鴨疫里默氏菌的分離和鑒定

張 程

沭陽縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,江蘇 沐陽 223600

0 引言

鴨疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer)屬于黃桿菌科、里氏桿菌屬,為革蘭氏陰性短小桿菌,無芽孢,不能運動,有莢膜,瑞氏染色呈兩極濃染[1]。對培養(yǎng)鴨疫里默氏桿菌的營養(yǎng)條件有較高的要求,在普通培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基上無法生長,在鮮血瓊脂平板上不溶血。該菌不發(fā)酵糖類,不產(chǎn)生吲哚和硫化氫,不還原硝酸鹽[2]。

鴨疫里默氏菌易引發(fā)雛鴨的鴨疫里默氏菌病,又稱鴨傳染性漿膜炎,呈現(xiàn)急性、慢性或敗血癥感染[3-4]。病鴨臨床表現(xiàn)為排出綠色稀糞、眼睛和鼻子分泌物增多[5],常伴有角弓反張等神經(jīng)癥狀。其大體病理變化主要為氣囊渾濁,心包膜出現(xiàn)纖維素性炎癥,少數(shù)情況會出現(xiàn)輸卵管炎并在輸卵管內(nèi)有干酪樣沉淀物,該病的病理變化與鴨沙門氏菌和致病性大腸桿菌感染的病理變化相似,故若要確診須進行鑒別診斷,并進行微生物的分離鑒定[6]。

鴨疫里默氏菌在鴨場中較為常見,廣泛存在于土壤、水源、鴨舍等,在鴨子體表、黏膜、鼻咽等部位均有寄生,容易引發(fā)動物感染、食品污染導(dǎo)致動物發(fā)病、食物中毒等。該細菌是存在于動物皮膚表面的一種常在菌,通常情況下不侵入機體體內(nèi),多見于水平傳播,可通過破損的皮膚或黏膜、消化道、呼吸道、汗腺、毛囊等侵入機體,感染途徑較多。同時,該病易受外界應(yīng)激因素影響,例如惡劣環(huán)境、驚嚇、外傷感染、晝夜溫差等均可成為該病流行暴發(fā)的誘因[7]。

鴨疫里默氏菌病在全世界的流行范圍十分廣泛,因鴨疫里默氏菌感染導(dǎo)致養(yǎng)殖場出現(xiàn)大面積畜禽發(fā)病死亡的事件也越來越多,因此對該病做到早發(fā)現(xiàn)、早治療,并采取一定的措施進行預(yù)防,顯得尤為重要[8]。為明確病因,本文通過采集病料進行實驗室診斷,經(jīng)細菌分離鑒定及PCR檢測及基因測序方法,明確從規(guī)模化鴨場分離得到的細菌為鴨疫里默氏菌。

1 材料和方法

1.1 材料

1)從某養(yǎng)殖場患有鴨疫里默氏菌病的病鴨中進行病料采集,在無菌操作環(huán)境下,從肝臟和心包液中分離出細菌。

2)試驗儀器如表1所示。

表1 主要儀器及生產(chǎn)廠家

3)主要試劑見表2。

表2 主要試劑

4)其他試驗材料和儀器:蒸汽高壓鍋、電泳槽、電泳儀、移液器、微量加樣器、PCR儀、顯微鏡、瓊脂粉、瓊脂糖、電子天平、去離子純水機、臺式pH測試儀、低溫冰柜、水浴震蕩培養(yǎng)箱。

5)引物。按照GenBank提交的RA細菌16S rRNA基因序列,在運用引物設(shè)計軟件設(shè)計一對擴增該基因的引物,PAGE純化,進行普通PCR反應(yīng),并作電泳檢測,引物序列如下。

上游引物:5’- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

下游引物:5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’

目的片段大小約為1 500 bp,由通用生物公司合成引物。

6)生化培養(yǎng)管 :甘露醇、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、尿素、VP、甲基紅試驗、靛基質(zhì)、硫化氫、硝酸鹽還原、檸檬酸鹽微量發(fā)酵管等,過氧化氫酶、用于RA的生化試驗。

