山羊皮膚組織miRNA測序與miR-129-5p調(diào)控黑色素生成的功能研究

肖 敏,趙 威,孫 武,2,娜日蘇,3,趙 樂,劉陶祿,張繼攀*,趙永聚*

(1.西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,草食動(dòng)物科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶市牧草與草食家畜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶400715;2.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,西寧 810016;3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,呼和浩特 010018)

動(dòng)物皮毛顏色是畜牧生產(chǎn)中的重要性狀,更是育種工作中品種鑒定、品系劃定的關(guān)鍵依據(jù)[1-2],因此探究動(dòng)物毛色形成機(jī)制意義重大。本質(zhì)上,動(dòng)物膚色和毛色與皮膚中黑色素細(xì)胞(melanin cell,MC)數(shù)量和黑色素種類(真黑色素和褐黑色素)密切相關(guān)[3]。黑色素細(xì)胞起源于神經(jīng)嵴細(xì)胞[4],由背外側(cè)路徑遷移至外胚層定植,并增殖分化為成熟黑色素細(xì)胞。黑色素細(xì)胞中黑素小體合成的色素顆粒由胞吐等方式運(yùn)輸至周圍細(xì)胞[5],發(fā)揮吸收散射紫外線和清除自由基等作用[6-7]。黑色素生成涉及復(fù)雜的調(diào)控過程,受多個(gè)基因、轉(zhuǎn)錄因子、非編碼RNA等的影響[8-9]。大量研究表明,酪蛋白酶(tyrosinase,TYR)、酪蛋白酶相關(guān)蛋白酶1(tyrosinase related protein 1,TYRP1)、酪蛋白酶相關(guān)蛋 白酶2(tyrosinase related protein 2,TYRP2)、小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(microphthalmia-associated transcription factor,MITF)等基因在黑色素生成的過程中發(fā)揮了重要作用[10]。其中TYR編碼的蛋白是黑色素合成過程的限速酶,可將機(jī)體內(nèi)酪氨酸氧化形成L-二羥基苯丙氨酸(L-dihydroxyphenylalanine,L-DOPA),TYRP1、TYRP2則與其協(xié)同作用,共同參與黑色素的生成[11-12]。MITF是調(diào)控哺乳動(dòng)物黑色素沉積的重要轉(zhuǎn)錄因子,與黑色素細(xì)胞的發(fā)育、存活、遷移、增殖及分化有關(guān),是多條黑色素合成相關(guān)信號(hào)通路的共同作用位點(diǎn)[13-14]。MITF基因參與黑色素合成主要的信號(hào)通路有Wnt/β-catenin、EDN-1/EDNRB、SCF/c-kit、NO等[15]。

近年來,越來越多的miRNA被證實(shí)參與調(diào)控哺乳動(dòng)物毛色的形成。Tian等[16]通過測序篩選鑒定出了48個(gè)在棕色和白色羊駝皮膚組織中差異表達(dá)的miRNAs,Wu等[17]對被毛顏色為白色和黑色的山羊毛囊組織進(jìn)行miRNA測序,篩選鑒定出6個(gè)差異表達(dá)miRNAs,其中5個(gè)在黑毛毛囊中表達(dá)上調(diào),暗示這些差異miRNA可能參與了毛色或膚色的調(diào)控。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),miR-125b-5p能夠通過靶向MITF下調(diào)黑色素的生成[18]。此外,Wu等[19]在小鼠皮膚中注射pre-miR-434-5p后發(fā)現(xiàn)皮膚中TYR表達(dá)量顯著下調(diào),黑色素合成過程被抑制,導(dǎo)致小鼠毛發(fā)顏色變白。Dong等[20]研究也證實(shí),miR-137過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致小鼠毛色由黑變黃。

