NOS2基因DNA甲基化編輯調(diào)節(jié)NO濃度影響肌肉發(fā)育通路基因的表達(dá)

申 琦,王 凱,趙真堅(jiān),陳 棟,余 楊,崔晟頔,王俊戈,陳子旸,吳平先,唐國慶*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽生物組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 611130;2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 611130;3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 豬禽種業(yè)全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 611130;4.新希望六和股份有限公司,北京 100102;5.國家生豬技術(shù)創(chuàng)新中心,重慶 402460)

DNA甲基化由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(Dnmts)家族催化,這些甲基轉(zhuǎn)移酶將甲基從S-腺苷甲硫氨酸(SAM)轉(zhuǎn)移到胞嘧啶殘基的第五個(gè)碳上,形成5 mC[1]。DNA甲基化是一種被廣泛研究的表觀遺傳修飾方式,與組蛋白修飾等方式一起,在沉默逆轉(zhuǎn)錄病毒元件[2],調(diào)節(jié)組織特異性基因表達(dá),基因組印跡和X染色體失活等過程中至關(guān)重要[3]。曾有研究表明,DNA甲基化會影響骨骼肌從而影響運(yùn)動[4],肥胖和糖尿病也與表觀遺傳學(xué)緊密相關(guān)[5-8]。DNA甲基化在哺乳動物發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用,哺乳動物基因組通常高度甲基化,在人類胚胎干細(xì)胞中,DNA甲基化會在約80%的CpG中發(fā)生,其余未甲基化的CpG殘基富集在位于基因啟動子的CpG島(CGI)中[9]。近些年來,表觀遺傳學(xué)和甲基化測序技術(shù)的發(fā)展為畜禽重要經(jīng)濟(jì)性狀研究提供基礎(chǔ)[10-12]。

一氧化氮(NO)由NOS亞型產(chǎn)生,這些亞型包含NOS1、NOS2和NOS3[13]。有研究表明,NOS2可治療肌肉萎縮綜合征,iNOS將L-精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸,在此過程中釋放NO[14-16]。NOS也在血管疾病、卵巢功能[17]和糖尿病[18-19]中具有重要調(diào)控作用[20]。NO 是一種信使分子,在調(diào)節(jié)組織、細(xì)胞和器官的各種生物過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[21-23]。NO 能與 OxyMb 反應(yīng)生成 MetMb 和硝酸鹽[24],肌紅蛋白存在DeoMb、OxyMb和MetMb三種狀態(tài)。肌肉中三種狀態(tài)肌紅蛋白相對含量決定了肉的色澤[25]。此外,有研究表明,NO 可抑制線粒體呼吸鏈[26],而線粒體是骨骼肌MyHC纖維類型的調(diào)節(jié)因子[27]。因此,本研究發(fā)現(xiàn)NOS2 基因可能會通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi) NO 的濃度來影響肌紅蛋白和肌纖維組成,從而影響肌肉發(fā)育通路基因的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和載體

本試驗(yàn)中使用的細(xì)胞株為豬腎細(xì)胞系PK-15細(xì)胞,使用的是MEM培養(yǎng)基,添加1%NEAA、1%丙酮酸鈉和10%胎牛血清(FBS),將細(xì)胞置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng);根據(jù)Addgene #71666設(shè)計(jì)質(zhì)粒載體pdCas9-DNMT3A-EGFP(E4692),融合蛋白pCLenti-U6-gRNA1(NOS2)-gRNA2(NOS2)-CMV-mCherry(Y14117)由和元生物構(gòu)建,其中2個(gè)gRNA位于NOS2啟動子上游(表1),通過T4 DNA連接酶合成,并克隆到表達(dá)載體。

