Bta-miR-101對牛睪丸支持細(xì)胞增殖、凋亡及分泌的影響

虎巧燕,翟相欽,李一丹,韓家樂,雷初朝,黨瑞華

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院,楊凌 712100)

成熟精子由精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells,SSC)進(jìn)行自我更新和分化產(chǎn)生,于睪丸內(nèi)的精細(xì)管中進(jìn)行,精細(xì)管中主要包含支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞[1]。支持細(xì)胞(sertoli cell,SC)是不規(guī)則的圓錐形細(xì)胞,核仁突出,是曲精細(xì)管內(nèi)維持細(xì)胞生存微環(huán)境的組成部分,具有多種生物學(xué)功能[2-3],主要通過為生殖細(xì)胞提供生理和營養(yǎng)支持來調(diào)節(jié)精子發(fā)生,使精子能夠持續(xù)產(chǎn)生,在精子發(fā)生過程中起著核心作用[4-5]。支持細(xì)胞是微環(huán)境中最重要的體細(xì)胞類型,是唯一與精子各階段直接相交的體細(xì)胞,在精子發(fā)生中支持和引導(dǎo)雄性生殖細(xì)胞的發(fā)育,是決定精子產(chǎn)生質(zhì)量與數(shù)量的關(guān)鍵因素[6]。由于只有未成熟支持細(xì)胞才能進(jìn)行增殖,因此成年牛睪丸組織中支持細(xì)胞的數(shù)量以及支持細(xì)胞對生殖細(xì)胞的支持能力是固定的,這就意味著性成熟前公牛睪丸支持細(xì)胞的增殖能力對其性成熟后的繁殖性能有著重要影響[7]。

miRNA是小的內(nèi)源性非編碼RNA,約有22～27個核苷酸,廣泛存在于各種生物中,具有高度的保守性,可以調(diào)控與機(jī)體生長發(fā)育相關(guān)的多種過程[8-10]。每個miRNA有多個mRNA作為靶點(diǎn),與此同時,每個mRNA也受到多個miRNA的調(diào)控,這也使得蛋白質(zhì)的表達(dá)調(diào)控更具復(fù)雜性[11-12]。諸多研究表明,miRNA可以通過對雄性睪丸支持細(xì)胞的增殖、凋亡、分泌以及血睪屏障的形成等過程進(jìn)行調(diào)控,從而影響雄性動物的生殖能力[13-15]。Gao等[16]發(fā)現(xiàn),miR-146b在牛睪丸組織中高表達(dá),用miR-146b的mimics對生殖細(xì)胞進(jìn)行處理后發(fā)現(xiàn)miR-146b會抑制生殖細(xì)胞的增殖,并促進(jìn)其凋亡。2020年Sellem等[17]通過深度測序鑒定出了20余種在公牛睪丸組織中高表達(dá)的miRNA。Wu等[18]發(fā)現(xiàn),miR-19b、miR-133a、miR-2285b、miR-2405、miR-759、miR-2284z、miR-34b、miR-2334、miR-2285e、miR-302a在青年公牛精液中的表達(dá)存在顯著差異,這些miRNA的靶點(diǎn)與著床前胚胎的代謝和發(fā)育通路如TGF-β、PI3K/AKT以及氧化磷酸化和線粒體功能障礙有關(guān)。因此,miRNA在雄性動物精子發(fā)生、支持細(xì)胞形成的過程中發(fā)揮著重要作用。