本試驗(yàn)通過對膚色有差異的酉州烏羊(Youzhou dark goat,YZDG)和川東白山羊(Chuandong white goat,CDWG),毛色有差異的大足黑山羊(Dazu black goat,DBG)和成年內(nèi)蒙古絨山羊(Inner Mongolia cashmere goat,IMCG)分別進(jìn)行小RNA測序,取兩組測序差異miRNA交集,篩選黑色素生產(chǎn)的核心miRNA。并以B16-F10細(xì)胞為模型,以共同差異miR-129-5p為對象,通過轉(zhuǎn)染其模擬物(mimics)、抑制劑(inhibitor)及相應(yīng)對照組(mimics NC、inhibitor NC)進(jìn)一步探究miRNA在細(xì)胞黑色素生成中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

蘇木素-伊紅染色試劑盒(Sigma,中國),FBS(Thermo,美國),RPMI 1640(Thermo,美國),Lipofectamine 2000(Thermo,美國),Trizol(TaKaRa,日本),PrimeScriptTM RT Master Mix(TaKaRa,日本),MiR-XTM miRNA FirstStrand Synthesis(TaKaRa,日本),TB Green Premix Ex TaqII(TaKaRa,日本),RIPA蛋白裂解液(康為世紀(jì),中國),MITF、TYR、TYRP1一抗(Bioss ANTIBODIES,中國),辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(碧云天,中國),黑色素標(biāo)準(zhǔn)品(Aladdin,中國)。

1.2 樣本采集

選擇相同飼養(yǎng)環(huán)境下健康、純種酉州烏羊(n=3)和川東白山羊(n=3)妊娠母羊,在其妊娠期第100天進(jìn)行剖腹產(chǎn)手術(shù),采集胎兒肩胛骨后緣3～5 cm處皮膚組織。選擇相同飼養(yǎng)環(huán)境下2～3周歲的大足黑山羊(n=3)和內(nèi)蒙古絨山羊(n=3),手術(shù)采集山羊左側(cè)肩胛骨后緣5～10 cm處皮膚樣本。將采集的每一份皮膚組織剪成兩份,一份經(jīng)液氮保存后用于小RNA測序,一份保存在含4%多聚甲醛離心管中用于組織切片試驗(yàn)。

細(xì)胞試驗(yàn)部分所用的B16-F10皮膚黑色素瘤細(xì)胞系來自重慶市畜牧科學(xué)院。

1.3 皮膚切片制作

4%多聚甲醛固定的皮膚樣品經(jīng)梯度濃度酒精(75%、85%、90%、95%和100%)脫水、二甲苯透明后進(jìn)行石蠟包埋。利用切片機(jī)進(jìn)行平行于皮膚表面的橫切和垂直于皮膚表面的縱切,切片厚度為7 μm。切片用常規(guī)蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,中性樹膠封片,于倒置顯微鏡下觀察組織學(xué)形態(tài)并捕獲組織學(xué)圖像。

1.4 小RNA測序及分析

取液氮凍存的皮膚樣本,研磨后使用Trizol提取總RNA。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整度及污染,Nanodrop檢測RNA濃度及純度。檢測合格的RNA樣品經(jīng)打斷、末端修復(fù)、加A尾、接頭和PCR富集等過程構(gòu)建文庫后,于Illumina NovaSeq 6000測序平臺(tái)進(jìn)行測序。對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制后,將對比上參考基因組的reads序列和數(shù)據(jù)庫miRBase(v22)中成熟miRNA序列進(jìn)行比對,并利用miRDeep2軟件進(jìn)行新miRNA的預(yù)測。使用FPKM[21]法對表達(dá)量進(jìn)行歸一化,以獲得miRNA相對表達(dá)量?；诤Y選條件P-value<0.05、FC≥1.5或FC≤0.66獲得差異miRNAs。利用Venn分析,獲得兩個(gè)測序數(shù)據(jù)集的差異miRNA交集,以篩選關(guān)鍵miRNAs。