表1 所有g(shù)RNA目標(biāo)位點(diǎn)及序列

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將PK-15細(xì)胞進(jìn)行消化后,計(jì)數(shù)后將每組細(xì)胞配成1.0×105個(gè)·mL-1后,每孔鋪500 μL細(xì)胞,于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜;12～20 h后,觀察細(xì)胞的融合率達(dá)到60%～70%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染;配制質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑稀釋液,0.5 μg E4692+0.5 μg Y14117+2 μL lipo2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。各組轉(zhuǎn)染試劑混勻,常溫孵育5 min;將稀釋好的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑混合均勻,以常溫孵育20 min;在轉(zhuǎn)染前加入400 μL optiMEM 至24孔板中,然后再添加質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染混合物,約4～6 h后換成完全培養(yǎng)基;轉(zhuǎn)染48 h后,熒光顯微鏡拍照;轉(zhuǎn)染結(jié)束后,倍比稀釋法挑選3組單克隆細(xì)胞。

1.3 甲基化檢測

使用BSP(bisulfite sequencing PCR)方法對NOS2啟動子區(qū)域前500 bp范圍DNA甲基化水平進(jìn)行檢測,目標(biāo)區(qū)域序列見圖1。使用細(xì)胞DNA提取試劑盒并嚴(yán)格遵照說明書操作步驟對細(xì)胞樣本進(jìn)行DNA提取,提取后的DNA保存?zhèn)溆?用亞硫酸氫鹽對提取的DNA進(jìn)行預(yù)處理,處理過后所有尚未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶則不變;設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(表2);目的產(chǎn)物純化后進(jìn)行TA克隆;在使用酶切法鑒別陽性菌落后,挑取質(zhì)粒進(jìn)行測序;將測序得到的序列與原始序列進(jìn)行比對,并計(jì)算發(fā)生甲基化位點(diǎn)的數(shù)量及甲基化程度。

圖1 DNA甲基化編輯的目標(biāo)區(qū)域序列Fig.1 Sequences of regions targeted for DNA methylation editing

表2 甲基化檢測的引物信息

1.4 細(xì)胞增殖測定

使用CCK-8方法對細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行定量分析,具體步驟如下:細(xì)胞經(jīng)過消化作用、重懸和計(jì)數(shù)后,鋪于96孔板上,細(xì)胞貼壁后,根據(jù)分組進(jìn)行對應(yīng)處理,在每個(gè)檢測時(shí)間點(diǎn)(0、24、48和72 h),棄上清,加入CCK-8:MEM完全培養(yǎng)基=1∶9混合液100 μL于每孔中,經(jīng)過2 h后,用酶標(biāo)儀檢測450 nm OD值。

1.5 細(xì)胞RNA提取

從培養(yǎng)皿中倒掉培養(yǎng)液,然后離心,棄去細(xì)胞上清,每孔加入1 mL Trizol,然后每孔加200 μL氯仿,劇烈震蕩15 s,然后于室溫靜置15 min;在4 ℃條件下,12 000 r·min-1離心15 min;從每管中吸取上清至新1.5 mL 離心管中,在其中添加同樣體積的異丙醇,混合均勻后在4 ℃沉淀10 min;4 ℃,12 000 r·min-1離心10 min后,棄掉上清液;4 ℃預(yù)冷的75%乙醇洗滌兩遍后棄去廢液,然后在室溫干燥;先添加30～40 μL RNase-free水,等待充分溶解后,用分光光度儀測定RNA的濃度與吸光值,檢測合格后于-80 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 總RNA反轉(zhuǎn)錄

使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行總RNA反轉(zhuǎn)錄,主要步驟:1)遵照說明書進(jìn)行g(shù)DNA Eraser反應(yīng)混合液及RNA轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液的配置;2)將RNA反轉(zhuǎn)錄混合液先于42 ℃水浴中放置15 min,再于85 ℃水浴中放置5 s后立即置于冰上,獲得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA);3)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA)可立即用于qPCR檢測,或存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

引物使用Primer 5.0設(shè)計(jì),交由和元生物合成,具體引物序列如表3所示。處理組中基因的表達(dá)量表示為相對表達(dá)量(2-△△Ct),其中△△Ct=△Ct1(處理組)-△Ct2(對照組),即:當(dāng)2-△△Ct<1且P<0.05時(shí),說明處理組中基因表達(dá)量顯著下調(diào),而當(dāng)2-△△Ct>1且P<0.05時(shí),說明基因表達(dá)量顯著上調(diào)。

