接種釀酒酵母強(qiáng)化發(fā)酵普洱茶研究

李若愚,王藤,劉琨毅,伯年國(guó),王啟,陳秋月,趙明,3*

1(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 茶學(xué)院,云南 昆明,650201)

2(宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院 五糧液技術(shù)與食品工程學(xué)院,四川 宜賓,644003)

3(云南農(nóng)業(yè)大學(xué),云南省藥用植物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西南中藥材種質(zhì)創(chuàng)新與利用國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心,云南 昆明,650201)

普洱茶由大葉種茶[(Camelliasinensisn.) var.assamiea(Masters) Kitmaura]為原料制成[1],曬青茶經(jīng)后發(fā)酵加工,湯色濃郁,味道醇厚,陳香特色明顯[2-3]。此外,國(guó)內(nèi)外的研究也發(fā)現(xiàn),普洱熟茶具有保健作用或生物活性,如降脂、瘦身、抗氧化、抗菌等[4]。普洱熟茶之所以具有獨(dú)特風(fēng)味與良好的保健功能,是因?yàn)槠洫?dú)特的后發(fā)酵(post-fermentation)工藝。后發(fā)酵是普洱熟茶加工的關(guān)鍵工序,是其品質(zhì)特征和保健功能形成的核心步驟[5],由于采用自然接種方式發(fā)酵,發(fā)酵原料、器皿、加工環(huán)境等均未進(jìn)行殺菌處理,微生物可能來(lái)自毛茶、環(huán)境(水、空氣、加工車間、器皿)以及加工人員等,其現(xiàn)狀是參與發(fā)酵的微生物來(lái)源多樣,種類不可控。

強(qiáng)化發(fā)酵是將一兩種外源微生物或人工合成的微生物菌群接入到未經(jīng)滅菌的原料中進(jìn)行發(fā)酵,以期提高發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)[6]。課題組前期已應(yīng)用強(qiáng)化發(fā)酵提升普洱熟茶品質(zhì),如強(qiáng)化接種地衣芽孢桿菌L1發(fā)酵中茶褐素、茶紅素、可溶性糖類品質(zhì)得分顯著提升,CG、EC、GCG、C等6種兒茶素含量顯著降低(P<0.05)[7];接種枝犁頭霉A1中的茶褐素、可溶性糖分含量明顯增加,而C、EC、GCG、EGCG等7種兒茶素含量顯著降低(P<0.05),增加了甜味和厚重感在茶湯中所占的分值,苦味和酸味所占的分值也有所減少[8]。這說(shuō)明強(qiáng)化發(fā)酵是普洱茶質(zhì)量和安全的提升途徑。

作為人類最早馴化的微生物,釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)在多種食品發(fā)酵中得到廣泛應(yīng)用,是安全有益的微生物。釀酒酵母廣泛用于果蔬、谷物、奶制品、豆類、肉類、水產(chǎn)發(fā)酵[9]。普洱茶發(fā)酵過(guò)程中出現(xiàn)的酒釀酵母菌也被發(fā)現(xiàn),謝美華等[10]已將釀酒酵母、根霉菌(Rhizopussp.)、黑曲霉(Aspergillusniger)等微生物從普洱茶渥堆發(fā)酵樣品中分離出來(lái)。張陽(yáng)等[11]還發(fā)現(xiàn),黑曲霉在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中居于主導(dǎo)地位,與之類似的還有釀酒酵母、光孢青霉(Penicilliumglabrum)等。優(yōu)勢(shì)酵母菌由趙騰飛等[12]從普洱茶渥堆發(fā)酵樣品中分離出來(lái)的,經(jīng)過(guò)純菌接種和發(fā)酵試驗(yàn)表明,由純種酵母菌株發(fā)酵的茶樣,香氣甜美,口感微苦,但也有生津感,并帶有甘甜的特性?？墒股柚械亩喾宇愇镔|(zhì)含量有效降低,茶褐素含量增加;單治國(guó)等[13]以酵母菌為原料發(fā)酵后的普洱茶,在散發(fā)濃郁陳香的同時(shí),口感醇厚,甘甜爽口。茶多酚、氨基酸和茶紅素的含量相對(duì)于固態(tài)發(fā)酵的綠色木霉、黑曲霉和少根根霉這3種微生物來(lái)說(shuō)是最高的。釀酒酵母強(qiáng)化接菌發(fā)酵普洱茶研究表明釀酒酵母是一種安全的,可以用于提高普洱茶品質(zhì)的微生物。但是,普洱茶發(fā)酵是一個(gè)長(zhǎng)達(dá)1～2個(gè)月的過(guò)程,一般通過(guò)翻堆控制發(fā)酵進(jìn)程,前人都是在發(fā)酵開始時(shí)(下堆階段)接入釀酒酵母,因而什么階段接入釀酒酵母發(fā)酵值得進(jìn)一步研究。本文將從普洱茶中分離鑒定得到的釀酒酵母P002分不同發(fā)酵階段接種于茶葉中,接菌強(qiáng)化發(fā)酵普洱茶,對(duì)發(fā)酵樣品的感官特征、化學(xué)成分及微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,以期評(píng)估該菌用于普洱茶強(qiáng)化接菌發(fā)酵的可行性,為提高普洱茶品質(zhì)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

