與雞內(nèi)皮血管瘤病例相關(guān)的禽白血病病毒K亞群分離及其gp85基因演化分析

梁燦新,鄭小雪,舒雪利,周婉怡,廖 明,曹偉勝

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東省動(dòng)物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,人獸共患病防控制劑國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510642)

禽白血病是由禽白血病病毒引起的導(dǎo)致禽類(lèi)免疫抑制、生長(zhǎng)緩慢、生產(chǎn)性能下降并誘發(fā)多種腫瘤的疾病[1]。目前該病在我國(guó)及世界多個(gè)國(guó)家廣泛流行,在家禽生產(chǎn)中危害極大,給家禽養(yǎng)殖行業(yè)帶來(lái)重大的經(jīng)濟(jì)損失[2],更是嚴(yán)重影響并危害到我國(guó)地方品種雞的優(yōu)質(zhì)基因庫(kù)[3],曾于2012年被納入我國(guó)動(dòng)物疫病凈化的重點(diǎn)防控對(duì)象和凈化目標(biāo),是《全國(guó)肉雞遺傳改良計(jì)劃(2021-2035)》《全國(guó)蛋雞遺傳改良計(jì)劃(2021—2035)》以及《種源動(dòng)物健康標(biāo)準(zhǔn)》中重點(diǎn)防控的動(dòng)物疫病。根據(jù)宿主范圍、病毒囊膜糖蛋白及病毒中和試驗(yàn),ALV被分為A～K等亞群,目前在中國(guó)地方雞群中流行較多且引起主要危害的是A、B、J、K等亞群[4]。其中ALV-K是2012年由王鑫等[5]從蘆花雞中發(fā)現(xiàn)的新型禽白血病病毒,其復(fù)制能力和致病力相對(duì)較弱,感染ALV-K的雞群往往表現(xiàn)出亞臨床癥狀[6]。但是由于我國(guó)地方品種雞的品種繁多且分布較廣,這可能有利于禽白血病的傳播和進(jìn)化,ALV-K在地方雞群中的潛在流行趨于嚴(yán)重[7],且頻繁出現(xiàn)與其他亞群ALV重組出現(xiàn)雙重、多重ALV重組株的相關(guān)報(bào)道[8-10]。本研究在華南地區(qū)某規(guī)模化種禽場(chǎng)中調(diào)查發(fā)現(xiàn)其部分父母代花雞頭部出現(xiàn)疑似腫瘤病變,通過(guò)對(duì)該病例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷及相關(guān)病原研究,結(jié)果表明該病例的主要相關(guān)性病原為ALV-K,以期為ALV-K的致病性分析支撐和致病機(jī)理的研究提供基礎(chǔ),并且為中國(guó)地方雞群的ALV凈化方案提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品、細(xì)胞和主要試劑

雞血漿、組織病料樣品均來(lái)自于華南地區(qū)各規(guī)?；N禽場(chǎng);雞胚成纖維細(xì)胞系(DF-1細(xì)胞)由廣東省動(dòng)物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存;DMEM高糖培養(yǎng)基、胰酶(0.25% Trypsin-EDTA)、新西蘭胎牛血清均購(gòu)自Gibico公司;總RNA極速抽提試劑盒購(gòu)自上海飛捷生物技術(shù)有限公司;PCR酶2×Hieff PCR Master Mix (With Dye)購(gòu)自上海翌圣生物科技有限公司;高保真酶、反轉(zhuǎn)錄酶均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司;ALV p27單克隆抗體購(gòu)自廣州千尋生物科技有限公司;ALV-J單克隆抗體(JE9)由揚(yáng)州大學(xué)秦愛(ài)建教授提供;熒光二抗goat anti-mouse IgG secondary antibody購(gòu)自LI-COR公司。