目前,關(guān)于miR-101的研究主要聚焦于對腫瘤及癌細(xì)胞的研究[19-20]。Dong等[21]發(fā)現(xiàn),miR-101-3p通過抑制KPNA2促進(jìn)細(xì)胞凋亡,從而抑制肺鱗狀細(xì)胞癌的活力、侵襲和遷移。在肝癌細(xì)胞中,Xu等[22]發(fā)現(xiàn)miR-101-3p靶向ARHGAP1抑制肝癌細(xì)胞集落的形成和侵襲。然而關(guān)于miR-101在生殖細(xì)胞方面,尤其是與支持細(xì)胞相關(guān)的研究相對較少。Luo等[23]研究了miR-101對豬卵母細(xì)胞的影響,發(fā)現(xiàn)miR-101通過靶向豬卵丘細(xì)胞中的HAS2來調(diào)控卵母細(xì)胞的成熟。程鵬等[24]研究發(fā)現(xiàn),在隱睪小鼠個體中miR-101的表達(dá)量升高,說明miR-101與精子發(fā)生有著密切關(guān)系。實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示,bta-miR-101在牛睪丸組織初生期和成年期的表達(dá)水平存在顯著性差異,初生期bta-miR-101的表達(dá)量高于成年期,因此推測miR-101可能對公牛的睪丸發(fā)育、精子發(fā)生以及繁殖性能有重要影響。本試驗(yàn)以miR-101為研究對象,初步探索其對牛睪丸支持細(xì)胞增殖、分泌與凋亡的影響,為進(jìn)一步研究miR-101對牛睪丸發(fā)育的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清FBS(Cellmax,美國)、細(xì)胞裂解液(Solarbio,中國)、全蛋白提取試劑盒(索萊寶,北京)、ECL顯色液(索萊寶,北京)、PrimeScriptTM RT Master Mix、MiR-XTM miRNA FirstStrand Synthesis(TaKaRa,中國)、CCK-8、RNAiso(TaKaRa,中國)。miR-101 mimics、miR-101 inhibitor、mimics NC、inhibitor NC由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

1.2 支持細(xì)胞采集與細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

采集初生期(3日齡,n=3)和性成熟期(13月齡,n=3)安格斯牛新鮮的睪丸組織(采自于陜西秦寶牧業(yè)有限公司)及其小腸、肝、腎臟、肌肉、心臟、脂肪、肺等組織,用無菌的剪刀剪下組織放到做好標(biāo)記相應(yīng)的無菌凍存管中?？焖僦糜谝旱?運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存。試驗(yàn)所用牛睪丸原代支持細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室分離純化。提交bta-miR-101成熟序列UACAGUACUGUGAUAACUGAA于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成miR-101 mimics、miR-101 mimics NC、miR-101 inhibitor、miR-101 inhibitor NC。SC培養(yǎng)于DMEM/F12培養(yǎng)基中,補(bǔ)充10%胎牛血清,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃、5% CO2的條件培養(yǎng)。將miR-101 mimics、miR-101 mimics NC、miR-101 inhibitor、miR-101 inhibitor NC(序列見表1)分別轉(zhuǎn)染至SC中,每組3個重復(fù),細(xì)胞轉(zhuǎn)染根據(jù)制造商說明書:5 μL miR-101 mimics/NC、inhibitor/NC(100 nmol·L-1)或EndoFectinTMMax轉(zhuǎn)染試劑用Opti-DMEM分別稀釋至150 μL,室溫靜置5 min。將稀釋的miR-101 mimics/NC或inhibitor/NC溶液以及EndoFectinTMMax溶液輕柔混合,室溫靜置20 min,向6孔板中逐滴添加RNA-EndoFectinTM復(fù)合物,在CO2培養(yǎng)箱中37 ℃孵育24～48 h。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3 bta-miR-101的生物信息學(xué)分析

通過NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)及miRBase(http://www.mirbase.org/)數(shù)據(jù)庫查找各物種miR-101的成熟序列。利用在線工具TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)、miRDB(http://www.mirdb.org/index.html)、miRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/.)和miRTarBase(http://mirtarbase.cuhk.edu.cn/php/index.php)分別對miR-101進(jìn)行靶基因預(yù)測,將數(shù)據(jù)進(jìn)行分析整理,利用在線工具KOBAS 3.0(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3/?t=1)對靶基因進(jìn)行Gene Ontology(GO)和KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)分析。

