3N8)、A/duck/Auhui/AG61/2011(H4N6)、A/duck/Anhui/A1105/2023(H5N1)、A/duck/Hunan/K1212/2022(H5N6)、A/duck/Guangdong/G1392/2022(H5N8)、A/duck/Guangdong/G1231/2022(H6N6)、A/chicken/Hebei/LF0317/2023(H7N9)、A/chicken/Yunnan/KM0224/2023(H9N2)、A/chicken/Jiangsu/J1284/2022(H10N3)病毒株均由中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心國家禽流感專業(yè)實(shí)驗(yàn)室保存;新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)LaSota株、傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)、傳染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)、禽腺病毒(fowl adenovirus,FADV)及鵝細(xì)小病毒(goose parvovirus,GPV)均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 試劑:病毒DNA/RNA提取試劑盒購自濟(jì)凡生物科技(常州)有限公司;HiScript?High Fidelity One Step RT-PCR Kit和HiScript?II U+One Step qRT-PCR Probe Kit購自南京諾唯贊生物科技有限公司;DNA凝膠回收試劑盒購自湖南艾科瑞生物工程有限公司;pEASY-T5試劑盒、Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)粒提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;限制性內(nèi)切酶,購自NEB(北京)有限公司;DNase I 消化酶和T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司;RNeasy?Mini Kit購自QIAGEN公司。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:10日齡SPF雞胚購自購自濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司;6周齡SPF雞購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物和TaqMan探針的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中公開的H3亞型AIV毒株的HA基因序列,利用DNAStar軟件進(jìn)行同源性分析保守區(qū)域,通過Primer5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針,經(jīng)BLAST驗(yàn)證引物和探針與相對(duì)應(yīng)的靶基因匹配性較好,引物和探針均由武漢賽維爾生物科技有限公司合成。同時(shí)設(shè)計(jì)一對(duì)常規(guī)RT-PCR擴(kuò)增引物(H3-504F/H3-504R),由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成,具體信息見表1。

表1 引物和TaqMan探針序列

1.2.2 病毒核酸的提取 參照病毒DNA/RNA提取試劑盒說明書抽提各亞型AIV、NDV、IBV、IBDV、FADV和GPV的病毒核酸;同時(shí)將H3N3亞型AIV病毒株CK/JS/NT0322/23(108.83EID50·0.1 mL-1)由106EID50·0.1 mL-110倍倍比稀釋至100EID50·0.1 mL-1,并提取各梯度核酸產(chǎn)物,然后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 cRNA陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備 使用HA基因全長通用引物對(duì)H3亞型AIV的HA基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒回收純化后,將其連接到pEASY-T5載體上,然后再轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中。挑取單菌落后進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增,利用10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證目的片段是否連接成功,隨后按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取疑似陽性質(zhì)粒,送至青島睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定,陽性質(zhì)粒命名為pEASY-AIV-H3。通過限制性內(nèi)切酶將pEASY-AIV-H3進(jìn)行線性化,使用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)線性化質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,待反應(yīng)結(jié)束后,向產(chǎn)物中加入1 μL DNase I消化酶并混勻,37 ℃孵育15 min,以除去體系中的模板DNA;再加入2 μL 0.5 mol·L-1EDTA(pH=8.0),65 ℃孵育10 min終止反應(yīng)。使用RNeasy?Mini Kit再次純化體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,最終得到含有H3亞型AIVHA基因的cRNA陽性標(biāo)準(zhǔn)品。然后利用全波長酶標(biāo)儀測(cè)定cRNA標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和純度,依據(jù)下列公式計(jì)算得出陽性標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)為1.27×1012copies·μL-1,用作下一步建立熒光定量RT-PCR的模板置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆??？截悢?shù)(copies·μL-1)=[6.02×1023×樣品濃度(ng·μL-1)×10-9]/(RNA length×340)。