1.5 B16-F10細(xì)胞復(fù)蘇與轉(zhuǎn)染

凍存的B16-F10細(xì)胞37 ℃水浴復(fù)蘇,1 500 r·min-1離心5 min,棄去凍存液。使用預(yù)熱37 ℃的PBS清洗3次,10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸,細(xì)胞接種到培養(yǎng)基及六孔板中,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每48 h換液。六孔板中培養(yǎng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理,轉(zhuǎn)染的模擬物及抑制劑終濃度為33 nmol·L-1,初次更換培養(yǎng)基時(shí)間記為0 h,分別繼續(xù)培養(yǎng)18、27和36 h后,用qPCR檢測轉(zhuǎn)染效率,以尋找最高轉(zhuǎn)染效率的時(shí)間。

1.6 總RNA提取、第一鏈合成及引物設(shè)計(jì)

使用Trizol提取細(xì)胞總RNA,使用核酸測定儀檢測RNA濃度和OD260 nm/OD280 nm值,對RNA完整性進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測,用無酶水調(diào)整RNA濃度至500 ng·μL-1,使用相應(yīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行mRNA及miRNA反轉(zhuǎn)錄。利用NCBI和Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)β-actin、TYR、MITF、TYRP1和miR-129-5p引物序列,交由華大公司合成,U6及miRNAs下游通用引物均來自于miRNA反轉(zhuǎn)試劑盒。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 qPCR檢測mRNA及miRNA表達(dá)

以相應(yīng)cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng),反應(yīng)總體系為10 μL:包含TB Green Premix Ex TaqII 5 μL,cDNA 1 μL,上、下游引物各0.4 μL和ddH2O 3.2 μL。在Biorad CFX96實(shí)時(shí)熒光定量系統(tǒng)中執(zhí)行熱循環(huán)反應(yīng):95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 5 s,59 ℃退火30 s,共循環(huán)40次?；诙肯到y(tǒng)自動(dòng)生成的閾值線,獲得Ct值?；趨⒖蓟?應(yīng)用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA及miRNA的相對表達(dá)量。依據(jù)qPCR產(chǎn)物的熔解曲線判斷循環(huán)反應(yīng)的特異性。

1.8 Western blotting檢測黑色素相關(guān)蛋白

轉(zhuǎn)染處理的B16-F10細(xì)胞,使用蛋白酶混合物及RIPA裂解液提取總蛋白。蛋白樣品通過10% SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。使用5%脫脂奶粉封閉1 h,TBST搖晃清洗3次(5 min·次-1),一抗(MITF、TYR、TYRP1)按比例稀釋后常溫孵育1 h,4 ℃孵育過夜。再次使用TBST清洗PVDF膜3次后,二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L))孵育2 h,孵育結(jié)束后TBST清洗二抗,并進(jìn)行顯影。

1.9 黑色素含量測定

黑色素標(biāo)準(zhǔn)曲線制作:稱量黑色素標(biāo)準(zhǔn)品,用1 mol·L-1的NaOH液將其配制成2 mg·mL-1的黑色素標(biāo)準(zhǔn)液;標(biāo)準(zhǔn)液經(jīng)梯度稀釋后,獲得不同濃度(20、40、60、80、100 μg·mL-1)黑色素溶液;在酶標(biāo)儀上測定各吸光值,以制作成標(biāo)準(zhǔn)曲線。在待測的黑色素細(xì)胞沉淀中加入適量1 mol·L-1NaOH于37 ℃金屬浴中孵育1 h充分裂解,然后測定其在A500處的吸光值,用黑色素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黑色素含量,每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究結(jié)果用SPSS 25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA),用LSD法進(jìn)行多重比較。試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié) 果

2.1 黑色素含量在山羊皮膚組織中差異表達(dá)

觀察發(fā)現(xiàn),兩個(gè)山羊品種YZDG和CDWG的被毛以白色為主(圖1A-B),但YZDG胎羊全身皮膚為烏色(圖1C)、CDWG膚色為白色(圖1D)。皮膚切片染色結(jié)果顯示,YZDG胎羊皮膚中可明顯觀察到黑色素顆粒沉積,而CDWG皮膚中無明顯黑色素顆粒存在(圖1E-F)。