1.4 CCK-8檢測

利用CCK-8檢測細(xì)胞活性,將SC培養(yǎng)于96孔板中并進(jìn)行轉(zhuǎn)染(1×104個·孔-1),轉(zhuǎn)染后置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,設(shè)置6個重復(fù)。每孔加入10 μL的CCK-8試劑,置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h。隨后使用酶標(biāo)儀檢測混合物在450 nm處的吸光度,計(jì)算細(xì)胞增殖活力。

1.5 RT-qPCR檢測基因表達(dá)

利用RNAiso試劑處理SC并從中提取總RNA,使用Nanodrop1000測定RNA的純度和濃度。使用去基因組反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa,大連)在無RNA酶的條件下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)DiNing公司的2×Fast qPCR Master Mixture(Green)試劑盒進(jìn)行PCR檢測,反應(yīng)體系為:2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 5 μL,Forward Primer 0.2 μL,Reverse Primer 0.2 μL,cDNA 1.0 μL,ddH2O 3.6 μL。反應(yīng)條件:預(yù)變性:95 ℃ 30 s;40個循環(huán):95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s;熔解曲線:95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s。相對表達(dá)量計(jì)算方法為2-ΔΔCT,其中分別以U6和β-actin做內(nèi)參。RT-qPCR均為4個重復(fù),所用引物序列見表1。

1.6 Western Blotting檢測蛋白水平

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后36 h,利用全蛋白提取試劑盒(索萊寶,北京)提取細(xì)胞總蛋白。利用12% SDS PAGE凝膠將總蛋白提取液進(jìn)行分離,并印跡在硝化纖維素膜上。將膜用5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉2 h,結(jié)束后將膜與一抗4 ℃過夜孵育,隨后二抗孵育2 h,將膜置于顯色板并滴上ECL顯色液(索萊寶,北京),利用ChemiDoc XRS+system(Bio-Rad,Hercules,USA)成像儀顯影。Image J軟件分析蛋白灰度。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果通過數(shù)據(jù)分析軟件GraphPad Prism 9.0做柱狀圖分析。結(jié)果表示方式為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)”,每個試驗(yàn)至少設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。結(jié)果采用SPSS 19.0(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)進(jìn)行分析,對于兩組結(jié)果的分析,使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析試驗(yàn)結(jié)果的顯著性;對于兩組以上結(jié)果的比較,使用單因素方差分析Turkey檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析,*表示P<0.05即差異顯著,**表示P<0.01即差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 miR-101生物信息學(xué)分析

在NCBI和miRBases數(shù)據(jù)庫中查找miR-101的種子序列為GUACUGU,發(fā)現(xiàn)miR-101的成熟序列在哺乳動物中具有高度的保守性(圖1A)。利用4種在線軟件TargetScan、miRDB、miRWalk和miRTarBase分別預(yù)測到896、1 063、2 096、357個miR-101的靶基因,并使用Venny2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)對預(yù)測結(jié)果進(jìn)行交互繪制,共篩選出26個共同靶基因,如圖1B。對共同靶基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析,結(jié)果顯示這些靶基因主要富集在核質(zhì)、蛋白質(zhì)結(jié)合、JAK-STAT的受體信號通路上(圖1C),這些信號通路與細(xì)胞分化、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等生物過程有著密切聯(lián)系。

A.不同物種miR-101成熟序列;B.miRNA預(yù)測靶基因的韋恩圖;C.GO和KEGG富集分析A.Mature sequences of miR-101 in different species;B. Venn diagram of predicted target genes of miRNA;C. GO and KEGG enrichment analysis

2.2 bta-miR-101在牛不同時期不同組織中的表達(dá)分析及轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證

