利用竹基纖維素為碳源生物轉(zhuǎn)化L-乳酸的潛力研究

楊春柳,管秀瓊*,劉春,何明雄,劉林培

1(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院,四川 自貢,643000)

2(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部沼氣科學(xué)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部可再生能源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,生物質(zhì)能技術(shù)研究中心,四川 成都,610041)

L-乳酸廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、日化工業(yè)和其他領(lǐng)域[1]。由于其酸性柔和、性質(zhì)穩(wěn)定且酸度可調(diào),L-乳酸常被用作食品添加劑,并且,L-乳酸還能有效抑制病原微生物的生長(zhǎng),防止食品變質(zhì)[2]。利用L-乳酸作為前體物聚合形成的聚乳酸(polylactic acid,PLA),可生產(chǎn)生物降解塑料、食品綠色包裝材料等,對(duì)改善日益嚴(yán)重的“白色污染”問(wèn)題具有重大意義[3]。目前,國(guó)內(nèi)外均采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-乳酸,但發(fā)酵基質(zhì)多采用糖類、淀粉類為原料,這與“不與人爭(zhēng)糧,不與糧爭(zhēng)地”明顯相悖,不符合可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略要求[4]。因此,生產(chǎn)L-乳酸的主要瓶頸是找到一種適宜的底物發(fā)酵基質(zhì),既價(jià)格低廉又分布廣泛,且不與糧食產(chǎn)業(yè)形成競(jìng)爭(zhēng)。相比之下,利用農(nóng)業(yè)、工業(yè)副產(chǎn)物資源作為生產(chǎn)L-乳酸的碳源,可以避免資源的浪費(fèi),并減弱廢棄物燃燒帶來(lái)的溫室效應(yīng),例如,陳曉佩等[5]利用玉米芯生產(chǎn)低聚木糖廢渣酶解碳源,在初始葡萄糖59.6 g/L,產(chǎn)L-乳酸7 g/L,糖酸轉(zhuǎn)化率僅為28.9%;楊雪欣等[6]利用大豆秸稈酶水解液中的可溶性糖,添加乳酸菌發(fā)酵L-乳酸,其糖酸轉(zhuǎn)化率為71.05%;WANG等[7]以蘆葦制漿廠產(chǎn)生的蘆葦鋸末為原料,預(yù)處理后采用分步水解發(fā)酵工藝,在以酶解液為碳源的情況下所產(chǎn)生的L-乳酸含量小于5 g/L。造紙工業(yè)中,竹材因表現(xiàn)出較好的制漿性能而成為非木漿的主要原料[8],梁川等[9]認(rèn)為竹漿紙發(fā)展空間巨大,在良好的政策背景下具有廣闊的前景,但竹材在制漿備料過(guò)程中,會(huì)產(chǎn)生3%～5%的竹屑,通常作為燃料使用,經(jīng)濟(jì)價(jià)值低,也是生物質(zhì)資源的浪費(fèi)。竹屑廢棄物中碳水化合物(纖維素、半纖維素)含量較高,且竹屑中的半纖維素可用于制備木糖[10],而利用竹屑中的纖維素作為一種新的碳源發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的研究較少。因此,本課題以竹屑為原料,利用蒸汽爆破預(yù)處理打破木質(zhì)纖維素的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),將提取半纖維素后的竹屑采用分步糖化發(fā)酵工藝,對(duì)工藝關(guān)鍵參數(shù)生物轉(zhuǎn)化所得L-乳酸的影響進(jìn)行研究,為竹基纖維素的利用提供了高值化途徑參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

竹屑,某紙業(yè)公司原料場(chǎng);纖維素酶(≥700 units/g,最佳作用條件:pH 4.8、50 ℃),Sigma公司;凝結(jié)芽孢桿菌,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部沼氣科學(xué)研究所;3,5-二硝基水楊酸、無(wú)水葡萄糖、氫氧化鈉、亞硫酸氫鈉、苯酚、酒石酸鉀鈉均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1200 series高效液相色譜,安捷倫科技有限公司;THZ-98AB恒溫振蕩培養(yǎng)箱,一恒科學(xué)儀器有限公司;FE28pH計(jì),梅特勒-托利多儀器有限公司;UV-1800紫外分光光度計(jì),上海美譜達(dá)儀器有限公司;TESCAN VEGA3SBU掃描電子顯微鏡,捷克TESCAN公司;XFlash Detector 410-M能譜儀,德國(guó)布魯克公司;MS3000E激光粒度分析儀,英國(guó)馬爾文儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化