1.2 病理學(xué)診斷

無(wú)菌操作剪取患病雞頭部疑似腫瘤病變組織,于4%多聚甲醛固定液中進(jìn)行固定,24 h后對(duì)病料組織塊進(jìn)行修塊、沖洗、乙醇梯度脫水、丙酮透明、軟蠟和硬蠟浸蠟后石蠟包埋,經(jīng)切片、攤片、烘干后制作成組織切片。然后對(duì)組織切片進(jìn)行脫蠟、蘇木精-伊紅(HE)染色,并且進(jìn)行顯微鏡檢查。

1.3 PCR檢測(cè)禽白血病病毒

提取疑似腫瘤組織RNA反轉(zhuǎn)錄獲得前病毒cDNA,并且以此為模板,使用特異性引物(表1)[11-13]進(jìn)行ALV-A/B/J/K、REV和MDV等病原的特異性檢測(cè)。ALV-A/J的PCR檢測(cè)程序:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,共35個(gè)循環(huán),72 ℃ 7 min,16 ℃保存。在ALV-B/K的PCR檢測(cè)程序中退火溫度為60 ℃,延伸時(shí)間為1 min 30 s,其余同上。在REV和MDV的PCR檢測(cè)程序中退火溫度為57 ℃,延伸時(shí)間為40 s,其余同上。PCR產(chǎn)物用含1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,并且通過(guò)凝膠成像分析系統(tǒng)觀察并拍照。

表1 ALV-A/B/J/K、REV、MDV特異性引物

1.4 病毒分離和鑒定

無(wú)菌操作采集患病雞的血漿樣品32份,疑似腫瘤組織、腦組織樣品各6份并且制備成組織勻漿。將血漿樣品和組織勻漿接種至生長(zhǎng)密度為70%～80%的DF-1細(xì)胞,于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3 h,更換含10% FBS的細(xì)胞培養(yǎng)基并且盲傳三代,更換1% FBS的細(xì)胞培養(yǎng)基維持培養(yǎng)9 d。細(xì)胞培養(yǎng)板經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融三次后,吸取上清液使用奧睿特禽白血病抗原檢測(cè)試劑盒進(jìn)行ALV p27抗原ELISA檢測(cè)。

1.5 ALV分離株純凈性檢測(cè)

將ALV p27抗原檢測(cè)陽(yáng)性的樣品重新接種DF-1細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)繁,維持培養(yǎng)9 d后,分別使用ALV p27單克隆抗體及ALV-J單克隆抗體JE9作為一抗,FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗,對(duì)感染了ALV分離株的DF-1細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)驗(yàn)證,同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。并且提取細(xì)胞培養(yǎng)上清液中病毒RNA,通過(guò)RT-PCR進(jìn)行ALV亞群鑒定。

1.6 ALV分離株env基因擴(kuò)增、測(cè)序及序列分析

為更好地分析ALV分離株的分子遺傳信息特征,本研究從華南地區(qū)其他5個(gè)規(guī)?；N禽場(chǎng)中分離獲得與本病例相同亞群ALV。參考相關(guān)文獻(xiàn)的特異性引物對(duì)ALV分離株的env基因進(jìn)行擴(kuò)增[14],并將PCR產(chǎn)物連接到pMD18T克隆載體上,轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,挑取陽(yáng)性菌落送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果使用用DNAstar軟件對(duì)進(jìn)行剪輯,使用MEGA-X分析軟件中的Maximum Likelihood方法對(duì)ALV分離株的gp85基因與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的各亞群ALV參考株(表2)進(jìn)行遺傳演化分析,并且使用MegAlign程序針對(duì)gp85囊膜蛋白氨基酸序列進(jìn)行了突變位點(diǎn)的分析。