A、B.YZDG及CDWG品種照;C、D.100日齡YZDG及CDWG胎羊;E、F.100日齡YZDG及CDWG胎羊皮膚HE染色切片(400×)A, B. The representative breed photographs of YZDG and CDWG; C, D. 100-day-old YZDG and CDWG fetal; E, F. HE-stained sections of skin from 100-day-old YZDG and CDWG fetal(400×)

在另外一組對比試驗(yàn)中,DBG黑色被毛、白色皮膚(圖2A、C),而IMCG白色被毛、白色皮膚(圖2B、D)。皮膚HE染色結(jié)果也顯示,DBG及IMCG表皮中皆無明顯黑色素顆粒沉積;但在DBG毛囊組織的毛球、毛干及外根鞘等部位沉積量較大,與其黑色被毛的表型一致,IMCG毛囊中幾乎沒有黑色素沉積(圖2E-F)。

2.2 小RNA測序及差異miRNA篩選

本研究通過對具有膚色差異的YZDG、CDWG,和具有毛色差異的DBG、IMCG分別進(jìn)行小RNA測序。結(jié)果顯示,在烏皮和白皮胎羊皮膚樣本中,鑒定到62個(gè)差異表達(dá)miRNAs,其中31個(gè)在烏皮山羊皮膚中表達(dá)上調(diào),31個(gè)在白皮山羊中表達(dá)下調(diào),表2為部分差異miRNAs。在黑色被毛及白色被毛山羊皮膚測序中,篩選到38個(gè)差異miRNAs,其中10個(gè)在黑色被毛山羊中上調(diào),28個(gè)在白色被毛山羊皮膚中下調(diào),表3為部分差異表達(dá)miRNAs。對兩組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行Venn分析,發(fā)現(xiàn)miR-129-5p在烏色皮膚及黑色被毛山羊皮膚組織中均高表達(dá)(圖3)。故進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞試驗(yàn),以驗(yàn)證miR-129-5p對黑色素生成的作用。

圖3 兩組小RNA測序的共同差異miRNAsFig.3 The overlaping differential miRNAs between two small RNA sequencing data

表2 酉州烏羊、川東白山羊胎兒皮膚中差異表達(dá)miRNAs

表3 大足黑山羊、內(nèi)蒙古絨山羊皮膚中差異表達(dá)miRNAs

2.3 miR-129-5p對黑色素生成的影響

為了確定miR-129-5p對黑色素生成的影響,進(jìn)行過表達(dá)和減低表達(dá)miR-129-5p,檢測黑色素含量、基因、蛋白表達(dá)量的變化情況。轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示,除轉(zhuǎn)染18 h的inhibitor組無顯著變化外,其余各轉(zhuǎn)染組都出現(xiàn)相應(yīng)過表達(dá)和減低表達(dá)情況(圖4),而在27 h miR-129-5p過表達(dá)和減低表達(dá)效果最為顯著(P<0.01),故后續(xù)試驗(yàn)均以此時(shí)間進(jìn)行。

圖4 最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間篩選Fig.4 The time screening of optimal transfection

為檢測轉(zhuǎn)染處理后黑色素生成量變化,使用堿溶法提取細(xì)胞黑色素。離心后miR-129-5p mimics組細(xì)胞沉淀呈灰黑色,顏色較其它3組深,而其它3組細(xì)胞沉淀呈灰色(圖5A),黑色素含量檢測結(jié)果也顯示miR-129-5p mimics組的黑色素含量比NC組高18.9%(P<0.05);而inhibitor組黑色素含量與其NC組無顯著差異(P>0.05)(圖5B)。

A.不同轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞沉淀;B.不同轉(zhuǎn)染組B16-F10細(xì)胞的黑色素相對含量A. Cell sedimentation in different transfection groups; B. Relative melanin content in B16-F10 cells in different transfection groups

