奶牛生殖道微生物與繁殖及相關(guān)疾病的研究進(jìn)展

沈文娟,楊 卓,張馨蕊,付 予,陶金忠

(寧夏大學(xué)動物科技學(xué)院,銀川 750021)

繁殖是物種延續(xù)的必要條件。動物的繁殖效率由受胎率、胚胎早期丟失率、流產(chǎn)率和胎兒早產(chǎn)等因素決定,同時受到生殖道特定微生物的影響[1]。近年來關(guān)于宿主與微生物關(guān)系的研究受到了重點關(guān)注。生物有機(jī)體體表和體內(nèi)棲息著種類各異且數(shù)量繁多的微生物,其中動物的口腔、腸道、陰道以及皮膚是動物體的四大菌庫。當(dāng)它們處于一定比例時,與宿主形成相互依存和相互制約的平衡體。近年來微生物研究者對生殖道微生物進(jìn)行了大量研究,取得了豐碩的成果[2-3]。

生殖道微生物主要包括陰道、外宮頸口和子宮定植的微生物群,生殖道內(nèi)微生物種類繁多,微生物群落的形成和穩(wěn)定是其與宿主和環(huán)境相互適應(yīng)的長期進(jìn)化結(jié)果,三者之間處于一個協(xié)調(diào)和平衡的動態(tài)關(guān)系,且易受宿主激素水平、飼養(yǎng)方式和藥物使用等因素的影響[4]。共生的生殖道微生物可能會影響奶牛的繁殖能力,既可以與生殖道上皮細(xì)胞組成防御系統(tǒng),也可通過代謝產(chǎn)物抑制病原菌生長[2]。菌群與環(huán)境和宿主間互相保持平衡并維持宿主生殖系統(tǒng)的正常生理功能,生殖道微生態(tài)的穩(wěn)定和平衡關(guān)系影響各種生殖疾病的發(fā)生、發(fā)展和治療[5]。研究證明,與人類陰道微生物群相比,牛的子宮和陰道微生物群具有更高的多樣性[6]。生殖道內(nèi)菌群的紊亂和失衡易引發(fā)陰道炎和子宮內(nèi)膜炎等生殖道疾病[7]。因生殖道微生物與宿主的健康密切相關(guān),其與宿主的健康和疾病之間的關(guān)系已迅速發(fā)展成了一個新的科學(xué)研究領(lǐng)域,這篇綜述將就奶牛生殖道微生物變化規(guī)律探討及其與生殖道疾病之間的關(guān)系。

1 奶牛生殖道微生物變化規(guī)律

1.1 陰道微生物

健康牛生殖道微生物菌群由需氧、兼性厭氧和專性厭氧微生物組成,但各類型菌群占比不同,對維持宿主陰道菌群定植具有重要作用[8]。Clemmons等[1]指出,奶牛陰道內(nèi)的許多菌群與腸道細(xì)菌重疊,這可能是由于陰道口的空間位置與肛門非常接近,加之,肛門位于陰道口上部,動物排出的糞便經(jīng)常沾染到外陰,導(dǎo)致大量腸道菌群可通過擴(kuò)散遷移的方式進(jìn)入陰道內(nèi)。健康奶牛陰道中菌群主要包括乳桿菌屬(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸桿菌屬(Enterobacter)和少量真菌[9],其中乳酸菌為主要優(yōu)勢菌,多為兼性厭氧菌,能夠分解糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)產(chǎn)生乳酸,維持和保護(hù)生殖道內(nèi)的弱酸性環(huán)境[10]。李炳志[10]對產(chǎn)后健康奶牛陰道細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢菌為表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)和乳酸桿菌(Lactobacillussp.)。研究證明,乳酸菌是了解陰道狀況的關(guān)鍵,卷曲乳酸桿菌(Lactobacilluscrispatus)、惰性乳桿菌(Lactobacillusiners)可以作為區(qū)分陰道內(nèi)菌群由正常到異常狀態(tài)變化的一個重要標(biāo)志[11]。