表2 ALV參考株信息

2 結(jié) 果

2.1 頭部疑似腫瘤病例初步診斷

華南地區(qū)某黃羽肉雞規(guī)模化種禽場(chǎng)在400日齡的部分父母代花雞頭部雞冠下緣出現(xiàn)白色、質(zhì)地堅(jiān)硬且形狀不規(guī)則的腫塊(圖1),發(fā)病率約為2%,除頭部腫塊外未見(jiàn)其他不良表現(xiàn),且發(fā)病雞群僅限于花雞品系中,其他黃羽肉雞品系未見(jiàn)類(lèi)似病癥。對(duì)患病雞頭部腫塊病理組織學(xué)診斷,樣品中均有腫瘤組織形成的新生血管和分化中的血管(圖2a、b),可見(jiàn)海綿狀新生血管(圖2c、d),并且伴隨有偽嗜酸性粒細(xì)胞樣瘤細(xì)胞增生浸潤(rùn)(圖2e、f),病理組織學(xué)診斷為內(nèi)皮血管瘤。

A、b.腫瘤組織中可見(jiàn)新生血管和分化中的血管形成;c、d.腫瘤組織中可見(jiàn)海綿狀新生血管;e、f.腫瘤組織中可見(jiàn)為嗜酸性粒細(xì)胞樣瘤細(xì)胞浸潤(rùn)a, b. Neovascularization and differentiated angiogenesis are seen in tumor tissue; c, d. Cavernous neovascularization is seen in the tumor tissue; e, f. The tumor is infiltrated with eosinophilic granulocytoma cells

對(duì)6只發(fā)病雞腫瘤組織RNA進(jìn)行ALV-A/B/J/K、REV、MDV等病毒性腫瘤病病原的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,6份腫瘤組織中均檢測(cè)到ALV-K特異性條帶(圖3),且1號(hào)發(fā)病雞腫瘤組織中同時(shí)出現(xiàn)ALV-J和ALV-K特異性條帶,均未見(jiàn)ALV-A、ALV-B、MDV、REV感染。初步表明發(fā)病雞頭部腫瘤的癥狀可能與禽白血病病毒相關(guān)。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1～6.患病雞腫瘤組織cDNA;7.陰性對(duì)照;8.陽(yáng)性對(duì)照M.DL2000 DNA marker;1-6. cDNA from tumor tissue of diseased chicken;7.Negative control;8.Positive control

2.2 病毒的分離鑒定

在病毒分離鑒定中,從腦組織勻漿中成功分離4株ALV,分別命名為GXJL01～GXJL04。對(duì)4個(gè)ALV分離株的IFA檢測(cè)結(jié)果顯示接種GXJL01～GXJL04的DF-1細(xì)胞,p27單抗處理組發(fā)出特異性綠色熒光,JE9單抗處理組和陰性對(duì)照組均無(wú)熒光出現(xiàn)(圖4a),顯示GXJL01～GXJL04均不是ALV-J。經(jīng)RT-PCR檢測(cè)驗(yàn)證,GXJL01～GXJL04均為ALV-K,無(wú)ALV-A/B/J共感(圖4b)。而血漿樣品和腫瘤組織勻漿中均未分離到外源性ALV病原。

A. GXJL01-GXJL04分離株IFA鑒定; b.GXJL01-GXJL04分離株的外源性ALV的RT-PCR鑒定;M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1～4.GXJL01-GXJL04接種DF-1細(xì)胞培養(yǎng)上清;5.陰性對(duì)照;6.陽(yáng)性對(duì)照a. Identification of GXJL01-GXJL04 by IFA; b. RT-PCR identification of exogenous ALVs from GXJL01-GXJL04 isolates; M.DL2000 DNA marker; 1-4. cDNA of GXJL01-GXJL04 from DF-1 cell culture supernatant; 5. Negative control; 6. Positive control