1.2.4 反應(yīng)條件的優(yōu)化 使用RNase-Free ddH2O先將上述pEASY-AIV-H3陽性標(biāo)準(zhǔn)品的濃度稀釋至1.0×1012copies·μL-1,再進(jìn)行10倍倍比稀釋,以拷貝數(shù)濃度為1.0×108copies·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)品為模板,采用HiScript?II U+One Step qRT-PCR Probe Kit說明書中推薦的擴(kuò)增體系,對(duì)體系中的引物濃度(2、4、6、8、10 pmol·μL-1)和探針濃度(1、2、3、4、5、10 pmol·μL-1)配比、模板量(2、3 μL)、退火溫度(55、58、60 ℃)及延伸時(shí)間(30、45 s)等擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化,以確定最適反應(yīng)條件。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 選取1.0×108～1.0×100copies·μL-1的cRNA陽性標(biāo)準(zhǔn)品和106～100EID50·0.1 mL-1的病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)品作為繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的模板,體系配制完成后采用優(yōu)化好的反應(yīng)條件在熒光定量PCR儀上擴(kuò)增,同一梯度的樣品進(jìn)行三次平行重復(fù),然后統(tǒng)計(jì)檢測(cè)結(jié)果并使用Excel軟件繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 特異性試驗(yàn) 以H1、H3N2、H3N3、H3N6、H3N8、H4、H5、H6、H7、H9、H10亞型AIV及NDV、IBV、IBDV、FADV、GPV的核酸作為模板,RNase-Free ddH2O作為陰性對(duì)照,驗(yàn)證建立的H3亞型AIV熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的特異性。

1.2.7 靈敏性試驗(yàn) 將10倍梯度稀釋的cRNA標(biāo)準(zhǔn)品和病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)品作為擴(kuò)增模板,制備cRNA陽性標(biāo)準(zhǔn)品的空載體質(zhì)粒和RNase-Free ddH2O為陰性對(duì)照,分別采用該檢測(cè)方法和常規(guī)RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)這兩種標(biāo)準(zhǔn)品模板進(jìn)行擴(kuò)增,以檢測(cè)到S型曲線或目的條帶的標(biāo)準(zhǔn)品最低濃度為依據(jù),對(duì)兩種檢測(cè)方法進(jìn)行比較。常規(guī)RT-PCR反應(yīng)程序:50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min;94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s,共35個(gè)循環(huán);最后72 ℃ 孵育5 min。PCR產(chǎn)物使用10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.9 動(dòng)物攻毒試驗(yàn)樣品檢測(cè) 分別將含有106EID50·0.1 mL-1的H3亞型AIV毒株(CK/JS/NT0322/23)病毒懸液、0.01 mol·L-1PBS溶液滴鼻接種于6周齡SPF雞,每組3只,接種劑量均為0.1 mL·只-1。在攻毒的第3天剖殺所有雞并采集肺、氣管喉頭、盲腸、脾、腎、胰腺、腦、法氏囊、心、肝及胸腺等11種臟器,共計(jì)33份攻毒組樣品和33份對(duì)照組樣品。將組織樣品經(jīng)研磨勻漿、離心處理后,取0.1 mL上清液接種至10日齡SPF雞胚,48 h后收獲雞胚尿囊液并進(jìn)行血凝試驗(yàn)。同時(shí)使用病毒DNA/RNA提取試劑盒提取每份組織樣品的核酸,再分別使用H3亞型AIV熒光定量RT-PCR、常規(guī)RT-PCR方法對(duì)上述66份樣品進(jìn)行檢測(cè),最后將兩者的檢測(cè)結(jié)果與病毒分離鑒定結(jié)果進(jìn)行比較并計(jì)算相應(yīng)的符合率。

1.2.10 臨床樣品檢測(cè) 隨機(jī)挑選96份2023年本實(shí)驗(yàn)室保存的從活禽市場(chǎng)中采集到的口咽部和泄殖腔拭子,提取拭子樣品的RNA,應(yīng)用本研究建立的熒光RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)采用雞胚培養(yǎng)法分離病毒,利用血凝試驗(yàn)驗(yàn)證并收集陽性雞胚的尿囊液,進(jìn)一步抽提病毒核酸后擴(kuò)增HA和NA基因片段,通過測(cè)序確定病毒亞型,比較該方法的準(zhǔn)確性。