1.2 方法

1.2.1 鮮血瓊脂培養(yǎng)基的制備

將高壓滅菌的胰酶大豆瓊脂冷卻至50 ℃左右,在無菌操作條件下,將10%的無菌兔血加入胰酶大豆瓊脂中,迅速搖勻,再迅速倒入無菌培養(yǎng)皿中。待鮮血瓊脂培養(yǎng)基冷卻,置于37 ℃培養(yǎng)箱待24 h后進行無菌檢測。

1.2.2 革蘭氏染色

無菌條件下剪取肝臟,作為病料,用接種環(huán)在培養(yǎng)基平板上進行劃線,置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h,觀察菌落形態(tài),挑取可疑單菌落進行連續(xù)純化培養(yǎng)后進行革蘭氏染色,鏡檢。革蘭氏染色過程如下。

①涂片:將載玻片用酒精球擦拭后,在載玻片上做好標(biāo)記,取少許PBS溶液均勻涂于玻片上,將接種環(huán)在酒精燈上滅菌后,挑取單菌落涂于玻片上的PBS溶液里,均勻涂開。②固定:待載玻片表面干燥后,使其快速通過酒精燈火焰1～2次,注意不可使載玻片溫度過高。③初染:滴加結(jié)晶紫染液使其均勻覆蓋載玻片表面,1 min后水洗,甩干。④媒染:滴加碘液以覆蓋載玻片表面,1 min后洗滌并甩干。⑤脫色:滴加少許酒精溶液,覆蓋涂面,時間不可過長,20～30 s后水洗,甩干。⑥復(fù)染:滴加1～2滴復(fù)紅染料,1 min后洗滌并甩干。⑦用吸水紙吸去殘余液體,等待玻片干燥,滴加香柏油,鏡檢。

1.2.3 鴨疫里默氏菌的生化實試驗

按照說明書上的標(biāo)準(zhǔn)方法進行操作,在無菌操作下,挑取RA單菌落接種于各生化試驗管中,接種完畢后,放進37 ℃恒溫箱培養(yǎng),期間注意觀察其顏色變化,以及有無氣泡等。

1.2.4 鴨疫里默氏菌16S rRNA PCR擴增

對已純化的細菌進行細菌16S rRNA PCR擴增,獲得的目的條帶送至通用生物公司測序。16S rRNA PCR主要步驟如下。

1)細菌DNA的提取。挑取單菌落接種于LB肉湯中,于37 ℃搖床中培養(yǎng)24 h;取1 mL菌液于EP管中,10 000 r/min離心10 min;棄上清,加100 μL ddH2O,吹打至均勻;100 ℃沸水浴10 min后,立即轉(zhuǎn)入-20 ℃冰浴10 min;以10 000 r/min離心10 min后,上清液為DNA模板,取上清液置于EP管中。

2)細菌的16S rRNA PCR擴增。用提取的細菌DNA為模板進行PCR擴增,PCR體系如表3所示,PCR反應(yīng)程序如表4所示。

表3 鴨疫里默氏菌的16S rRNA PCR體系 單位:μL

表4 鴨疫里默氏菌PCR反應(yīng)程序

3)PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳。配制1%的瓊脂糖凝膠,在100 V條件下進行瓊脂糖凝膠電泳30 min,分析PCR產(chǎn)物,于凝膠圖象分析成像儀中觀察電泳條帶。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果

2.1.1 鴨疫里默氏菌的分離培養(yǎng)

血平板上鴨疫里默氏菌生長良好,菌落不溶血,呈乳白色、圓形、微突起,針尖大小、表面光滑的小菌落,鮮血瓊脂培養(yǎng)基上鴨疫里默氏菌的菌落形態(tài)如圖1所示。

圖1 鮮血瓊脂培養(yǎng)基上鴨疫里默氏菌的菌落形態(tài)

2.1.2 鴨疫里默氏菌革蘭氏染色鏡檢

對分離得到的鴨疫里默氏菌進行革蘭氏染色鏡檢,鏡檢發(fā)現(xiàn)視野中出現(xiàn)紫紅色呈橢圓形的短小桿菌,RA為革蘭氏陰性菌,鴨疫里默氏菌革蘭氏染色菌體形態(tài)如圖2所示。

圖2 鴨疫里默氏菌革蘭氏染色菌體形態(tài)