2.3 11個(gè)ALV-K分離株gp85基因演化分析

為進(jìn)一步了解GXJL01～GXJL04這4個(gè)ALV-K分離株的遺傳進(jìn)化特點(diǎn),本研究從華南地區(qū)5個(gè)規(guī)模化種禽場(chǎng)臨床血漿樣品中分離得到7個(gè)ALV-K流行毒株,分別命名為GD22JL01、GD22JL02、GD22LH01、GD22FX01、GD22FX02、GD22NH01、GD22HD01?；贏LV-K分離株的gp85基因,利用MEGA-X分析軟件中的Maximum Likelihood方法進(jìn)行遺傳演化分析。結(jié)果顯示(圖5),GXJL01～GXJL04與GD22JL01等7個(gè)ALV-K分離株雖與ALV-K參考株同屬于同一進(jìn)化分支上,但分屬于2個(gè)小的拓?fù)淙?GXJL01～GXJL04與Km_5845、Sp53等FGV參考株及JS15SG01等在同一遺傳進(jìn)化分支拓?fù)淙荷?命名為Group 1,而GD22JL01等7個(gè)ALV-K分離株則與ALV-K原型株JS11C1等在另一個(gè)遺傳進(jìn)化分支拓?fù)淙荷?命名為Group 2。揭示了GXJL01-GXJL04這4個(gè)ALV-K分離株的gp85基因相較于華南地區(qū)ALV-K流行株具有一定特殊性。

紅色三角形標(biāo)記為頭部腫瘤ALV-K分離株,紅色星號(hào)標(biāo)記為華南地區(qū)分離的7個(gè)ALV-K流行株The red triangle marks the head tumor ALV-K isolate, Red asterisks indicate seven endemic strains of ALV-K isolated from South China

2.4 11個(gè)ALV-K分離株gp85氨基酸序列突變位點(diǎn)分析

將11個(gè)ALV-K分離株與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的ALV-K參考株及FGV參考株進(jìn)行g(shù)p85氨基酸序列比對(duì)。結(jié)果顯示,GXJL01～GXJL04分離株gp85囊膜蛋白氨基酸序列存在多個(gè)與FGV參考株及JS15SG01相同而區(qū)別于華南地區(qū)ALV-K分離株的氨基酸位點(diǎn)突變,主要集中在vr1、hr1及hr2區(qū)域。

在vr1區(qū)域中,GXJL01～GXJL04存在I66V、G69A的突變情況,在第70位氨基酸位點(diǎn),相較于大部分ALV-K參考株及7個(gè)華南地區(qū)ALV-K分離株,插入一個(gè)絲氨酸(S),位點(diǎn)突變及插入情況與大部分FGV參考株及JS15SG01一致。在hr1區(qū)域中,GXJL01和GXJL03存在P122S位點(diǎn)突變,與FGV參考株及JS15SG01一致;GXJL01～GXJL04存在N123G為點(diǎn)突變,與FGV參考株及JS15SG01一致而區(qū)別于大部分ALV-K參考株及7個(gè)華南地區(qū)ALV-K分離株。在hr2區(qū)域中,GXJL01和GXJL03存在P196S、R198F和A205V位點(diǎn)突變,第196位和205位突變情況與FGV參考株及JS15SG01一致,第198位突變與Km_5844等FGV參考株及JS15SG01一致;GXJL01-GXJL04存在H202R、T204P、S215R位點(diǎn)突變,突變情況與FGV參考株及JS11C1參考株一致,有區(qū)別于大部分ALV-K參考株及7個(gè)華南地區(qū)ALV-K分離株。在可變區(qū)和高變區(qū)外,GXJL01～GXJL04存在G55D和L163V位點(diǎn)突變,第55位突變情況與FGV參考株一致,第163位突變情況與FGV參考株及JS15SG01一致。此外,GXJL02和GXJL04的gp85囊膜蛋白多個(gè)氨基酸位點(diǎn)表現(xiàn)出獨(dú)有的突變情況,如G61R、W150E、L153V、T194R和R199F及第138位點(diǎn)表現(xiàn)為獨(dú)特的精氨酸(R)。

綜上,GXJL01～GXJL04四個(gè)分離株的氨基酸序列存在多個(gè)與日本FGV參考株及JS15SG01相同而區(qū)別于其他ALV-K的位點(diǎn)突變,同時(shí)也存在多個(gè)區(qū)別于其他所有ALV-K參考株及FGV參考株的獨(dú)特突變位點(diǎn),揭示GXJL01-GXJL04的gp85囊膜蛋白的特殊性。