2 結(jié) 果

2.1 熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

通過對(duì)引物探針濃度配比、模板量、退火溫度及延伸時(shí)間的摸索和優(yōu)化,最終確定本研究建立的熒光定量RT-PCR的反應(yīng)體系為:2×One Step U+Mix 10.0 μL,Enzyme Mix 1.0 μL,H3-F(10 pmol·μL-1)0.4 μL,H3-R(10 pmol·μL-1)0.4 μL,H3-P(10 pmol·μL-1)0.2 μL,模板RNA 2.0 μL,最后用RNase-Free ddH2O補(bǔ)足至20.0 μL。反應(yīng)程序:50 ℃逆轉(zhuǎn)錄15 min;95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性10 s,60 ℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以10倍梯度稀釋的cRNA陽性標(biāo)準(zhǔn)品(1.0×108～1.0×100copies·μL-1)和病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)品(106～100EID50·0.1 mL-1)為模板,通過熒光定量RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增,每個(gè)梯度重復(fù)3次,結(jié)果如圖1所示。使用cRNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板時(shí),本方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y=-3.189 6x+ 41.555,擴(kuò)增效率為105.83%,相關(guān)系數(shù)R2=0.998 2>0.99;使用病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)品為模板時(shí),本方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y=-3.443 3x+ 41.025,擴(kuò)增效率為95.17%,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5>0.99,說明這兩種標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值與濃度之間均存在著良好的線性關(guān)系。

A.以cRNA陽性標(biāo)準(zhǔn)品為模板的標(biāo)準(zhǔn)曲線;B.以病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)品為模板的標(biāo)準(zhǔn)曲線A. The standard curve of using cRNA positive standard as template; B. The standard curve of using viral nucleic acid standard as template

2.3 特異性試驗(yàn)

特異性結(jié)果顯示,只有H3亞型AIV能在FAM熒光通道中出現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線(圖2),而其他亞型AIV、NDV、IBV、IBDV、FADV及GPV的檢測(cè)結(jié)果均為陰性,表明本研究建立的檢測(cè)方法特異性良好。

1. H3N3 AIV;2. H3N8 AIV;3. H3N2 AIV;4. H3N6 AIV;5～13. H1、H4、H5N1、H5N6、H5N8、H6、H7、H9、H10 AIV; 14～19.NDV、IBV、IBDV、FADV、GPV、陰性對(duì)照1. H3N3 AIV; 2. H3N8 AIV; 3. H3N2 AIV; 4. H3N6 AIV; 5-13. H1, H4, H5N1, H5N6, H5N8, H6, H7, H9, H10 AIV; 14-19. NDV, IBV, IBDV, FADV, GPV, and Negative control

2.4 靈敏性試驗(yàn)

將拷貝數(shù)濃度為1.0×108～1.0×100copies·μL-1的cRNA標(biāo)準(zhǔn)品及病毒滴度為106～100EID50·0.1 mL-1的核酸標(biāo)準(zhǔn)品分別利用熒光定量RT-PCR和常規(guī)RT-PCR進(jìn)行檢測(cè),試驗(yàn)結(jié)果顯示,H3亞型AIV熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法可檢測(cè)到的最低拷貝數(shù)濃度為1.0×102copies·μL-1(圖3A),最低病毒滴度為102EID50·0.1 mL-1(圖4A);而常規(guī)RT-PCR的最低拷貝數(shù)濃度和病毒滴度分別為1.0×103copies·μL-1和103EID50·0.1 mL-1(圖3B、圖4B),可見該方法的靈敏度是常規(guī)RT-PCR的10倍。

M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1～9. 1.0×108～1.0×100 copies·μL-1;10. 陰性對(duì)照;11.空載體質(zhì)粒M. DNA marker; 1-9. 1.0×108-1.0×100 copies·μL-1; 10. Negative control; 11. Empty vector

M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1～7. 106 ～100 EID50·0.1 mL-1;8. 陰性對(duì)照M. DNA marker; 1-7. 106 -100 EID50·0.1 mL-1; 8. Negative control