1.2 子宮微生物

傳統(tǒng)觀念認(rèn)為健康子宮是無菌的[12],尤其在妊娠階段,為胚胎發(fā)育場所提供必要的無菌環(huán)境。然而,已有研究在胎盤不同區(qū)域檢測到了細(xì)菌[13]。Onderdonk等[14]通過PCR在新生兒絨毛膜檢測到細(xì)菌與支原體存在,并發(fā)現(xiàn)葡萄球菌(Staphylococcus)和棒狀桿菌屬(Corynebacterium)以及與細(xì)菌性陰道病相關(guān)的物種;Moore等[15]驗證了子宮具有微生物組的假設(shè),在母牛子宮內(nèi)膜、羊水、宮頸腔等各組織中檢測出不同比例的微生物菌群,其中厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria)為優(yōu)勢菌。子宮內(nèi)微生物可能是通過產(chǎn)后初期松弛的陰道和擴(kuò)張的子宮頸進(jìn)入,利用子宮內(nèi)適宜的環(huán)境和溫度進(jìn)行繁殖,也可能是子宮復(fù)舊完成時內(nèi)部細(xì)菌未被完全清除,而陰道和子宮頸對子宮環(huán)境的保護(hù)可能有助于減少子宮腔內(nèi)微生物的多樣性[1]。在正常情況下通過自身的防御機(jī)能凈化子宮,抵御病原微生物定植。奶牛的自然防御機(jī)制可以消除許多病原微生物,但消除的效率取決于細(xì)菌致病性和機(jī)體免疫狀態(tài)[16]。

2 奶牛不同生理階段生殖道微生物結(jié)構(gòu)及豐度變化規(guī)律

2.1 發(fā)情周期奶牛生殖道微生物變化規(guī)律

Michael[17]研究靈長類動物提出卵巢分泌的類固醇激素可以影響短鏈脂肪酸的產(chǎn)生,調(diào)節(jié)陰道菌群結(jié)構(gòu)。Otero等[18]使用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法評估了發(fā)情周期中奶牛陰道微生物菌群的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)卵泡期陰道乳桿菌及腸球菌(Enterococcussp.)的豐度顯著高于黃體期,說明乳桿菌和腸球菌在高P4階段豐度降低。Quereda等[19]對初次配種的奶牛卵泡期和黃體期陰道微生物區(qū)系進(jìn)行了研究也印證了這一點,即卵泡期乳桿菌屬的相對豐度高于黃體期,且發(fā)現(xiàn)軟壁菌門(Tendericutes)、厚壁菌門和擬桿菌門占陰道微生物區(qū)系的75%,其次為變形菌門、放線菌門(Actinobacteria)和梭菌門(Fusobacteria)、Epsilonbacteraeota、髕骨菌(Patescibacteria)等。Cowley和Heiss[20]對發(fā)情周期不同階段小鼠陰道菌群的研究發(fā)現(xiàn),卵泡期陰道微生物多樣性顯著增加,鏈球菌和乳酸菌(Lacticacidbacteria)豐度升高;劉暢等[21]研究不同生理時期肉牛陰道菌群結(jié)構(gòu)差異發(fā)現(xiàn),卵泡期細(xì)菌總數(shù)、乳桿菌屬豐度顯著高于黃體期,與Otero等[18]的報道結(jié)果一致,可能是發(fā)情周期階段孕激素(P4)和雌二醇(E2)等激素的周期性變化導(dǎo)致生殖道pH發(fā)生變化,進(jìn)而影響陰道細(xì)菌豐度的變化。同時微生物的變化也引起其代謝產(chǎn)物的變化,如在發(fā)情期間機(jī)體E2升高,陰道乳酸菌等菌類豐度升高,其產(chǎn)生的脂肪酸使pH下降,同時脂肪酸作為誘導(dǎo)劑可促進(jìn)奶牛發(fā)情[17],但具體機(jī)理還不清楚。