將在-80 ℃下保藏的凝結(jié)芽孢桿菌室溫下解凍后,在超凈工作臺(tái)中用接種環(huán)蘸取甘油菌,劃線于MRS固體培養(yǎng)基上,放到50 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h;挑取MRS固體培養(yǎng)基上的單菌落接種于15 mL MRS液體培養(yǎng)基中,在50 ℃、150 r/min下培養(yǎng)10～12 h,為一級(jí)種子液;再吸取上述種子液10%(體積分?jǐn)?shù))接種到新鮮MRS液體培養(yǎng)基中,在50 ℃、150 r/min下培養(yǎng)12 h,得到菌懸液。

1.3.2 竹屑預(yù)處理

收集過(guò)1 mm篩孔的竹屑在烘箱溫度105 ℃下烘干備用,取一定質(zhì)量的竹屑廢棄物調(diào)節(jié)水分至55%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))并放入密封袋中平衡水分,利用圖1中的QBS-80型蒸汽爆破分析試驗(yàn)臺(tái)[11],在爆破壓力2.5 MPa、維壓時(shí)間3 min條件下對(duì)竹屑進(jìn)行蒸汽爆破預(yù)處理,收集爆破渣備用。

圖1 竹基纖維素的制備及實(shí)驗(yàn)工藝流程

1.3.3 竹基纖維素的制備及實(shí)驗(yàn)工藝流程

將蒸汽爆破預(yù)處理后的竹屑在苯-乙醇混合液[2體積的苯及1體積的95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液]中利用索氏抽提器抽提6 h,烘干后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的NaOH溶液按照料液比1∶35(g∶mL)在70 ℃、80 r/min恒溫水浴振蕩浸提5 h(包括超聲15 min)。剩余的竹基纖維素廢渣(簡(jiǎn)稱“竹渣”)作為碳源用于L-乳酸的發(fā)酵試驗(yàn)。

1.3.4 分步水解發(fā)酵

1.3.4.1 酶解工藝的優(yōu)化

固定酶解體系100 mL,稱取一定質(zhì)量“竹渣”于250 mL三角瓶中,添加纖維素酶(30、45、60、75、90 FPU/g),加入去離子水使總固體(total solids,TS)質(zhì)量濃度為(20、50、80、110、140 g/L),再利用H2SO4或NaOH調(diào)整pH值為4.8,置于50 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)箱進(jìn)行酶解反應(yīng)(0、2、4、15、17…72 h)。反應(yīng)結(jié)束后用高速冷凍離心機(jī)(13 500 r/min,5 min)離心酶解液,經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾,適當(dāng)稀釋后用高效液相色譜分析可發(fā)酵糖含量。

1.3.4.2 發(fā)酵工藝的優(yōu)化

“竹渣”首先按上述酶解方法進(jìn)行酶解,然后將酶解液混合均勻(不過(guò)濾)用于發(fā)酵。發(fā)酵采用250 mL三角瓶,固定發(fā)酵體系150 mL,調(diào)節(jié)發(fā)酵初始pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0),加入酵母粉(20 g/L)為氮源,用高壓蒸汽滅菌115 ℃下滅菌15 min,待冷卻后在無(wú)菌條件下接種菌株,初始接種量分別為5%、10%、15%、20%(體積分?jǐn)?shù)),于50 ℃、150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)(0、2、4、15、17…72 h),發(fā)酵結(jié)束后在無(wú)菌條件下取樣并用高速離心機(jī)(13 500 r/min,5 min)離心發(fā)酵液,經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾,適當(dāng)稀釋后用高效液相色譜測(cè)定L-乳酸濃度。

1.3.5 纖維素酶活力的測(cè)定

纖維素酶活力的測(cè)定采用GHOSE[12]所述方法。測(cè)得濾紙酶活為193 FPU/mL。

1.3.6 預(yù)處理后樣品酶水解

將蒸汽爆破預(yù)處理得到的爆破渣放入三角瓶用于酶解試驗(yàn),實(shí)驗(yàn)條件:TS質(zhì)量濃度20 g/L、酶添加量20 FPU/g、調(diào)節(jié)酶解液pH值為4.8,在50 ℃、120 r/min條件下于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中反應(yīng)24 h,過(guò)濾,測(cè)定還原糖濃度。