為揭示黑色素含量變化的原因,對轉(zhuǎn)染處理后細(xì)胞黑色素生成相關(guān)基因表達(dá)情況進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖6所示,與空白對照組相比,miR-129-5p mimics、inhibitor組MITFmRNA相對表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)(圖6A),而mimics組的TYR及TYRP1 mRNA表達(dá)量相對空白對照組分別上調(diào)57.3%和16.5%(P<0.05)(圖6B、C),inhibitor組TYRmRNA表達(dá)量顯著下調(diào)38.9%(P<0.05),而TYRP1 mRNA表達(dá)量無顯著變化(P>0.05)(圖6B、C)。

A～C.不同轉(zhuǎn)染組MITF、TYR、TYRP1基因相對表達(dá)量;D～F.不同轉(zhuǎn)染組MITF、TYR、TYRP1蛋白印跡及蛋白相對表達(dá)量A-C. Relative expression of MITF, TYR, and TYRP1 genes in different transfection groups; D-F. Protein blotting and relative protein expression of MITF, TYR, and TYRP1 in different transfection groups

蛋白定量結(jié)果顯示,MITF蛋白在inhibitor組中表達(dá)量顯著下調(diào)28.4%(P<0.05),而mimics組MITF蛋白的表達(dá)量沒有顯著差異(圖6D);mimics組TYR、TYRP1蛋白相較NC組分別顯著上調(diào)49.2%及40.2%(P<0.05),inhibitor組TYR、TYRP1蛋白水平則分別下調(diào)21.1%及25.3%,差異顯著(P<0.05),兩個(gè)基因受調(diào)控情況一致(圖6E、F)。

3 討 論

皮膚中黑色素的沉積量是不同膚色和毛色形成的關(guān)鍵。大量研究指出,黑色表型的綿羊[22]、豬[23]、獺兔以及牦牛[24]等動(dòng)物皮膚中黑色素沉積量高于白色表型個(gè)體。本研究同樣發(fā)現(xiàn),黑色素顆粒在烏皮山羊的表皮及黑毛山羊的毛球、毛干、外根鞘等部位大量沉積,但在白皮、白毛山羊的表皮及毛囊組織中沉積量很少,表明黑色素含量與膚色及毛色的深淺呈正相關(guān)。而黑色素的沉積不僅涉及調(diào)控黑色素細(xì)胞的成熟、增殖、遷移和黑色素產(chǎn)生的多個(gè)基因及信號(hào)通路,還受到miRNAs相互作用形成的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)影響[25]。本研究通過分別對膚色及毛色有差異的4個(gè)品種山羊進(jìn)行小RNA測序,發(fā)現(xiàn)miR-129-5p是兩組測序共同差異miRNA,且在黑色表型個(gè)體中高表達(dá)。已有研究顯示,miR-129-5p廣泛參與癌細(xì)胞抑制、炎癥反應(yīng)、血管再生和神經(jīng)發(fā)育等生物學(xué)過程,已知的靶基因包括高遷移率族蛋白B1(High mobility group protein B1,HMGB1)[26]、同源框C13(Homeobox C13,HOXC13)[27]、轉(zhuǎn)錄因子4(Transcription factor 4,TCF4)[28]等,然而在調(diào)控黑色素合成方面暫無具體報(bào)道。故本研究通過細(xì)胞試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-129-5p對黑色素生成的影響。結(jié)果顯示,過表達(dá)miR-129-5p會(huì)顯著增加細(xì)胞黑色素沉積量,會(huì)顯著上調(diào)TYR、TYRP1等黑色素合成相關(guān)基因的mRNA和蛋白表達(dá),對黑色素生成有促進(jìn)作用,而抑制miR-129-5p則顯著下調(diào)TYRmRNA及蛋白表達(dá),而TYRP1 mRNA表達(dá)水平無顯著差異,僅蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。前人研究證明,TYR基因家族的3個(gè)成員TYR、TYRP1、TYRP2都對黑色素的合成有影響[29-30],并且在動(dòng)物表皮和毛囊中大量表達(dá)[31]。Zhao等[32]研究也發(fā)現(xiàn),在小鼠黑色素細(xì)胞中過表達(dá)及抑制miR-27a-3p,對靶基因WNT3A mRNA水平無顯著影響,但對WNT3A蛋白表達(dá)有顯著調(diào)節(jié)作用,且影響細(xì)胞黑色素生成。張利環(huán)等[33]研究同樣證明,miR-96-5p僅調(diào)節(jié)MITF蛋白表達(dá),但對細(xì)胞黑色素生成有顯著影響,說明miR-129-5p確實(shí)可通過調(diào)節(jié)TYR與TYRP1基因或蛋白的表達(dá)影響黑色素的沉積。但miR-129-5p是以怎樣的形式促進(jìn)黑色素的沉積,仍需進(jìn)一步探索。