為了研究miR-101在安格斯牛不同時期各種組織(心、肝、肺、腎、小腸、肌肉和睪丸)中的表達(dá)特征,提取了各組織中的RNA,利用RT-qPCR檢測bta-miR-101在各組織中的表達(dá)量,分析數(shù)據(jù)顯示,miR-101主要在腎臟組織中表達(dá)量較高(圖2A、2B)。在睪丸組織中,miR-101在初生期的表達(dá)量顯著高于性成熟期(P<0.01),與前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致[16],說明miR-101在牛睪丸組織中的表達(dá)具有階段特異性(圖2C)。將bta-miR-101的模擬物和抑制物轉(zhuǎn)染至牛未成熟睪丸支持細(xì)胞中,利用RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染后miR-101的表達(dá)量。結(jié)果顯示,與NC組相比較,用miR-101 mimics處理細(xì)胞后miR-101的表達(dá)量顯著上升(P<0.01),用miR-101 inhibitor處理細(xì)胞后miR-101表達(dá)量顯著下降(P<0.05),說明具有較高的轉(zhuǎn)染效率,可用于后續(xù)試驗(yàn)(圖2D)。

A.bta-miR-101在牛初生期不同組織中的相對表達(dá)水平;B. bta-miR-101在牛性成熟期不同組織中的相對表達(dá)水平;C. bta-miR-101在犢牛和成年牛睪丸組織中的相對表達(dá)水平;D. bta-miR-101模擬物與抑制物轉(zhuǎn)染效率檢測。*.P<0.05;**.P<0.01;ns.P>0.05,下同A.The relative expression levels of bta-miR-101 in different tissues of neonatal cattle;B. The relative expression levels of bta-miR-101 in different tissues of adult cattle;C. Relative expression levels of bta-miR-101 in testicular tissue in calves and adult cattle;D. Transfection efficiency detection of bta-miR-101 mimics and inhibitor. *.P<0.05; **.P<0.01;ns.P>0.05,the same as below

2.3 bta-miR-101對SC增殖的影響

為探究bta-miR-101對SC增殖的影響,提取轉(zhuǎn)染了mimics NC、miR-101 mimics和inhibitor NC、miR-101 inhibitor的牛睪丸支持細(xì)胞的總RNA以及蛋白質(zhì),利用RT-qPCR檢測與增殖相關(guān)基因的表達(dá)量,利用Western Blotting試驗(yàn)檢測增殖相關(guān)基因蛋白水平的表達(dá)量。對結(jié)果進(jìn)行分析顯示,在mRNA水平,miR-101 mimics可以顯著增加增殖標(biāo)記基因PCNA和CyclinD1的表達(dá)量,并顯著抑制p21的表達(dá)量(圖3A,P<0.05),而miR-101 inhibitor則可以顯著抑制CDK2、PCNA、CyclinD1基因的表達(dá)并顯著促進(jìn)p21基因的表達(dá)(圖3B,P<0.05)。在蛋白水平,miR-101 mimics極顯著增加CDK2、PCNA的表達(dá)(P<0.01),而miR-101 inhibitor則降低CDK2、PCNA蛋白表達(dá)水平(圖3 D,3E,3F)。采用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖情況,結(jié)果分析顯示,過表達(dá)miR-101可以顯著升高支持細(xì)胞的增殖系數(shù)(P<0.05),而抑制miR-101的表達(dá)可以極顯著降低細(xì)胞增殖系數(shù)(圖3C,P<0.01)。綜上所述,bta-miR-101可以促進(jìn)牛未成熟支持細(xì)胞的增殖。

2.4 bta-miR-101對SC凋亡的影響

為進(jìn)一步研究bta-miR-101對牛睪丸支持細(xì)胞凋亡的影響,同樣利用RT-qPCR檢測與凋亡相關(guān)基因的表達(dá)量。試驗(yàn)結(jié)果顯示,與NC組相比,miR-101 mimics可以顯著抑制凋亡標(biāo)志基因Caspase3、Caspase9并顯著提高B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl2)的表達(dá),而miR-101 inhibitor則與之相反(圖4A,4B,P<0.05)。Western Blotting試驗(yàn)結(jié)果顯示過表達(dá)miR-101可以極顯著抑制Caspase9蛋白水平的表達(dá)量,而干擾miR-101可以促進(jìn)Caspase9在蛋白水平的表達(dá)(圖4C,4 D,P<0.01)。以上結(jié)果說明bta-miR-101對牛睪丸支持細(xì)胞的凋亡具有抑制作用。