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

選取1.0×107、1.0×105和1.0×103copies·μL-1的cRNA標(biāo)準(zhǔn)品和106、104、102EID50·0.1 mL-1的病毒核酸分別進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn),組內(nèi)重復(fù)性結(jié)果顯示(圖5),兩種標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度模板的3次平行反應(yīng)在FAM熒光通道下的擴(kuò)增曲線均具有幾乎相同的擴(kuò)增趨勢(shì)。經(jīng)計(jì)算可得兩者的組內(nèi)和組間Ct值變異系數(shù)均小于1.5%(表2),表明本研究建立的熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法具有較好的重復(fù)性。

A. cRNA陽性標(biāo)準(zhǔn)品(1. 1.0×107 copies·μL-1;2. 1.0×105 copies·μL-1;3. 1.0×103 copies·μL-1;4. 陰性對(duì)照);B. 病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)品(1. 106 EID50·0.1 mL-1;2. 104 EID50·0.1 mL-1;3. 102 EID50·0.1 mL-1;4. 陰性對(duì)照)A. cRNA positive standard (1. 1.0×107 copies·μL-1; 2. 1.0×105 copies·μL-1; 3. 1.0×103 copies·μL-1; 4. Negative control); B. Viral nucleic acid standard (1. 106 EID50·0.1 mL-1; 2. 104 EID50·0.1 mL-1; 3. 102 EID50·0.1 mL-1; 4. Negative control)

表2 熒光定量RT-PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 動(dòng)物攻毒試驗(yàn)樣品檢測(cè)

對(duì)采集到的66份動(dòng)物攻毒試驗(yàn)組織樣品分別利用病毒分離鑒定、本研究建立的熒光定量RT-PCR和常規(guī)RT-PCR檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果(表3)顯示熒光定量RT-PCR和病毒分離鑒定的樣品陽性率均為36.36%(24/66),常規(guī)RT-PCR的陽性率為31.82%(21/66)。該檢測(cè)方法與病毒分離鑒定結(jié)果的符合率為100%,與常規(guī)RT-PCR的符合率為87.50%;而常規(guī)RT-PCR與病毒分離方法的符合率為84.00%,本方法相較于常規(guī)RT-PCR而言,其檢出率和靈敏性更高,適用于臨床檢測(cè)。

表3 動(dòng)物攻毒試驗(yàn)樣品檢測(cè)結(jié)果

2.7 臨床樣品檢測(cè)

利用所建立的檢測(cè)方法對(duì)2023年采集的96份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果(表4)顯示,檢出的H3亞型AIV陽性樣品數(shù)為4份,陽性率為4.17%,與病毒分離鑒定結(jié)果一致。

表4 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

禽流感不僅是嚴(yán)重危害家禽養(yǎng)殖業(yè)的傳染性疾病,也是一種重要的人畜共患病。自2000年以來,H3亞型AIV一直在我國的家禽和野生鳥類中持續(xù)傳播,尤其是在中國南方的家鴨中普遍存在,是水禽中最為流行的AIV亞型之一[19-20]。與此同時(shí),該亞型宿主廣泛,除了感染家禽和野生鳥類之外,還可傳播至多種哺乳動(dòng)物,如豬、馬、犬、貓、海豹及人類等[21]。我國在家禽中檢測(cè)到了多種H3 AIV的NA組合,包括了H3N1、H3N2、H3N3、H3N6、H3N7和H3N8[22],其中以H3N2和H3N8亞型的檢出率最高[23]。雖然H3亞型AIV是LPAIV,通常只引起輕微的呼吸道癥狀或無癥狀感染[24],死亡率較低,但由于病毒之間存在著頻繁的基因突變和重組現(xiàn)象,導(dǎo)致了近兩年H3亞型AIV新型重組體的出現(xiàn)[25-26],這些新型毒株不僅增加了對(duì)雞的致病性,還對(duì)人類健康構(gòu)成了潛在的威脅。孫洪磊等[27]的研究結(jié)果表明,一種新型三源重排H3N8亞型AIV在我國多個(gè)省份的雞群中流行,呈現(xiàn)出高度適應(yīng)的表現(xiàn),引起雞群臨床發(fā)病,且具有感染人類的風(fēng)險(xiǎn)。2022年以來,新型H3N8 AIV已在河南、湖南、廣東引起3起人感染病例[14,28]。同時(shí),水禽和陸生禽類界面復(fù)雜的流行病學(xué)和生態(tài)學(xué)可能促進(jìn)了新型H3亞型重組病毒株在雞群中的出現(xiàn)[19,23]。因此,加強(qiáng)對(duì)國內(nèi)家禽和野鳥中H3亞型AIV的快速診斷和監(jiān)測(cè)必不可少,將有助于疾病的早期預(yù)警。