表3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.8 Western blot

細(xì)胞總蛋白抽提后測定蛋白濃度,然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。在電泳完成前,預(yù)先準(zhǔn)備一張PVDF膜和六張濾紙。將PVDF膜用甲醇活化5 min,再在緩沖液中平衡 15 min,隨后將轉(zhuǎn)膜用的夾子打開,將海綿、濾紙和膜組合形成海綿-濾紙-膠-膜-濾紙-海綿的結(jié)構(gòu),然后放在轉(zhuǎn)移槽中,在槽的一邊放置冰塊降溫,在300 mA轉(zhuǎn)移2 h。使用1×TBST制成5%脫脂牛奶封閉液,將膜移至封閉液中封閉1 h,接著遵照說明書配置一抗稀釋液,從封閉液中取出膜,在一抗中孵育過夜,在室溫下用TBST脫色搖床上洗10 min,反復(fù)3次,然后配置二抗稀釋液,將膜在二抗稀釋液中室溫孵育1～2 h后,于室溫下在TBST脫色搖床上洗10 min,重復(fù)3次,用發(fā)光液浸濕PVDF膜,然后放入成像儀中拍照成像。

1.9 細(xì)胞內(nèi)NO的檢測

利用一氧化氮(NO)試劑盒檢測細(xì)胞中NO的含量,并嚴(yán)格遵照產(chǎn)品使用說明書執(zhí)行,在細(xì)胞沉淀中添加500 μL PBS,混合均勻,使細(xì)胞懸浮于等滲緩沖液中;在冰水浴條件下,通過超聲波破碎儀對細(xì)胞懸液進(jìn)行超聲破碎,重復(fù)5次,取破碎好的勻漿液進(jìn)行下一步測定;根據(jù)說明書配置混合試劑(試劑一和試劑二等體積混合),混合均勻后備用;標(biāo)準(zhǔn)貯存液用雙蒸水1∶100稀釋成100 μmol·L-1的標(biāo)準(zhǔn)液, 提前計(jì)算好量后配好待用;每孔加入100 μL 的待測樣本(3重復(fù)孔)、空白對照,標(biāo)準(zhǔn)液(空白用蒸餾水,標(biāo)準(zhǔn)液為試劑一,各2個(gè)重復(fù)孔);每孔加入400 μL的混合試劑,混勻后,至37 ℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)1 h;每個(gè)測試管分別加入200 μL的試劑三和100 μL的試劑四;充分漩渦混勻30 s,室溫靜置40 min后,在3 000～4 000 r·min-1條件下離心10 min,取上清顯色;根據(jù)說明書溶解試劑五和試劑六,按照試劑五:試劑六:試劑七=2.5∶1∶1的比例配制顯色劑,每個(gè)測試管要加入600 μL顯色劑,提前計(jì)算好量后配好待用;每管分別加入500 μL上清和600 μL顯色劑,混合均勻后,在室溫下靜置10 min,并在550 nm的波長下,測定吸光度;根據(jù)公式計(jì)算NO含量:NO(μmol·L-1)= C標(biāo)準(zhǔn)×(A測定-A空白)/(A標(biāo)準(zhǔn)-A空白)。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

使用R v4.1.1軟件對本試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,每個(gè)試驗(yàn)3次重復(fù),結(jié)果表示為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”,設(shè)置檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為P=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果

在本試驗(yàn)中,通過lipo2000將載體轉(zhuǎn)染到PK-15細(xì)胞中。使用0.5 μg 的pdCas9-DNMT3A-EGFP 和0.5 μg的pCLenti-U6-gRNA1(NOS2)-gRNA2(NOS2)-CMV-mCherry 以及2 μL的lipo2000 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染結(jié)果如圖2所示(圖為100×放大結(jié)果)。

A.轉(zhuǎn)染前和轉(zhuǎn)染48 h白光組結(jié)果比較;B.轉(zhuǎn)染前和轉(zhuǎn)染48 h熒光染色結(jié)果比較A. Comparison of white light before transfection and 48 h after transfection;B. Comparison of fluorescence staining results before transfection and 48 h after transfection