3 討 論

自2012年王鑫等[5]在蘆花雞中發(fā)現(xiàn)ALV-K以來(lái),其在雞群中的致病力和復(fù)制能力顯著低于ALV-A/B/J[15],感染雞往往表現(xiàn)出生長(zhǎng)緩慢、生產(chǎn)性能下降及疫苗免疫失敗等亞臨床癥狀,鮮有ALV-K致病誘發(fā)雞腫瘤的相關(guān)報(bào)道,且本病例頭部出現(xiàn)疑似腫瘤的表觀癥狀在中國(guó)本土雞群中少有出現(xiàn),且鮮有針對(duì)類(lèi)似病例的相關(guān)報(bào)道。在該病例的臨床診斷過(guò)程中發(fā)現(xiàn)患病雞頭部出現(xiàn)的疑似腫瘤與日本矮腳雞出現(xiàn)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤相似,神經(jīng)膠質(zhì)瘤是由FGV引起的腫瘤性疾病,其特征病變?yōu)閺浬⑿苑腔撔阅X炎,多發(fā)性神經(jīng)膠質(zhì)結(jié)節(jié)增生甚至出現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤的病變[16-19],為本病例的實(shí)驗(yàn)室診斷及相關(guān)病原研究提供了方向。

但是在病理學(xué)診斷過(guò)程中發(fā)現(xiàn),患病雞頭部腫瘤中可見(jiàn)明顯海綿狀新生血管及分化中的血管,并伴隨有偽嗜酸性粒細(xì)胞樣瘤細(xì)胞增生浸潤(rùn),為內(nèi)皮血管瘤。而在過(guò)往中國(guó)地方品種雞關(guān)于血管瘤的相關(guān)報(bào)道中,其主要相關(guān)病原多為ALV-J,特征病變?yōu)槠つw、腳趾、內(nèi)臟器官等出現(xiàn)血管瘤樣病變[20-22]。但是在RT-PCR檢測(cè)中發(fā)現(xiàn),6份患病雞頭部腫瘤組織均呈現(xiàn)ALV-K陽(yáng)性,其中1份腫瘤組織呈現(xiàn)出ALV-J和ALV-K共感染的情況,提示ALV-K很可能為該頭部?jī)?nèi)皮血管瘤病例的相關(guān)病原,這在過(guò)往關(guān)于ALV致瘤研究中是未曾出現(xiàn)的。

在進(jìn)一步開(kāi)展病毒的分離鑒定中,參考2002年Iwata等[16]利用神經(jīng)膠質(zhì)瘤患病矮腳雞腦組織勻漿攻毒SPF雞的研究,證明日本矮腳雞神經(jīng)膠質(zhì)瘤是由ALV引起的,因此在針對(duì)本病例的病毒分離鑒定中,除了無(wú)菌操作采集32份患病雞血漿樣品及6份腫瘤組織勻漿外,還無(wú)菌操作采集了6份腦組織勻漿,接種至DF-1細(xì)胞中進(jìn)行病毒分離鑒定,最終成功從腦組織勻漿中分離得到ALV-K(GXJL01～GXJL04),但在血漿和腫瘤組織勻漿中均未能成功分離相關(guān)病原體,其原因可能是該ALV-K病原體存在一定的組織嗜性,在血漿中病毒含量較低,且位于體表的腫瘤組織容易受到環(huán)境因素影響而失活導(dǎo)致病毒分離失敗。而在腦組織勻漿中分離到的GXJL01～GXJL04,表明該ALV-K分離株可入侵并定殖于中樞神經(jīng)系統(tǒng),而研究表明FGV毒株也能入侵家禽的中樞神經(jīng)系統(tǒng),而導(dǎo)致小腦發(fā)育不全、非化膿性腦炎及星形膠質(zhì)細(xì)胞增生甚至神經(jīng)膠質(zhì)瘤等癥狀[18],且對(duì)在中國(guó)地區(qū)分離獲得的ALV-K、ALV-E和ALV-J多重重組毒株JS15SG01的致病性試驗(yàn)結(jié)果表明,感染JS15SG01的病雞大腦皮層內(nèi)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞明顯增多,也具有神經(jīng)組織嗜性[23],該研究結(jié)果為本研究從腦組織勻漿中成功分離ALV-K提供了依據(jù)。