在發(fā)情周期,子宮微生物也發(fā)生了一定的變化規(guī)律,Ault等[22]研究健康奶牛子宮微生物時發(fā)現(xiàn)奶牛在人工授精前2 d細(xì)菌多樣性顯著下降,可能是為妊娠營造適宜環(huán)境。隨著發(fā)情的周期性變化,子宮內(nèi)細(xì)菌群落多樣性也呈周期性變化。基于以上研究結(jié)果,提示發(fā)情周期不同階段,卵巢類固醇激素的周期性變化,導(dǎo)致陰道菌群存在周期性變化,卵泡期陰道產(chǎn)酸的乳桿菌屬豐度增加,陰道呈弱酸性環(huán)境,且微生物多樣性高于黃體期,而子宮微生物多樣性在卵泡期降低。

2.2 妊娠期奶牛生殖道微生物變化規(guī)律

妊娠期生殖道環(huán)境處于動態(tài)變化,菌群結(jié)構(gòu)多變復(fù)雜[23]。整個繁殖周期,母體營養(yǎng)、激素、免疫系統(tǒng)和微生物等因素協(xié)同作用以維持母體生命活動和妊娠[24]。妊娠期間,P4水平升高[25]、宿主免疫調(diào)節(jié)能力發(fā)生變化[26-27]。Messman等[28]研究顯示,不同妊娠狀態(tài)和雌二醇濃度母牛陰道整體細(xì)菌群落特征無顯著差異,但在不同妊娠狀態(tài)下存在物種水平差異,妊娠母牛陰道存在較多的多殺性巴氏桿菌(P.multocida),未妊娠母牛陰道存在豐度較高的未分類巴斯德菌科(Pasteurellaceae)和未分類梭桿菌屬(Fusobacterium),這些差異可能改變陰道環(huán)境,從而影響生育能力和陰道健康。妊娠期間雌激素水平升高,陰道黏膜增厚,糖原沉積增加,糖原作為乳酸菌生產(chǎn)乳酸的主要碳水化合物,有助于陰道pH的保護(hù)[29],乳酸菌占據(jù)主要優(yōu)勢,生殖道微生物發(fā)生顯著變化,整體微生物豐度和多樣性降低[23,30]。Genís等[31]在產(chǎn)犢前3周將乳酸菌菌株作為益生菌注入奶牛陰道和子宮中,奶牛分娩后患子宮炎的幾率較低,說明產(chǎn)乳酸菌可能對妊娠期奶牛生殖健康和繁殖能力有益。Moore等[15]研究顯示,妊娠母牛子宮內(nèi)豐度最高的為厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門,且妊娠子宮各組織的門水平物種相似;Aagaard等[23]研究報道,健康孕婦妊娠期的物種多樣性和豐富度均下降,優(yōu)勢種為乳酸桿菌、梭菌目(Clostridiales)、擬桿菌目(Bacteroidales)和放線菌目(Bacteroidales);Deng等[32]對TAI后不同妊娠階段奶牛陰道微生物測序分析,顯示不同妊娠階段陰道微生物群落多樣性存在顯著差異,妊娠中期和后期微生物多樣性降低。子宮細(xì)菌群落的發(fā)育組成影響繁殖能力,表明生殖道微生物群落多樣性與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的變化可能與妊娠的建立存在密切相關(guān)性。綜上,妊娠后的陰道微生物區(qū)系相較于未妊娠具有更高的穩(wěn)定性,奶牛在妊娠期子宮微生物豐度和多樣性降低,繁殖前細(xì)菌豐度的差異可能會影響生殖道環(huán)境,潛在的影響繁殖。

3 產(chǎn)后奶牛生殖道微生物變化規(guī)律

3.1 產(chǎn)后陰道微生物結(jié)構(gòu)組成

產(chǎn)后陰道菌群的構(gòu)建是一個動態(tài)演變的過程,隨產(chǎn)后時間的延長,陰道菌群的復(fù)雜度在不斷增加(表1)。不同品種、健康狀況和生理階段的牛其陰道微生物組成差異顯著,Nesengani等[33]比較發(fā)現(xiàn),荷斯坦奶牛生殖道中放線桿菌屬相對豐度顯著高于海福特牛,費(fèi)克藍(lán)姆氏菌屬(Facklamia)和睡眠嗜組織菌屬(Histotrophil)在海福特牛生殖道中的相對豐度則高于荷斯坦奶牛,而牛生殖道菌群結(jié)構(gòu)變化的潛在機(jī)制以及與生殖的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