當(dāng)前對(duì)于H3亞型AIV的診斷方法較多,其中以病毒分離鑒定和常規(guī)PCR檢測(cè)在臨床實(shí)際中運(yùn)用最為廣泛,同時(shí)也存在一些不可避免的缺點(diǎn),如耗費(fèi)時(shí)間長、操作繁瑣、自動(dòng)化程度低、檢出率不高等。為解決此類問題在臨床樣品檢測(cè)中所帶來的困擾,一種具備高度特異、靈敏特點(diǎn)的熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法應(yīng)運(yùn)而生,該方法現(xiàn)多運(yùn)用于人源、豬源、馬源的H3毒株的檢測(cè)[29-31],而適用于我國禽源H3亞型AIV的檢測(cè)應(yīng)用較少。為此本研究設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物和相應(yīng)的TapMan探針,通過優(yōu)化反應(yīng)條件,開發(fā)了一種用于檢測(cè)H3亞型AIV的熒光定量RT-PCR方法。該方法可特異性檢測(cè)H3亞型禽流感病毒株,與其他病毒之間無交叉反應(yīng)性;最低拷貝數(shù)濃度和病毒滴度檢測(cè)線分別為1.0×102copies·μL-1和102EID50·0.1 mL-1,靈敏度是常規(guī)RT-PCR的10倍;組內(nèi)和組間的變異系數(shù)均小于1.5%,以上結(jié)果說明本研究建立的檢測(cè)方法具有良好的特異性、靈敏性和重復(fù)性。應(yīng)用此方法對(duì)采集到的動(dòng)物攻毒試驗(yàn)組織樣品進(jìn)行檢測(cè),并與病毒分離鑒定和常規(guī)RT-PCR相比較,結(jié)果表明,熒光定量RT-PCR的結(jié)果與病毒分離鑒定一致,符合率為100%,而陽性檢出率要高于常規(guī)RT-PCR,兩者的符合率為87.50%。因此該方法更靈敏,檢測(cè)效率更高,同時(shí)可實(shí)現(xiàn)大量樣品的快速檢測(cè),節(jié)省大量的時(shí)間,能夠滿足臨床快速診斷的實(shí)際需求。從動(dòng)物攻毒試驗(yàn)樣品檢測(cè)結(jié)果可以看出,本研究選取的試驗(yàn)毒株具有較廣的組織嗜性,可在多個(gè)臟器中復(fù)制,對(duì)雞的損傷較大。以往的研究表明之前流行的H3亞型AIV主要存在于水禽中,而當(dāng)前一些研究顯示現(xiàn)階段流行的毒株在雞群中的比例有所上升[22],且基因片段逐漸復(fù)雜多樣化,極大地增加了病毒感染哺乳動(dòng)物或“溢出性”感染人類的風(fēng)險(xiǎn)[32-33],為此高效靈敏快捷的檢測(cè)手段對(duì)H3亞型AIV的早期預(yù)警和預(yù)防控制具有重要意義。

4 結(jié) 論

本研究建立了一種針對(duì)H3亞型AIV的熒光檢測(cè)方法,具有良好的特異性、靈敏性和重復(fù)性,同時(shí)可實(shí)現(xiàn)大量樣品的快速檢測(cè),為禽流感流行病學(xué)調(diào)查和常規(guī)監(jiān)測(cè)及防控提供一定的技術(shù)支撐。