2.1.3 鴨疫里默氏菌生化試驗結(jié)果

試驗結(jié)果表明:鴨疫里默氏菌(RA)不發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露糖、果糖,不產(chǎn)生硫化氫,過氧化氫酶,尿素試驗呈陽性,MR試驗、VP試驗、靛基質(zhì)試驗、硝酸鹽還原試驗、檸檬酸鹽利用試驗均為陰性。該結(jié)果符合鴨疫里默氏菌(RA)的生化反應(yīng)特征,鴨疫里默氏菌菌生化試驗結(jié)果如圖3所示。

圖3 鴨疫里默氏菌生化試驗結(jié)果

2.1.4 鴨疫里默氏菌16S rRNA PCR檢測

配制1%瓊脂糖凝膠,將獲得的PCR產(chǎn)物進行電泳檢測。結(jié)果顯示獲得約1 500 bp的目的條帶,該條帶與預(yù)期的條帶大小相匹配(見圖4,泳道2所示)。

注:泳道1為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量DL2000 Marker;泳道2為RA的PCR檢測結(jié)果。

將擴增的PCR產(chǎn)物送至生物公司進行測序,將測序得到的基因序列與NCBI上其他菌株進行同源性Blast比對,得出測序比較結(jié)果如表5所示。

表5 分離菌株16S rRNA同源性比較

結(jié)果表明,分離的菌株16S rRNA與NCBI公布的鴨疫里默氏菌序列同源性達到99%以上,進一步證明了該分離菌株為鴨疫里默氏菌。

2.2 討論

對鴨疫里默氏菌(RA)進行分離鑒定研究,通過細菌分離培養(yǎng)、染色鏡檢形態(tài)觀察、生化試驗以及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)特異性擴增、產(chǎn)物測序鑒定方法等方面對分離得到的鴨疫里默氏菌(RA)進行鑒定。本研究分離得到的鴨疫里默氏菌(RA)在血平板上生長良好,菌落不溶血,呈乳白色,圓形、微突起,針尖大小,表面光滑的小菌落。鴨疫里默氏菌(RA)菌體無芽孢,無鞭毛,自身不運動。本研究結(jié)果為及時治療病鴨,防止疾病傳播,減少養(yǎng)鴨場的經(jīng)濟損失具有重要意義。

藥物治療是治療鴨疫里默氏菌病的主要措施之一,治療原則為早發(fā)現(xiàn)、早確診、早治療[9-12]。治療用藥物一般為抗菌藥物,但由于鴨疫里默氏菌耐藥性較強,在使用抗菌藥治療前,最好先分離純化出病原菌,進行藥敏試驗,然后挑選最敏感的藥物進行臨床治療。

在進行病理剖檢時,發(fā)現(xiàn)患有鴨疫里默氏菌病的雛鴨臨床上表現(xiàn)出腹瀉、喘氣、咳嗽等癥狀。眼睛和鼻子的分泌物增多,眼睛周圍會形成“眼圈”,常常會出現(xiàn)頭頸震顫和共濟失調(diào),部分病鴨出現(xiàn)神經(jīng)癥狀,最終死亡[13-15]。

在鴨養(yǎng)殖過程中,為有效控制鴨疫里默氏菌感染[16],可采取以下措施:加強飼養(yǎng)管理,提供全價的飼料喂養(yǎng),同時安排合理的飼養(yǎng)密度,加強通風(fēng)換氣,做好溫度和濕度的調(diào)控;做好預(yù)防接種,制定科學(xué)的免疫程序,提高動物特異性免疫水平;切斷傳播途徑,定期消毒,殺蟲,滅鼠,保證畜舍衛(wèi)生環(huán)境,做好消毒;發(fā)現(xiàn)病鴨應(yīng)及時隔離;避免外界病原菌的帶入。

3 結(jié)束語

在預(yù)防鴨疫里默氏菌感染的過程中,準(zhǔn)確診斷,科學(xué)用藥。隨著細菌耐藥性持續(xù)上升,可供臨床上選擇藥物范圍越來越窄,因此在用藥前需要根據(jù)實際情況,分離鑒定病原菌進行藥敏實驗,從而選擇合適藥物。