表1 奶牛生殖道微生物優(yōu)勢菌

3.2 產(chǎn)后正常子宮微生物結(jié)構(gòu)及豐度變化

產(chǎn)后子宮內(nèi)細(xì)菌群落隨時間高度動態(tài)變化。王國卿[38]認(rèn)為,產(chǎn)后第7天牛子宮內(nèi)總細(xì)菌豐度達(dá)到最高,此后逐漸減少,產(chǎn)后第36～46 天完成子宮復(fù)舊,子宮中細(xì)菌數(shù)降到最低(最低稀釋度1×10-7,最低稀釋度的菌落數(shù)小于30個)。產(chǎn)后子宮環(huán)境逐漸改變有利于厭氧菌如擬桿菌門和梭桿菌門的生長,這種變化可能是由于胎盤的血流停止,子宮中剩余血液、羊水和尿囊液等組成的惡露以及分娩結(jié)束后子宮形成的低氧環(huán)境為厭氧菌的生長創(chuàng)造理想條件[39]。通過對奶牛產(chǎn)后1～32 d進(jìn)行跟蹤采樣,發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)以大腸桿菌、鏈球菌、變形桿菌和梭狀芽胞桿菌為主[40],但也有研究報道在產(chǎn)后奶牛子宮中分離到了葡萄球菌、棒狀桿菌和假單胞桿菌(Pseudomonas)等[9],這些報道的結(jié)果不同可能與環(huán)境、飼養(yǎng)管理及個體差異有關(guān)。產(chǎn)后早期由于分娩時生殖道受環(huán)境或助產(chǎn)的污染,導(dǎo)致子宮內(nèi)大腸桿菌、擬桿菌、表皮葡萄球菌檢出率增加,到第7天左右達(dá)到最高;之后隨著產(chǎn)后時間的延長,惡露排出、生殖道機(jī)能以及自身免疫系統(tǒng)的恢復(fù),這些環(huán)境病原菌逐漸下降。人類研究表明,大多數(shù)女性分娩后生殖道菌群平衡出現(xiàn)紊亂,乳酸桿菌多樣性減少,厭氧菌如嗜胨菌屬(Peptoniphilus)、普氏菌屬(Prevotella)和厭氧球菌屬(Anaerococcus)增加[41]。生殖道細(xì)菌多樣性失衡會影響后續(xù)妊娠的建立和維持,尤其乳酸菌的豐度降低與疾病和生殖能力下降相關(guān)[42]。總之,奶牛產(chǎn)后早期子宮中微生物數(shù)量先升高,其中厭氧菌及條件病原菌比例增加,乳酸菌數(shù)量減少;之后逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)后晚期微生物數(shù)量減少,厭氧菌及條件病原菌比例下降,乳酸菌數(shù)量增加。

4 生殖道感染微生物菌群特征及疾病

4.1 奶牛陰道菌群失衡

生殖道微生物群落能夠影響生殖道健康,但生殖道內(nèi)的菌群同時受到生殖道環(huán)境的影響。當(dāng)受到內(nèi)源性或外源性因素影響時菌群結(jié)構(gòu)劇烈變化,陰道內(nèi)微生物失衡,由正常生理性狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)椴±硇誀顟B(tài)[22]。研究發(fā)現(xiàn),患細(xì)菌性生殖道疾病的奶牛陰道微生物群落菌群多樣性比健康奶牛更加豐富[43],其中厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和梭桿菌門豐度顯著增加,并存在一些以往未發(fā)現(xiàn)的低豐度菌群,因此生殖道內(nèi)微生物紊亂是陰道炎癥的關(guān)鍵因素。