轉(zhuǎn)染48 h后,利用倍比稀釋法挑選3組單克隆細(xì)胞(即處理組)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn),3組單克隆細(xì)胞結(jié)果如圖3所示(圖為100×放大結(jié)果)。

圖3 轉(zhuǎn)染后挑選3組單克隆細(xì)胞結(jié)果(100×)Fig.3 The results of monoclonal cells in 3 groups after transfection (100×)

挑選的3組單克隆細(xì)胞檢測NOS2基因啟動子前500 bp范圍的DNA甲基化水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),處理組的NOS2基因啟動子DNA甲基化水平比對照組降低,但差異不顯著(P>0.05),如圖4所示。gRNA1結(jié)合位點(diǎn)附近有2個(gè)CpG位點(diǎn),在gRNA2結(jié)合位點(diǎn)附近有2個(gè)CpG位點(diǎn)。然后比較對照組和處理組中g(shù)RNA結(jié)合位點(diǎn)附近CpG位點(diǎn)的甲基化水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),對照組的gRNA1結(jié)合位點(diǎn)的1個(gè)CpG位點(diǎn)平均甲基化為0.8,gRNA2結(jié)合位點(diǎn)的2個(gè)CpG位點(diǎn)平均甲基化為0.2,編輯過后的處理組中g(shù)RNA1結(jié)合位點(diǎn)的1個(gè)CpG位點(diǎn)平均甲基化為0.8,gRNA2結(jié)合位點(diǎn)的2個(gè)CpG位點(diǎn)平均甲基化為0.32。與對照組相比,gRNA2結(jié)合位點(diǎn)附近的CpG位點(diǎn)甲基化水平增加。

A.對照組和處理組NOS2啟動子甲基化檢測結(jié)果;B.對照組和處理組NOS2啟動子平均甲基化水平A. Results of the DNA methylation of NOS2 promoter in control group and treatment groups; B. Average methylation level of NOS2 promoter in control group and treatment groups

(續(xù)圖4 Continued)

2.2 細(xì)胞增殖檢測結(jié)果

在不同時(shí)間點(diǎn)對細(xì)胞增殖檢測后,結(jié)果發(fā)現(xiàn):在0 h時(shí),對照組的細(xì)胞增殖與處理組之間無明顯差異(P>0.05);在24 h時(shí),與對照組相比,處理組的細(xì)胞增殖倍數(shù)顯著降低(P<0.05);在48 h時(shí),與對照組相比,對照組的細(xì)胞增殖與處理組之間無明顯差異(P>0.05);在72 h時(shí),與對照組相比,對照組的細(xì)胞增殖與處理組之間無明顯差異(P>0.05),結(jié)果如圖5所示。

圖5 NOS2甲基化編輯后不同時(shí)間點(diǎn)對照組和處理組的細(xì)胞中細(xì)胞增殖倍數(shù)的柱狀圖Fig.5 Histograms of cell proliferation in control group and treatment groups at different times after NOS2 methylation editing

2.3 相關(guān)基因的表達(dá)檢測結(jié)果

在PK-15細(xì)胞中對NOS2進(jìn)行甲基化編輯后,檢測NOS2基因表達(dá)和iNOS蛋白表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,處理組的NOS2基因相對表達(dá)量和iNOS蛋白質(zhì)相對表達(dá)量均顯著下降(P<0.05),如圖6A和6B所示。

A.對照組和處理組細(xì)胞中NOS2基因表達(dá)水平;B. 對照組和處理組細(xì)胞中iNOS蛋白表達(dá)水平;C.對照組和處理組細(xì)胞中相關(guān)基因表達(dá)水平柱狀圖;D.對照組和處理組細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)水平A. The histogram of NOS2 gene expression levels in control group and treatment groups; B. iNOS protein expression levels in control group and treatment groups;C. The histogram of related gene expression levels in control group and treatment groups; D. Related protein expression levels in control group and treatment groups

利用qPCR檢測NOS2的同源基因以及幾個(gè)與肌纖維相關(guān)基因的表達(dá)量發(fā)現(xiàn):與對照組相比,NOS1基因的表達(dá)差異不顯著,NOS3基因的表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05);MYHC-Ⅰ和MYHC-Ⅱa表達(dá)量上調(diào),但差異不顯著(P>0.05),MYHC-Ⅱb和MYHC-Ⅱx基因的表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05),Myoglobin表達(dá)量下降,但差異不顯著(P>0.05),如圖6C所示。