2.5 bta-miR-101對SC分泌的影響

合成并分泌可以調(diào)節(jié)精原細(xì)胞自我更新與分化的必須生長因子是睪丸支持細(xì)胞的重要功能之一。為了研究bta-miR-101對睪丸支持細(xì)胞分泌功能的影響,利用RT-qPCR檢測了與細(xì)胞分泌相關(guān)的標(biāo)志基因的表達(dá)量,分析結(jié)果顯示過表達(dá)miR-101可以顯著促進(jìn)GDNF、BMP4基因的表達(dá),干擾miR-101則可以極顯著抑制以上基因的表達(dá)(圖5A,5B,P<0.05)。利用Western Blotting檢測由睪丸支持細(xì)胞合成并分泌的雄激素結(jié)合蛋白(ABP)的表達(dá),結(jié)果顯示過表達(dá)或干擾miR-101對ABP的表達(dá)并無明顯作用(圖5C,5 D),說明bta-miR-101對睪丸支持細(xì)胞分泌標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)錄具有一定的促進(jìn)作用,但對雄激素結(jié)合蛋白的分泌無顯著影響。

3 討 論

睪丸支持細(xì)胞是唯一與生殖細(xì)胞各階段直接接觸的體細(xì)胞,是微環(huán)境的組成部分,具有多種生物學(xué)功能,主要通過調(diào)節(jié)生殖細(xì)胞生理和營養(yǎng)支持來調(diào)節(jié)精子的發(fā)生。通過對初生期(3日齡)和性成熟期(13月齡)安格斯牛的睪丸組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,鑒定出在這兩個時期差異表達(dá)的miR-101,并且與初生期安格斯牛睪丸組織中miR-101的表達(dá)量相比,性成熟期miR-101的表達(dá)量顯著下降,說明miR-101與牛睪丸組織的發(fā)育密切相關(guān)。本研究對初生期和性成熟期的安格斯牛構(gòu)建了組織表達(dá)譜,對轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證,分析結(jié)果表明miR-101在牛初生期睪丸組織中的表達(dá)量處于較高的水平,在性成熟后顯著下調(diào)。除此之外還對miR-101的靶基因進(jìn)行了預(yù)測以及GO和KEGG富集分析,結(jié)果顯示這些靶基因主要富集在核質(zhì)、蛋白質(zhì)結(jié)合、JAK-STAT的受體信號通路上。這些信號通路與細(xì)胞分化、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等生物過程有著密切聯(lián)系。因此,本試驗(yàn)針對miR-101對牛睪丸支持細(xì)胞增殖、凋亡和分泌的影響進(jìn)行了探究。