1.3.7 “竹渣”成分的測(cè)定

“竹渣”粉碎過(guò)篩,截取能通過(guò)0.38 mm篩孔而不能通過(guò)0.25 mm篩孔的細(xì)末備用。水分含量的測(cè)定:根據(jù)GB/T 2677.2—2011《造紙?jiān)纤值臏y(cè)定》;纖維素含量的測(cè)定:參照硝酸-乙醇法[13];半纖維素含量的測(cè)定:參照范式洗滌法[14]。灰分含量測(cè)定:根據(jù)GB/T 742—2018《造紙?jiān)?、紙漿、紙和紙板 灼燒殘余物(灰分)的測(cè)定(575 ℃和900 ℃)》;苯-醇抽出物測(cè)定:根據(jù)GB/T 2677.6—1994《造紙?jiān)嫌袡C(jī)溶劑抽出物含量的測(cè)定》;酸不溶木素含量測(cè)定:根據(jù)GB/T 2677.8—1994《造紙?jiān)纤岵蝗苣舅睾康臏y(cè)定》。

1.3.8 掃描電子顯微鏡-能譜分析

取適量蒸汽爆破預(yù)處理前后的干燥樣品(0.075 mm),用離子濺射儀對(duì)竹屑纖維表面鍍金制作樣品。在加速電壓為20 kV下對(duì)纖維的表面形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。利用電鏡配套能譜儀進(jìn)一步分析C元素分布情況。

1.3.9 粒度分布檢測(cè)

取適量蒸汽爆破預(yù)處理前后的干燥樣品(0.075 mm),以去離子水為分散劑,攪拌轉(zhuǎn)速為13 000 r/min,測(cè)定溫度為25 ℃。其d(90)表示一個(gè)樣品的累次粒度分布數(shù)達(dá)到90%時(shí)所對(duì)應(yīng)的粒徑。

1.3.10 高效液相色譜檢測(cè)

利用高效液相色譜儀測(cè)量酶解液中的可發(fā)酵糖濃度和發(fā)酵液L-乳酸濃度。色譜測(cè)定條件:HPX-87H色譜柱,柱溫35 ℃,示差折光檢測(cè)器檢測(cè)器(differential refractive index detector,RID)40 ℃,流動(dòng)相5 mmol/L H2SO4,流速0.6 mL/min,進(jìn)樣量20 μL,進(jìn)樣檢測(cè)時(shí)間30 min。糖酸生物轉(zhuǎn)化率[5]計(jì)算方法如公式(1)所示:

糖酸生物轉(zhuǎn)化率/%=

(1)

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,數(shù)據(jù)結(jié)果采用Origin 2021、PowerPoint 2016和 SPSS 22.0 軟件進(jìn)行作圖及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)處理對(duì)酶解還原糖釋放量的影響

將蒸汽爆破預(yù)處理前后的竹屑原料按照1.3.6節(jié)方法進(jìn)行酶解反應(yīng),結(jié)果表明,未經(jīng)蒸汽爆破預(yù)處理的竹屑原料酶解還原糖釋放量為(0.13±0.01) g/L,經(jīng)過(guò)蒸汽爆破預(yù)處理后的竹屑原料酶解還原糖釋放量為(2.07±0.10) g/L,比未經(jīng)蒸汽爆破預(yù)處理的酶解還原糖釋放量提高了15.9倍,兩者的酶解還原糖釋放量具有顯著性差異。由圖2-a、圖2-b看出,蒸汽爆破預(yù)處理后的竹屑纖維表面由于泄壓過(guò)程產(chǎn)生的機(jī)械剪切力而被撕裂,使纖維表面區(qū)域擴(kuò)張,增大了纖維的反應(yīng)表面積,利于纖維素酶酶液的滲透。從圖2-c、圖2-d可以看出,C元素在經(jīng)過(guò)蒸汽爆破預(yù)處理之后明顯分布更密集,說(shuō)明預(yù)處理使更多的纖維素暴露出來(lái),為提高酶解還原糖的釋放量創(chuàng)造了條件。姜曉云[15]在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)原料還原糖產(chǎn)量隨著粒徑的減小而增大,本實(shí)驗(yàn)也對(duì)蒸汽爆破預(yù)處理前后的竹屑進(jìn)行粒徑分析。如圖3-a所示,蒸汽爆破預(yù)處理前后原料d(90)分別是126.209、108.999 μm;結(jié)合圖3-b和圖3-c可以看出蒸汽爆破預(yù)處理后的竹屑更加膨松,造成粒徑d(90)差異大的原因可能是結(jié)構(gòu)松散,內(nèi)部空隙增加,機(jī)械強(qiáng)度降低[16]。以上說(shuō)明蒸汽爆破預(yù)處理可以顯著提高竹屑原料的酶解還原糖釋放量。