普洱普山茶葉有限公司提供一芽二葉、三葉的曬青茶原料;苯丙氨酸(Phe)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、賴氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、精氨酸(Arg)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、蘇氨酸(Thr)、甲硫氨酸(Met)、甘氨酸(Gly)、谷氨酸Glu)、組氨酸(His)、絲氨酸(Ser)、天冬氨酸(Asp)、茶氨酸(Thea)、沒(méi)食子酸(GA)、表沒(méi)食子兒茶素(EGC)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)、兒茶素(C)、表兒茶素(EC)、兒茶素沒(méi)食子酸酯(CG)、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(GCG)、沒(méi)食子兒茶素(GC)、咖啡堿(CA)、沒(méi)食子酸(GA)、鞣花酸(EA)、楊梅素(Myr)、木犀草素(Lut)、槲皮素(Que)、山奈酚(Kea)、茶氨酸(Thea)、茶堿(Theo)等標(biāo)準(zhǔn)品,成都曼思特生物科技有限公司;酵母菌 DNA 提取試劑盒,莊盟國(guó)際有限公司(北京);麥芽汁培養(yǎng)基,環(huán)凱微生物科技有限公司(廣東);DNA聚合酶(2×RapidTaqMaster Mix),諾唯贊生物科技公司(南京);DNA Ladder Marker(DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)試劑)、5×Loading Buffer for Agarosegels(DNA 染料),上海捷瑞生物工程公司;DNA引物,擎科生物科技有限公司(北京)。

1.2 儀器與設(shè)備

CT15RE型離心機(jī),日立公司;LRHS-250-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;SW-CJ-1B型超級(jí)工作臺(tái),蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;JM-80電熱恒溫水浴鍋,上海丹陽(yáng)包裝機(jī)械;CP214型電子分析天平,奧豪斯儀器(上海)有限公司;756CRT型紫外可見分光光度計(jì),上海菁華科技儀器有限公司;1200型高速液相色譜,配TSKgel ODS-80TM色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),安捷倫公司;DW-86L626型醫(yī)用低溫保存箱,青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司;Trident 960型基因擴(kuò)增儀,力新儀器(上海)有限公司;YS6 060型色差儀,深圳市三恩時(shí)科技有限公司;XB.K.25型血球計(jì)數(shù)板,上海求精生化試劑儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 釀酒酵母P002鑒定

對(duì)菌株P(guān)002進(jìn)行ITS序列DNA測(cè)序分析,根據(jù)其ITS的DNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,確定菌株P(guān)002的分類地位。

1.3.2 釀酒酵母P002優(yōu)化發(fā)酵試驗(yàn)

優(yōu)化接菌階段試驗(yàn):在10 L蒸餾水中加入30 kg曬青茶,將曬青茶分為5層裝入發(fā)酵筐(50 cm×40 cm×60 cm),不同接菌階段對(duì)應(yīng)不同層,每次翻堆前順次接入茶葉質(zhì)量0.1%的發(fā)酵劑,以5 d為周期進(jìn)行茶葉發(fā)酵,每一周期翻堆接菌并靜置發(fā)酵,為期25 d。對(duì)茶樣進(jìn)行五點(diǎn)取樣,樣本存于-80 ℃冰箱,其中接菌樣品命名為F1～F4;將每一翻自然發(fā)酵的樣品(未接入釀酒酵母P002)命名為CK。每組樣品進(jìn)行3個(gè)重復(fù)。