利用WB檢測NOS2的同源基因以及兩個(gè)與肌纖維相關(guān)基因編碼蛋白的相對表達(dá)量發(fā)現(xiàn):與對照組相比,nNOS蛋白和eNOS蛋白相對表達(dá)量明顯上升,MYH6的蛋白相對表達(dá)量也明顯上升,而Myoglobin蛋白相對表達(dá)量明顯下降。該結(jié)果表明,隨著NOS2表達(dá)下降,肌纖維和肌紅蛋白相關(guān)基因及相應(yīng)蛋白的表達(dá)也發(fā)生變化,如圖6D所示。

2.4 細(xì)胞中NO濃度檢測結(jié)果

通過測定對照組和處理組的細(xì)胞NO含量來檢測NOS2甲基化編輯對NO濃度的影響。結(jié)果顯示,對照組中NO濃度平均值為8.66 μmol·L-1, 處理組的NO濃度平均值為1.88 μmol·L-1,與對照組相比,處理組的NO含量顯著降低(P<0.05),如圖7所示。

圖7 對照組和處理組細(xì)胞中NO含量的小提琴圖Fig.7 The violin plot of NO concentration in control group and treatment groups

3 討 論

3.1 NOS2基因啟動子甲基化對其表達(dá)的影響

NOS2基因?qū)儆谝谎趸厦讣易?一氧化氮合酶催化L-精氨酸產(chǎn)生NO和L-瓜氨酸[28],一氧化氮合酶家族有3種亞型,包括神經(jīng)元一氧化氮合酶(nNOS)與誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)和內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)[29],分別由NOS1、NOS2和NOS3編碼。本研究通過對NOS2基因進(jìn)行甲基化編輯,結(jié)果發(fā)現(xiàn)NOS2基因啟動子前500 bp區(qū)域平均DNA甲基化水平降低,但差異不顯著,而gRNA2結(jié)合位點(diǎn)附近的CpG位點(diǎn)甲基化水平增加。此外,NOS2基因表達(dá)量和其iNOS蛋白質(zhì)表達(dá)量顯著降低。通常位于啟動子區(qū)域的DNA甲基化會抑制基因的表達(dá),而在本研究中NOS2基因啟動子前500 bp區(qū)域平均DNA甲基化水平降低但NOS2基因表達(dá)量下降,可能的原因是NOS2基因的表達(dá)活性可能受其啟動子區(qū)域某個(gè)或某些關(guān)鍵CpG位點(diǎn)的甲基化水平影響,在一項(xiàng)NOS2甲基化與帕金森綜合征的研究中,作者評估了NOS2基因3個(gè)CpG位點(diǎn),其中一個(gè)CpG位點(diǎn)與帕金森綜合征顯著相關(guān)[30]。盡管本研究檢測了NOS2基因啟動子區(qū)域前500 bp的甲基化狀態(tài),但gRNA2結(jié)合位點(diǎn)附近的CpG位點(diǎn)甲基化水平增加。因此,NOS2基因表達(dá)量降低可能是由一個(gè)或幾個(gè)關(guān)鍵CpG位點(diǎn)的甲基化引起的。