a-未經(jīng)預(yù)處理竹屑原料微觀形貌;b-經(jīng)蒸汽爆破預(yù)處理后竹屑原料微觀形貌;c-未經(jīng)預(yù)處理竹屑原料C元素分布圖;d-蒸汽爆破預(yù)處理后竹屑原料C元素分布圖

a-蒸汽爆破預(yù)處理前后竹屑粒徑分析;b-未處理竹屑原料宏觀形貌;c-蒸汽爆破預(yù)處理后竹屑原料宏觀形貌

2.2 “竹渣”的成分分析

將“竹渣”按照1.3.7節(jié)方法進(jìn)行成分分析,結(jié)果表明,“竹渣”水分占比“竹渣”試樣原質(zhì)量的7.84%?！爸裨钡闹饕瘜W(xué)成分是纖維素,其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為73.3%,可以作為發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的底物基質(zhì),為菌株的生長(zhǎng)代謝提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)—碳源?；曳值馁|(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.18%、苯醇抽出物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.59%,兩者成分較低的原因可能是在超聲波輔助堿液提取半纖維素后清洗“竹渣”的過(guò)程中被水帶走?！爸裨敝兴岵蝗苣舅爻煞值馁|(zhì)量分?jǐn)?shù)為14.96%,較未經(jīng)任何處理竹屑原料的酸不溶木素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低了2.14%,何娟[17]在研究中發(fā)現(xiàn)木素的脫除有利于降低物料表面的疏水性和提高其纖維可及度,從而提高酶水解效率。本實(shí)驗(yàn)將其作為發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的底物基質(zhì)。

2.3 酶解實(shí)驗(yàn)

2.3.1 酶解時(shí)間對(duì)酶解還原糖釋放量的影響

如圖4所示,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),由大量葡萄糖基構(gòu)成的鏈狀高分子化合物纖維素糖苷鍵逐步斷裂成小分子葡萄糖,總糖(葡萄糖+木糖)含量逐漸提高;在反應(yīng)初始階段還原糖濃度上升趨勢(shì)增長(zhǎng)快速,反應(yīng)到14 h后,上升速率逐漸變緩;在酶水解前期,產(chǎn)率(以總糖計(jì))快速下降后趨于平緩,其主要原因是隨著酶解體系中糖濃度的增加,纖維素酶受到反饋抑制作用[18]。酶解54 h后總糖含量已無(wú)顯著性變化(P>0.05)。因此,可以確定酶解糖化時(shí)間為54 h。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)酶解還原糖釋放量的影響

2.3.2 酶添加量對(duì)酶解還原糖釋放量的影響

酶液添加量對(duì)酶解還原糖釋放量的影響如圖5-a所示,隨著酶添加量的提高,還原糖濃度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),在酶添加量60 FPU/g達(dá)到峰值。當(dāng)酶添加量小于60 FPU/g,此時(shí)底物足夠多,酶分子愈多,則底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物也更多,意味著底物的有效轉(zhuǎn)化率隨著酶添加量的增加而成直線地增加[19]。因此,在酶添加量15～60 FPU/g出現(xiàn)線性擬合趨勢(shì),如圖5-b所示。其擬合曲線公式為:y=0.131 8x+2.970 8,R2=0.988 6。當(dāng)酶量過(guò)高時(shí),由于酶與底物結(jié)合達(dá)到飽和狀態(tài),再增加酶量會(huì)造成反饋抑制作用使酶解還原糖釋放量降低。因此,可以確定酶添加量為60 FPU/g。

a-酶添加量對(duì)酶解還原糖釋放量的影響;b-酶添加量15～60 FPU/g的總糖濃度線性擬合圖

2.3.3 總固體濃度對(duì)酶解還原糖釋放量的影響

如圖6所示,隨著總固體濃度的上升,釋放的還原糖濃度總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。當(dāng)總固體濃度增加至14%,釋放還原糖的速率低于總固體濃度11%。由于反應(yīng)是非均相反應(yīng),反應(yīng)器中傳質(zhì)阻力加大,還原糖濃度增加,而產(chǎn)物的抑制和酶的擴(kuò)散受阻更加明顯。因此,底物濃度在一個(gè)適宜的范圍內(nèi)即可。