經(jīng)典的分子生物學(xué)理論認(rèn)為,miRNA主要是通過與胞質(zhì)中靶基因mRNA的3′UTR的5～8個(gè)堿基進(jìn)行配對,進(jìn)而抑制靶基因表達(dá),與靶基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。miR-101a-3p和miR-144a-3p等可通過靶向負(fù)調(diào)控MITF基因下調(diào)羊駝皮膚黑色素沉積[34],但本試驗(yàn)中miR-129-5p表達(dá)與TYR、TYRP1等黑色素相關(guān)基因表達(dá)及黑色素沉積量呈正相關(guān)。因此推測,miR-129-5p有兩種調(diào)節(jié)黑色素沉積的可能機(jī)制,其一是miR-129-5p能通過靶向抑制黑色素生成通路的上游的某個(gè)因子,進(jìn)而促進(jìn)TYR及TYRP1的表達(dá)。Wang等[35]的研究即證明,miR-21a-5p可通過抑制SRY-box轉(zhuǎn)錄因子5(SRY-box transcription factor 5,SOX5)基因的表達(dá),使MITF、TYR的mRNA和蛋白水平顯著上調(diào),黑色素生成增加。其二是隨著研究的深入,科研工作者發(fā)現(xiàn)miRNAs不一定是抑制基因表達(dá)。如細(xì)胞在G0期時(shí),miRNA活性將從翻譯抑制轉(zhuǎn)為翻譯激活[36],另一報(bào)道顯示,miR-10a還可以與編碼核糖體蛋白(ribosomal protein,RP)的mRNA 5′UTR區(qū)結(jié)合,增強(qiáng)其表達(dá)[37]。除此之外,還有研究表明成熟的miRNA存在于細(xì)胞核中[38],且核內(nèi)miRNAs還被報(bào)道能與靶基因啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等元件結(jié)合以促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。如miR-205被證實(shí)在前列腺癌細(xì)胞中能靶向腫瘤抑制因子白介素24(interleukin-24,IL-24)和IL-32啟動(dòng)子中的特定位點(diǎn)激活其表達(dá)[39]。miR-24-1也被發(fā)現(xiàn)與多個(gè)相鄰編碼基因的增強(qiáng)子結(jié)合轉(zhuǎn)錄出增強(qiáng)子RNAs(enhancer RNAs,eRNAs),進(jìn)而增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄[40]。miRNAs的轉(zhuǎn)錄激活作用已被大量報(bào)道,科學(xué)家推測這或許是一種待發(fā)掘的疾病治療新方法。本研究中,miR-129-5p在細(xì)胞中過表達(dá)后能顯著的提高黑色素相關(guān)基因TYR、TYRP1等mRNA和蛋白水平的表達(dá),能顯著提高細(xì)胞黑色素含量,是黑色素合成通路的重要調(diào)控因子,但其在調(diào)控過程中是否發(fā)揮黑色素合成上游基因沉默或下游基因翻譯增強(qiáng)、轉(zhuǎn)錄激活等作用還需更進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明,miR-129-5p在烏皮山羊及黑色被毛山羊中高表達(dá),可通過調(diào)控TYR、TYRP1等關(guān)鍵基因的表達(dá)進(jìn)而影響黑色素的生成,是山羊膚色和毛色形成過程中的重要調(diào)節(jié)因子。