1.3.3 釀酒酵母P002強(qiáng)化發(fā)酵普洱茶放大試驗(yàn)

強(qiáng)化發(fā)酵普洱茶試驗(yàn):稱取30 kg曬青毛茶,量取茶樣質(zhì)量30%的純凈水進(jìn)行潮水靜置12 h,次日適當(dāng)補(bǔ)水,保證茶葉潮水到位。將茶葉裝入發(fā)酵筐(50 cm×40 cm×60 cm),第四翻接入茶葉質(zhì)量0.1%的發(fā)酵劑,進(jìn)行為期25 d的靜置發(fā)酵。對(duì)茶樣進(jìn)行五點(diǎn)取樣,樣本存于-80 ℃冰箱,其中接菌樣品命名為S1;將未接入釀酒酵母P002自然發(fā)酵的樣品命名為CK。每組樣品進(jìn)行3個(gè)重復(fù)。

1.3.4 茶葉化學(xué)成分測(cè)定及感官審評(píng)

根據(jù)GB/T 8305—2013《茶 水浸出物》測(cè)定水浸出物含量;根據(jù)GB/T 8314—2013《茶 游離氨基酸總量的測(cè)定》測(cè)定游離氨基酸含量;根據(jù)GB/T 8313—2018測(cè)定茶多酚含量;蒽酮硫酸法測(cè)定可溶性糖含量[14],茶色素含量[15],測(cè)定兒茶素組分、咖啡堿及氨基酸組分含量高效液相色譜法[16],審評(píng)茶葉樣品由5位評(píng)茶員進(jìn)行,根據(jù)GB/T 23 776—2018采用定量描述分析法[17]評(píng)價(jià)茶湯特征滋味,同時(shí)對(duì)茶湯的顏色用色差儀進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 微生物多樣性分析

采用接種發(fā)酵普洱茶樣品的真菌DNA提取試劑盒提取,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)應(yīng)用DNA聚合酶(2×RapidTaqMaster Mix)進(jìn)行。其中,以引物ITS5-1737F和ITS2-2043R擴(kuò)增真菌ITS1的V2區(qū)。委托諾禾致源科技股份有限公司(北京),對(duì)PCR產(chǎn)物應(yīng)用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行基因測(cè)序。對(duì)嵌合體序列等疑問(wèn)序列通過(guò)QIIME軟件檢查并剔除,對(duì)獲得的序列選擇序列比對(duì)工具按97%的相似度進(jìn)行聚類和OTU劃分,計(jì)算Alpha多樣性指數(shù),評(píng)估每個(gè)樣本的多樣性水平。

1.4 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計(jì)分析和數(shù)據(jù)處理選用IBM SPSS Statistics 22.0軟件,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示數(shù)據(jù);主成分分析選用SIMCA 14.1軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母P002的鑒定

麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基接種菌株P(guān)002,培養(yǎng)期3 d后菌落呈乳白色圓形,色澤均勻,表面潤(rùn)澤光滑(圖1-a);菌形卵圓形,直徑8～15 μm,出芽生殖明顯(圖1-c);ITS系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析發(fā)現(xiàn),P002與Saccharomycescerevisiae(MK439 496.1)(LC413 770.1)等聚為一支(圖1-b),因此認(rèn)定P002為釀酒酵母(S.cerevisiae)。

a-釀酒酵母P002的菌落形態(tài);b-真菌ITS 核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹;c-顯微形態(tài)(400×,“→”表示出芽生殖)

2.2 強(qiáng)化發(fā)酵接菌階段優(yōu)化

為了應(yīng)用釀酒酵母P002發(fā)酵普洱茶,首先在第1～第4次翻堆階段時(shí),分別接入茶葉質(zhì)量0.1%的發(fā)酵劑,發(fā)酵普洱茶,得到5組發(fā)酵樣品。感官審評(píng)結(jié)果見圖2。由圖2-a可知干茶外形除CK茶樣色澤灰褐、含梗、條索較松外,其余茶樣干茶外形均為色澤烏褐、含梗、條索較松。茶湯顏色中CK、F2、F3和F4為紅褐明亮;F2的湯色為烏褐明亮。葉底均為烏褐色、有紅梗紅葉。由圖2-b得出結(jié)果,CK(63.35±0.02)和F2(63.72±1.18)的L*值較高,說(shuō)明其亮度較高;F1(46.25±0.03)的a*值較高,說(shuō)明其湯色更紅顏色更深;CK的b*值(91.56±0.2)較高,說(shuō)明其黃色程度更高。