圖6 總固體濃度對(duì)酶解還原糖釋放量的影響

2.4 糖化液的L-乳酸發(fā)酵

2.4.1 初始接種量對(duì)產(chǎn)L-乳酸的影響

菌株的初始接種量對(duì)發(fā)酵影響較顯著,接種量低會(huì)導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)緩慢,產(chǎn)酸速率低,發(fā)酵周期長(zhǎng);接種量過(guò)高會(huì)使菌體生長(zhǎng)過(guò)快,造成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏而不利于發(fā)酵。如圖7所示,在初始接種量為5%時(shí),與其他初始接種量條件下發(fā)酵液中L-乳酸的濃度具有顯著性差異(P<0.05)。因此,選擇菌株的初始接種量為5%較適宜。

圖7 初始接種量對(duì)產(chǎn)L-乳酸的影響

2.4.2 初始pH對(duì)產(chǎn)L-乳酸的影響

不同初始pH發(fā)酵環(huán)境條件下,其對(duì)發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的影響如圖8所示。隨著發(fā)酵初始pH的增加,L-乳酸的濃度逐漸上升;在pH 6.5時(shí),L-乳酸濃度顯著高于pH 5.0、5.5、6.0(P<0.05),而調(diào)節(jié)pH值為7.0時(shí),與pH 6.5時(shí)發(fā)酵液中L-乳酸濃度不具有顯著性差異(P>0.05),且糖酸轉(zhuǎn)化率在pH 6.5時(shí)最高。由于菌體在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中不斷產(chǎn)生的L-乳酸使發(fā)酵環(huán)境pH改變,進(jìn)而改變生長(zhǎng)環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的可及性及有害物質(zhì)的毒性[20]。因此,通過(guò)酸堿溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵初始pH值為6.5較適宜。

圖8 初始pH對(duì)產(chǎn)L-乳酸的影響

2.4.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)L-乳酸的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)L-乳酸的影響如圖9所示。殘存的糖濃度隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而下降,菌體代謝產(chǎn)物L(fēng)-乳酸及糖酸轉(zhuǎn)化率隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),與張竇[21]研究結(jié)果一致。當(dāng)發(fā)酵17 h時(shí)達(dá)到L-乳酸濃度峰值,其糖酸轉(zhuǎn)化率也達(dá)到最大值。發(fā)酵時(shí)間超過(guò)17 h后,發(fā)酵體系中的L-乳酸濃度與糖酸轉(zhuǎn)化率都開始下降。其原因是L-乳酸發(fā)酵是葡萄糖經(jīng)糖酵解生成丙酮酸后還原的結(jié)果,所得產(chǎn)物L(fēng)-乳酸還能進(jìn)一步被降解[22]。因此,選擇發(fā)酵時(shí)間17 h較適宜。

圖9 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)L-乳酸的影響

3 結(jié)論

a)蒸汽爆破法作為預(yù)處理手段可提高竹屑原料酶水解效率,通過(guò)SEM&EDS和粒度分析得出蒸汽爆破過(guò)程中纖維表面被機(jī)械撕裂和C元素的增加以及d(90)粒度分布的顆粒較小是纖維素酶酶解效率提高的主要原因。

b)竹渣主要成分是纖維素,以此為碳源研究了分步糖化發(fā)酵關(guān)鍵參數(shù)對(duì)酶解發(fā)酵的影響。在TS質(zhì)量濃度140 g/L、酶添加量60 FPU/g、酶解54 h條件下糖化,總糖質(zhì)量濃度可達(dá)31.19 g/L。將糖化液用于發(fā)酵試驗(yàn),在起始糖質(zhì)量濃度19.43 g/L,發(fā)酵初始pH 6.5、菌株的初始接種量5%、發(fā)酵17 h條件下,L-乳酸質(zhì)量濃度可達(dá)6.28 g/L,其糖酸轉(zhuǎn)化率高達(dá)80.87%。本研究結(jié)果為竹基纖維素生物轉(zhuǎn)化L-乳酸提供了一定的參考依據(jù)。