雄性動物中,在青春期前,睪丸支持細(xì)胞會分泌一種可以分解視黃酸的酶來抑制精原干細(xì)胞分化成為精子,從青春期開始,睪丸支持細(xì)胞便不再增殖發(fā)育[25],而是通過旁分泌的方式分泌調(diào)節(jié)因子調(diào)控精子的發(fā)生過程[26]。支持細(xì)胞的數(shù)量對可以分化成精子的生殖細(xì)胞有著決定作用,在一定程度上,青春期前形成的支持細(xì)胞數(shù)量與后期所能生成精子的數(shù)量成正比[27-28]。本研究結(jié)果顯示,miR-101對牛睪丸未成熟支持細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用,對其凋亡具有抑制作用。過表達(dá)或干擾miR-101會對與細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)造成顯著性影響(P<0.05)。在大多數(shù)真核生物中,細(xì)胞周期是一個受到多種基因調(diào)控的復(fù)雜動態(tài)過程,包含了多個協(xié)同事件[29-30]。其中有兩個最為重要的階段,即G1/S期和G2/M期,這兩個階段細(xì)胞內(nèi)分子水平的變化活躍而復(fù)雜,非常容易受到環(huán)境的影響[31],而G1/S這一轉(zhuǎn)化期受到CDK2、PCNA、CyclinD1、p21等基因的密切調(diào)控[32-33],說明miR-101主要通過影響與細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)來促進(jìn)未成熟支持細(xì)胞的增殖。細(xì)胞凋亡是受到Bcl2家族、Caspase家族、癌基因與抑癌基因等多基因嚴(yán)格控制的過程。本研究結(jié)果顯示,miR-101可同時作用于Bcl2、Bax、Caspase9、Caspase3基因,引起其表達(dá)量發(fā)生變化,其中Caspase和Bcl2家族介導(dǎo)的兩個關(guān)于細(xì)胞凋亡的重要信號通路分別是死亡受體介導(dǎo)的外在信號通路與線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)內(nèi)在信號通路[34]。因此miR-101可能綜合作用于兩種凋亡途徑來調(diào)控牛未成熟睪丸支持細(xì)胞的凋亡。高振[35]研究發(fā)現(xiàn),miR-432可能通過下調(diào)其靶基因REM1的表達(dá),從而促進(jìn)牛睪丸支持細(xì)胞的增殖和分泌功能,抑制其凋亡。經(jīng)統(tǒng)計(jì)研究發(fā)現(xiàn),miR-10b[36]、miR-3584-5p[37]、miR-1285[38]、miR-762[39]、miR-196a[40]、miR-133b[41]和miR-301b-3p[37]等可以促進(jìn)支持細(xì)胞的增殖而抑制其凋亡,與本研究結(jié)果一致。綜上所述,miR-101在牛初生期高表達(dá)并促進(jìn)牛未成熟睪丸支持細(xì)胞的增殖,抑制其凋亡,與睪丸支持細(xì)胞的發(fā)育規(guī)律相吻合,進(jìn)一步印證了miR-101對睪丸支持細(xì)胞增殖、凋亡及分泌的調(diào)控作用。關(guān)于miR-101具體如何調(diào)控未成熟支持細(xì)胞增殖、凋亡、分泌等過程的途徑還需進(jìn)一步的研究。

值得注意的是,目前關(guān)于miR-101的研究大部分集中于腫瘤細(xì)胞上,被認(rèn)為是一種腫瘤抑制因子,已經(jīng)被證實(shí)與多種癌癥的發(fā)生有著重要聯(lián)系,由此也說明miR-101在細(xì)胞的增殖、凋亡過程中確實(shí)發(fā)揮著重要作用[42-43]。在腫瘤細(xì)胞中,多數(shù)研究表明miR-101對腫瘤細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用。Zhang等[44]研究了miR-101對骨肉瘤的影響,發(fā)現(xiàn)其通過下調(diào)靶基因BCL6來抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖。Han等[45]發(fā)現(xiàn),miR-101可以通過抑制IDH2的表達(dá)來升高α-KG濃度,并通過促進(jìn)HIF1α羥基化降解下調(diào)其表達(dá),從而抑制缺氧條件下的Warburg效應(yīng)來減弱肺癌細(xì)胞的增殖。而本研究的結(jié)果顯示,miR-101對未成熟睪丸支持細(xì)胞具有促進(jìn)增殖的作用,與其在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中的研究結(jié)果有所不同。Qu等[46]研究了miR-101對山羊毛囊干細(xì)胞增殖與凋亡的影響,結(jié)果顯示過表達(dá)miR-101可以顯著降低毛囊干細(xì)胞的凋亡并促進(jìn)其增殖(P<0.01),這與本研究結(jié)果相一致。因此推測,造成這種很差異的原因可能是由于惡性腫瘤細(xì)胞相比正常細(xì)胞其分化程度、生長速度、生長方式等都已經(jīng)發(fā)生了異變,亦或可能是由于物種或組織之間的差異引起miR-101對兩類細(xì)胞增殖、凋亡及分泌的影響有所不同,其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明,miR-101上調(diào)增殖相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)牛未成熟支持細(xì)胞的增殖,并作用于兩條細(xì)胞凋亡的信號通路來抑制牛未成熟睪丸支持細(xì)胞的凋亡,對雄激素結(jié)合蛋白的分泌無顯著影響。表明miR-101在牛未成熟睪丸支持細(xì)胞的發(fā)育中具有重要的調(diào)控作用。