3.2 NOS2基因?qū)θ馄焚|(zhì)的作用

Hattori等[31]研究表明,在脂多糖和細(xì)胞因子刺激的血管平滑肌細(xì)胞中,PI3K-Akt通路可以通過NF-kappa B(核因子kappa B)調(diào)控iNOS的表達(dá)。Silva和Garvin[32]在小鼠上的研究發(fā)現(xiàn),ATP通過刺激PI3激酶和Akt來增強(qiáng)一氧化氮酶的活性,進(jìn)而增加NO的產(chǎn)生。NO是一種信使分子,在許多組織、細(xì)胞和器官中的核心生物過程中為關(guān)鍵的調(diào)節(jié)分子[33]。Reisberg等[34]驗(yàn)證了NO與綿羊血紅蛋白結(jié)合的動力學(xué)和平衡,并證實(shí)NO結(jié)合得更快,親和力比CO高1 500倍。有研究表明,肌紅蛋白也可以通過氧化、配體結(jié)合以及形成生物活性S-亞硝基肌紅蛋白的方式調(diào)節(jié)NO平衡[35]。因此,NOS2基因可能通過影響細(xì)胞內(nèi)NO的濃度進(jìn)而影響肌紅蛋白的形成[36]。本研究發(fā)現(xiàn),隨著NOS2表達(dá)量的降低,細(xì)胞內(nèi)NO含量顯著降低,這個(gè)結(jié)果表明了NOS2在內(nèi)源性NO合成的作用,這也與前人研究結(jié)果一致。

對于肉品質(zhì)的形成,肌纖維和肌紅蛋白都起著至關(guān)重要的作用。肌纖維是肌肉組織的基本結(jié)構(gòu)單位,肌纖維數(shù)目和直徑?jīng)Q定了肌肉產(chǎn)量。肌纖維依據(jù)代謝特征和收縮特性可以分為4種類型,分別為Ⅰ型(慢速氧化型)、Ⅱa型(快速氧化型)、Ⅱb型(快速酵解型)和Ⅱx型(中間型),而在分子生物學(xué)中,根據(jù)肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain,MYHC)亞型的不同,豬骨骼肌中含有MYHCⅠ、MYHCⅡa、MYHCⅡb和MYHCⅡx四種異構(gòu)體,對應(yīng)不同的編碼基因,特異性的存在于Ⅰ型、Ⅱa型、Ⅱb型和Ⅱx型肌纖維中[37]。不同肌纖維類型組成與豬肉品質(zhì)密切相關(guān),是影響肉質(zhì)性狀表現(xiàn)的關(guān)鍵因素[38]。豬肌肉色素主要由肌紅蛋白、血紅蛋白以及微量有色代謝物組成。在放血充分的情況下,對肉色起主要作用的是肌紅蛋白。本研究結(jié)果顯示,隨著NOS2表達(dá)降低,MYHC-Ⅰ的表達(dá)水平增加,MYHC-Ⅱa表達(dá)水平下降,MYHC-Ⅱb和MYHC-Ⅱx的表達(dá)水平顯著下降,而Myoglobin基因表達(dá)量下降。這表明NOS2表達(dá)可能通過影響肌纖維相關(guān)基因和肌紅蛋白的表達(dá)從而影響豬肉色。

此外,本研究還注意到NOS2同家族的另外兩個(gè)基因NOS1和NOS3表達(dá)量的變化,結(jié)果顯示隨著NOS2表達(dá)降低,PK-15細(xì)胞中nNOS和eNOS蛋白均顯著上調(diào),二者均屬于鈣離子依賴型NOS。相比于iNOS,nNOS和eNOS對NO的合成高度依賴于足夠的底物和輔因子的參與,而且nNOS和eNOS的調(diào)控更加復(fù)雜,涉及許多翻譯后調(diào)控,包括位點(diǎn)磷酸化[24]、蛋白質(zhì)互作[39]以及亞細(xì)胞定位的調(diào)節(jié)[40]。因此,NOS表達(dá)的變化不總是和實(shí)際細(xì)胞NO合成水平一致。例如,在一項(xiàng)高鹽和低鹽飲食對NO合成影響的研究中,Welch和Wilcox[41]發(fā)現(xiàn)在腎遠(yuǎn)直小管末端的致密斑中NO合成與nNOS的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。因此,NOS2表達(dá)對NOS1和NOS3表達(dá)的影響以及三者的相互調(diào)控還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

通過在PK-15細(xì)胞上對NOS2基因進(jìn)行甲基化編輯,發(fā)現(xiàn)NOS2基因的異常表達(dá)能夠影響細(xì)胞中的NO的生成,同時(shí)影響MYHC-Ⅰ、MYHC-Ⅱa、MYHC-Ⅱb、MYHC-Ⅱx以及Myoglobin的表達(dá),初步闡述了NOS2基因?qū)ωi肌肉發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響機(jī)制。