a-發(fā)酵樣干茶、茶湯、葉底的感官特征;b-發(fā)酵樣茶湯的顏色參數(shù);c-發(fā)酵樣茶湯的滋味特征

對(duì)發(fā)酵茶樣的苦、澀、酸、厚、甜和香度進(jìn)行評(píng)分,結(jié)果見圖2-c,F4茶樣在香氣(7.50±0.84)、甜度(6.67±0.82)和厚度(7.00±0.89)上都比CK及其他階段接菌茶樣分?jǐn)?shù)高(P<0.05),說(shuō)明其在品質(zhì)上發(fā)生了變化導(dǎo)致香氣更明顯,甜度更高,更醇厚。F4茶樣酸味(1.17±0.41)分?jǐn)?shù)比CK茶樣分?jǐn)?shù)低,說(shuō)明F4接菌導(dǎo)致的成分變化減弱了茶葉的酸味。F1茶樣和F2茶樣在香氣[(5.33±1.03)、(5.83±1.47)]和甜度[(5.83±0.41)、(5.67±0.52)]評(píng)分都低于CK茶樣,說(shuō)明在F1和F2的茶樣香氣和甜度都不如CK茶樣,這兩翻接入酵母菌對(duì)滋味的提升作用不佳。整體而言,第4翻接入酵母菌進(jìn)行強(qiáng)化發(fā)酵,茶味最佳,符合單治國(guó)等[13]研究得出的酒釀酵母菌發(fā)酵茶味醇厚甘爽的結(jié)論,因此,初步確定了第4翻接入酵母菌的方法。

對(duì)發(fā)酵樣品的含水量、水浸出物、可溶性糖、茶多酚、游離氨基酸及兒茶素等化學(xué)成分進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)定(表1和圖3)。發(fā)酵茶樣的可溶性糖含量為4.08%～6.42%。F1、F2與CK相比可溶性糖含量顯著降低(P<0.05),推測(cè)酵母菌可能將可溶性糖當(dāng)作碳源消耗[18],F4的可溶性糖含量顯著升高(P<0.05),推測(cè)在第四翻接入酵母菌會(huì)促進(jìn)糖類物質(zhì)的生成。F2茶樣的茶多酚含量為46.20～77.40 mg/g,加入酵母菌發(fā)酵后F1、F2和F3的茶多酚含量顯著降低。接入酵母菌樣品中,茶褐素含量均增加,其中F1和F4的茶褐素含量顯著增加(P<0.05)。推測(cè)接入酵母菌進(jìn)一步促進(jìn)茶褐素的生成。發(fā)酵過(guò)程中,接入釀酒酵母可以增加茶褐素含量,不接菌和接菌茶樣游離氨基酸含量變化情況也與趙騰飛等[12]研究一致,釀酒酵母可將茶多酚分解產(chǎn)生單糖而改變可溶性糖及茶多酚的含量[10]。

表1 茶樣化學(xué)成分含量

a-可溶性糖含量;b-茶多酚含量;c-茶色素含量

應(yīng)用高效液相色譜法測(cè)定茶樣中兒茶素和氨基酸含量(圖4)。發(fā)酵茶樣的兒茶素含量為7.48～12.05 mg/g,F4的兒茶素含量顯著增加,其中,F4中GC、C、EC和CG的含量顯著高于CK(P<0.05)。茶樣的黃酮及黃酮苷類含量為0.02～0.10 mg/g,F4中花旗松素、楊梅素、木犀草素和山奈酚含量顯著增加(P<0.05)。茶樣的酚酸含量為0.31～1.36 mg/g,F4的鞣花酸含量顯著增加(P<0.05)。茶樣的生物堿含量為5.53～8.42 mg/g,F4的咖啡堿和茶堿含量顯著增加(P<0.05)。茶樣的茶氨酸含量為0.34～1.02 mg/g,F4的茶氨酸和天冬氨酸含量顯著降低(P<0.05)。推測(cè)釀酒酵母對(duì)咖啡堿的生物合成有幫助[19]。