奶牛陰道中定植的大腸桿菌、葡萄球菌、加德納氏菌等可能是作為條件性致病菌,當(dāng)機(jī)體免疫機(jī)能低下時條件病原菌大量繁殖引起陰道炎,并伴有乳桿菌減少的菌群紊亂[44]。凌宗欣[45]對女性生殖道微生物的研究發(fā)現(xiàn),生殖道感染是由乳桿菌為主的陰道正常菌群轉(zhuǎn)換為兼性厭氧菌為主的如加德納菌屬(Gardnerella)、奇異菌屬(Atopobium)、普氏菌屬等致病性微生物菌群。乳酸菌是健康奶牛的生殖道優(yōu)勢菌,不孕癥奶牛生殖道乳酸菌豐度顯著降低,金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)成為優(yōu)勢菌群[42,46],提示陰道菌群的結(jié)構(gòu)失衡可能與子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生有關(guān)。Peng等[47]報道了產(chǎn)后第10天健康奶牛和子宮炎奶牛陰道優(yōu)勢菌群為擬桿菌門、厚壁菌門和梭桿菌門,第40天主要菌群為擬桿菌門、厚壁菌門、軟壁菌門和變形菌門,且子宮炎奶牛梭桿菌門豐度顯著高于健康奶牛;Wang等[34]發(fā)現(xiàn),健康和子宮炎奶牛陰道中均含有腸球菌屬(Enterococcus)、乳酸菌屬和小球菌屬(Micrococcus)的桿菌群,子宮炎奶牛陰道菌群豐度顯著增加,且以大腸桿菌為主。因此,患有細(xì)菌性陰道炎奶牛的陰道中未分離出特定病原菌,只是某些條件性致病菌如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等豐度發(fā)生了變化[48],說明生殖道微生物菌群紊亂是造成炎癥的關(guān)鍵因素[49]。綜上所述,奶牛陰道感染后菌群結(jié)構(gòu)比健康奶牛更為復(fù)雜,且無特定病原菌,陰道內(nèi)病原微生物的大量定植及結(jié)構(gòu)失衡是造成奶牛陰道疾病的關(guān)鍵因素。

4.2 子宮感染微生物菌群變化規(guī)律與疾病

奶牛分娩后因助產(chǎn)不當(dāng)、胎衣不下、免疫機(jī)能低下、環(huán)境條件差及生殖道中病原微生物過度生長等因素導(dǎo)致子宮感染,引發(fā)奶牛子宮炎和子宮內(nèi)膜炎。子宮炎是子宮壁的一種深度炎癥,通常發(fā)生在產(chǎn)后21 d內(nèi),子宮內(nèi)膜炎和亞臨床子宮內(nèi)膜炎發(fā)生在產(chǎn)后21 d或以上[50],可引起子宮組織和子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)破壞[51],奶牛產(chǎn)后子宮感染常造成不發(fā)情、不排卵和黃體期延長,導(dǎo)致配種受胎率降低,嚴(yán)重者因繁殖能力喪失而淘汰,造成養(yǎng)殖業(yè)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[52]。當(dāng)奶牛產(chǎn)后造成感染,而惡露有利于微生物繁殖,且產(chǎn)后奶牛大多處于免疫抑制,在眾多因素的作用下引起細(xì)菌性子宮內(nèi)膜炎等繁殖性疾病[53]?；?6S rRNA擴(kuò)增子測序的研究表明,與健康奶牛子宮微生物群結(jié)構(gòu)相比,子宮炎奶牛子宮細(xì)菌群落物種多樣性更豐富,結(jié)構(gòu)組成不均衡,子宮微生物群更加復(fù)雜[43,54]。