為了更好地分析GXJL01～GXJL04的分子遺傳特征,本研究還從華南地區(qū)5個(gè)規(guī)?；N禽場(chǎng)中分離ALV-K流行株共7個(gè),在臨床上7個(gè)ALV-K分離株的宿主雞均未表現(xiàn)出明顯癥狀?；贏LV-Kgp85基因的遺傳演化分析中,發(fā)現(xiàn)GXJL01～GXJL04與GD22JL01等7個(gè)ALV-K分離株的遺傳進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。GXJL01～GXJL04與Km_5845、Sp53等FGV參考株及JS15SG01等ALV-K參考株具有相近的遺傳進(jìn)化關(guān)系,由于ALV的gp85基因編碼的囊膜蛋白gp85含有病毒入侵宿主時(shí)與受體結(jié)合的抗原決定簇,決定著ALV入侵宿主細(xì)胞的偏嗜性[24],且Km_5845、Sp53等FGV參考株及JS15SG01等均為有神經(jīng)組織嗜性的毒株,因此在遺傳分子水平上提示GXJL01～GXJL04也存在與Km_5845、Sp53等FGV參考株及JS15SG01等相同的生物學(xué)特性[25-26],可能為引起本病例的關(guān)鍵致病因素,但具體GXJL01～GXJL04分離株是否有神經(jīng)組織嗜性還需進(jìn)一步致病性試驗(yàn)驗(yàn)證。

本研究在對(duì)gp85囊膜蛋白氨基酸位點(diǎn)突變分析中,發(fā)現(xiàn)GXJL01～GXJL04的gp85氨基酸序列存在多個(gè)區(qū)別于華南地區(qū)ALV-K分離株而與日本FGV及ALV-K重組株JS15SG01一致的氨基酸位點(diǎn)突變,主要集中在vr1、hr1、hr2區(qū)且不僅限于以上區(qū)域。如G55D、I66V、G69A、N123G、L163V、H202R、T204P、S215R,以及GXJL01～GXJL04在第70位插入的絲氨酸(S)。由于以上突變位點(diǎn)與日本FGV毒株及JS15SG01等具有明顯神經(jīng)組織嗜性的ALV-K參考株一致,結(jié)合從頭部腫瘤病雞腦組織勻漿中分離獲得的ALV-K,提示GXJL01～GXJL04也具有神經(jīng)組織嗜性的極大可能性,因此推測(cè)以上突變位點(diǎn)為花雞頭部腫瘤致病以及ALV-K突變株表現(xiàn)出神經(jīng)組織嗜性的關(guān)鍵氨基酸突變位點(diǎn)。此外,GXJL02和GXJL04的gp85囊膜蛋白還存在多個(gè)獨(dú)特的突變位點(diǎn),如G61R、W150E、L153V、T194R和R199F等,是其他ALV-K及FGV參考株均未出現(xiàn)的突變情況。以上gp85氨基酸突變位點(diǎn)的具體生物學(xué)功能需要進(jìn)一步的病毒改造及致病性試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究首次證明華南地區(qū)某規(guī)?；N禽場(chǎng)中花雞頭部出現(xiàn)的腫瘤病例為內(nèi)皮血管瘤,其主要相關(guān)病原為ALV-K,并且分離鑒定到4株ALV-K(GXJL01～GXJL04),遺傳演化分析表明內(nèi)皮血管瘤相關(guān)的GXJL01～GXJL04與FGV、JS15SG01等具有神經(jīng)組織嗜性的毒株高度同源。