圖4 發(fā)酵茶樣中36種茶葉特征成分含量

綜上,F4茶樣的香氣較為明顯,甜度較高,較為醇厚,同時(shí)酸味較低;可溶性糖、茶褐素、兒茶素、花旗松素、楊梅素、木犀草素、山奈酚、鞣花酸、咖啡堿和茶堿含量均有明顯提高(P<0.05)。因此,第4翻接入釀酒酵母P002的茶樣品質(zhì)最佳,確定第4翻接菌的方法。

2.3 釀酒酵母P002強(qiáng)化發(fā)酵普洱茶

確認(rèn)第4翻接入酵母的方法,并擴(kuò)大進(jìn)行強(qiáng)化接菌發(fā)酵。采用麥芽汁培養(yǎng)基,對(duì)發(fā)酵樣品的真菌菌落計(jì)數(shù),研究發(fā)酵過(guò)程真菌的生長(zhǎng)情況(圖5)。由表2可知,空白樣的真菌菌落數(shù)最少,為4.9×104CFU/g。人工接入酵母菌后S1酵母菌為7.8×105CFU/g。由此可知接入酵母菌發(fā)酵的茶樣,干燥后存在大量酵母菌,表明酵母菌可以在普洱茶的渥堆發(fā)酵過(guò)程中存活,并作用于發(fā)酵過(guò)程。

表2 茶樣酵母菌落數(shù)

圖5 菌落計(jì)數(shù)平板

測(cè)定強(qiáng)化發(fā)酵樣品的含水量、水浸出物、可溶性糖、茶多酚、游離氨基酸、黃酮、兒茶素及生物堿等化學(xué)成分(表3和表4)。強(qiáng)化發(fā)酵樣品的ECG、C、EC、花旗松素、蘆丁、咖啡堿和茶堿的含量顯著高于自然發(fā)酵茶葉(P<0.05),該結(jié)果與強(qiáng)化發(fā)酵接菌階段優(yōu)化茶樣檢測(cè)結(jié)果一致,表明強(qiáng)化發(fā)酵可以提高茶葉品質(zhì),且與之前報(bào)道一致[20]。進(jìn)一步證明在茶葉中接入釀酒酵母強(qiáng)化發(fā)酵可以提高普洱熟茶的品質(zhì)。

表3 普洱茶樣品中生化成分含量

表4 普洱茶樣品中黃酮、兒茶素、生物堿、酚酸的含量 單位:mg/g

對(duì)強(qiáng)化接菌發(fā)酵樣進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)分析。由主成分分析可知發(fā)酵樣CK與S1聚為不同兩簇(圖6-a),兩樣品中優(yōu)勢(shì)菌為酵母目和散囊菌目,相對(duì)豐度分別達(dá)到了99.14%和99.53%(圖6-b)。相對(duì)于CK,釀酒酵母強(qiáng)化顯著改變了微生物的相對(duì)豐度,其中酵母目由CK的45.66%增加到73.31%,而散囊菌目的相對(duì)豐度由53.48%降低到26.22%。

a-真菌群落的主成分分析;b-真菌目水平群落結(jié)構(gòu)

3 結(jié)論

在曬青茶中接種釀酒酵母P002,與其他階段強(qiáng)化接菌發(fā)酵樣相比,經(jīng)第4翻強(qiáng)化接菌發(fā)酵后,其茶多酚、茶褐素和可溶性糖含量顯著增加(P<0.05);與傳統(tǒng)自然發(fā)酵相比,GC、C、EC、CG、花旗松素、楊梅素、木犀草素、山奈酚、鞣花酸、咖啡堿和茶堿的含量顯著提高(P<0.05);茶湯的香氣、甜味、厚重感數(shù)值都有所上升,酸味數(shù)值也有所下降。釀酒酵母P002強(qiáng)化發(fā)酵,增加了酵母目真菌的相對(duì)豐度,降低了散囊菌目的相對(duì)豐度。因此,接種釀酒酵母P002進(jìn)行的強(qiáng)化發(fā)酵,可改變發(fā)酵微生物群落結(jié)構(gòu)和茶葉特征成分含量,進(jìn)而提高感官品質(zhì)。