Chen等[55]發(fā)現(xiàn),患子宮內(nèi)膜炎患者生殖道微生物菌群因定植部位不同而不同,陰道以乳酸桿菌為絕對優(yōu)勢菌群,而在宮腔、輸卵管中乳酸桿菌豐度下降,假單胞桿菌和鮑氏不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)豐度逐漸增加,宮腔菌群的改變引起子宮內(nèi)膜炎反應(yīng)機(jī)制改變,釋放出的炎性物質(zhì)促進(jìn)了炎癥發(fā)生和發(fā)展[56]?；诩?xì)菌的培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),大腸桿菌、化膿隱秘桿菌(Arcanobacteriumpyogenes)、壞死梭桿菌(Fusobacteriumnecrophorum)和產(chǎn)黑素普雷沃氏菌(Prevotellamelaninogenicus)等病原菌在產(chǎn)后過度生長,導(dǎo)致子宮內(nèi)膜炎或子宮積膿[57]。Takcs等[58]認(rèn)為,子宮受到污染主要發(fā)生在產(chǎn)后10～21 d,以鏈球菌、大腸桿菌和棒狀桿菌最常見;彭宇[59]對產(chǎn)后10、20、30、40天奶牛樣本測序發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢菌群分別為葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)、沙門氏菌(Salmonella)和葡萄球菌。Jeon等[39]研究發(fā)現(xiàn),擬桿菌門在子宮內(nèi)膜炎奶牛中豐度顯著高于健康奶牛,其次為梭桿菌屬,其他細(xì)菌如螺旋菌、絲狀菌(Filamentousbacteria)、卟啉單胞菌屬、普雷沃氏菌屬(Prevotella)等;劉超遜等[60]發(fā)現(xiàn),引起水牛產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎的主要致病菌為壞死梭桿菌、卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)和解肝素擬桿菌(Bacteroidesheparinolyticus)。孫城濤等[61]報道,大腸桿菌同時存在于健康及患病奶牛中,但患病奶牛陰道內(nèi)大腸桿菌豐度顯著高于健康奶牛,且顯著高于其他細(xì)菌總和,陰道條件性病原微生物的豐度增加和結(jié)構(gòu)失衡可能是奶牛子宮內(nèi)膜炎的患病原因。子宮疾病可能更依賴于特定細(xì)菌的過度生長和免疫系統(tǒng)的反應(yīng)性,某些致病菌的過度生長可能會導(dǎo)致微生物整體多樣性增加,引發(fā)子宮感染性疾病[12,39]。子宮正常復(fù)舊期間和復(fù)舊完成后發(fā)情期間的奶牛子宮內(nèi)細(xì)菌與患子宮內(nèi)膜炎奶牛子宮內(nèi)細(xì)菌種類有相似性。因此,正常情況下子宮內(nèi)存在的條件致病菌可引起子宮內(nèi)膜炎。同時,在產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎中也發(fā)現(xiàn)了真菌如白色念珠菌感染[62]。另外,從未配種的青年母牛也會發(fā)生由大腸桿菌、假單胞桿菌引起的子宮內(nèi)膜炎[63]。子宮內(nèi)膜炎奶牛產(chǎn)后子宮內(nèi)細(xì)菌多樣性均呈現(xiàn)先升高后降低的演替規(guī)律,子宮內(nèi)膜炎奶牛陰道內(nèi)乳酸菌顯著減少,大腸桿菌、鏈球菌等條件致病菌顯著增加[53]。綜上所述,奶牛產(chǎn)犢后早期健康奶牛和患子宮內(nèi)膜炎奶牛存在一個共有的子宮微生物群,而后患子宮內(nèi)膜炎奶牛微生物群迅速變化,導(dǎo)致與炎癥相關(guān)條件致病菌群大量繁殖,細(xì)菌多樣性增加,具有明顯的時間動態(tài)變化。

綜上所述,陰道菌群的變化是一個動態(tài)過程[64],生殖道微生物與奶牛的發(fā)情周期呈現(xiàn)一致性變化規(guī)律,妊娠期及產(chǎn)后期生殖道微生物的豐度和多樣性也呈規(guī)律性變化。生殖道微生物的紊亂導(dǎo)致疾病的發(fā)生,也影響奶牛的繁殖效率。鑒于細(xì)菌在維持生殖道穩(wěn)態(tài)方面的關(guān)鍵作用,奶牛產(chǎn)后陰道和子宮微生物研究對解決子宮細(xì)菌污染、預(yù)防和治療產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎具有重要意義。奶牛生殖道微生物多樣性復(fù)雜,且受品種、生理階段及個體差異的因素影響。