共培養(yǎng)條件下肌衛(wèi)星細(xì)胞C2C12對(duì)軟骨細(xì)胞ATDC5活性的影響

陳澤華,王毅,申震,李俊毅,歐梁

(1.株洲市中醫(yī)傷科醫(yī)院,湖南 株洲 412007;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510095;3.昆明市中醫(yī)醫(yī)院,云南 昆明 650599;4.湖南省中醫(yī)藥研究院,湖南 長(zhǎng)沙 410006)

肌衛(wèi)星細(xì)胞是出生后肌肉組織中唯一一類具有分裂能力的肌肉源性干細(xì)胞,可通過(guò)激活、增殖和分化,參與肌肉再生、重塑和損傷修復(fù)[1]。肌衛(wèi)星細(xì)胞在正常情況下保持靜止?fàn)顟B(tài),當(dāng)骨骼肌受到損傷時(shí),肌衛(wèi)星細(xì)胞被激活并增殖,同時(shí)表達(dá)成肌調(diào)節(jié)因子,加速其成肌分化,形成新的肌細(xì)胞[2]。肌衛(wèi)星細(xì)胞的數(shù)量和功能是維持成人骨骼肌質(zhì)量和功能的關(guān)鍵。肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量減少和增殖、分化的可塑性下降是導(dǎo)致骨骼肌萎縮的重要原因,同時(shí)肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量減少也被認(rèn)為是老年人骨骼肌衰減的重要原因[3-4]。研究表明,骨骼肌萎縮(包括肌纖維變細(xì)和纖維數(shù)量減少)與膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)的發(fā)生關(guān)系密切[5-7]。與健康人群相比,KOA患者股四頭肌中肌衛(wèi)星細(xì)胞密度下降,肌纖維類型改變[8]。肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量減少會(huì)阻礙骨骼肌的再生和修復(fù),進(jìn)一步加重骨骼肌萎縮。然而,骨骼肌萎縮狀態(tài)下肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖活力減弱,是否會(huì)影響軟骨細(xì)胞的活性,目前還不得而知。為此,本研究觀察了共培養(yǎng)條件下肌衛(wèi)星細(xì)胞對(duì)軟骨細(xì)胞活性的影響,以期為探索肌肉萎縮與KOA之間的關(guān)系,以及通過(guò)改善肌肉萎縮治療KOA提供依據(jù)。

1 材料和儀器

C2C12小鼠成肌細(xì)胞、ATDC5小鼠成軟骨細(xì)胞系(上海中喬新舟生物科技有限公司),胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗溶液(Gibco公司),DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司),孔徑8 μm和0.4 μm 的24孔Transwell小室(Corning公司),CCK8試劑(Biosharp公司),地塞米松磷酸鈉注射液(天津金耀藥業(yè)有限公司),BCA蛋白定量試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司),二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(2′,7′-dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)活性氧熒光探針(北京索萊寶科技有限公司),Varioskan多功能酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific公司),DMi8熒光顯微鏡(Leica公司)。

2 方 法

2.1 細(xì)胞傳代培養(yǎng)

C2C12細(xì)胞和ATDC5細(xì)胞均采用常規(guī)培養(yǎng)基(4 mL胎牛血清+400 μL青霉素-鏈霉素雙抗溶液+35.6 mLDMEM高糖培養(yǎng)基)在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔天換液1次,當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)按1∶3傳代。取第3代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 地塞米松對(duì)C2C12細(xì)胞活性影響的觀察

2.2.1地塞米松對(duì)C2C12細(xì)胞增殖的影響 取C2C12細(xì)胞,按照每孔5×103個(gè)接種至96孔板中,分為對(duì)照組和地塞米松組,每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔,采用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)(條件、方法同2.1)。待細(xì)胞融合度達(dá)到50%～60%時(shí),對(duì)照組繼續(xù)以常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng),地塞米松組改用地塞米松培養(yǎng)基培養(yǎng)(50 μL地塞米松磷酸鈉注射液+48 mL常規(guī)培養(yǎng)基)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,2組均改用檢測(cè)培養(yǎng)基培養(yǎng)(每孔90 μL常規(guī)培養(yǎng)基、10 μL CCK8試劑),設(shè)置空白孔,繼續(xù)培養(yǎng)1 h后采用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值(波長(zhǎng)為460 nm)。細(xì)胞增殖率=(地塞米松組OD值-空白孔OD值)/(對(duì)照組OD值-空白孔OD值)×100%。

2.2.2地塞米松對(duì)C2C12細(xì)胞蛋白合成的影響 取C2C12細(xì)胞,按照每孔5×103個(gè)接種至6孔板中,分為對(duì)照組和地塞米松組,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,采用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)(條件、方法同2.1)。待融合度達(dá)到90%時(shí),對(duì)照組繼續(xù)以常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng),地塞米松組改用地塞米松培養(yǎng)基培養(yǎng)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,吸棄培養(yǎng)基,用PBS漂洗1遍,加入100 μL裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1),于冰上裂解5 min,刮下細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中,以12 000 r·min-1離心10 min(離心半徑 6 cm)。吸取上清液,稀釋6倍,按照BCA試劑盒操作步驟,在酶標(biāo)儀中測(cè)定OD值(波長(zhǎng)562 nm)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度計(jì)算公式計(jì)算樣品的測(cè)定濃度,測(cè)定濃度的6倍即為原液的蛋白含量。

2.2.3地塞米松對(duì)C2C12細(xì)胞修復(fù)能力的影響 取C2C12細(xì)胞,按照每孔1×105個(gè)接種至24孔板中,分為對(duì)照組和地塞米松組,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,采用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)(條件、方法同2.1)。待融合度達(dá)到90%時(shí),用200 μL移液槍垂直劃一條直線,用PBS漂洗2次,去除劃下的細(xì)胞。對(duì)照組繼續(xù)以常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng),地塞米松組改用地塞米松培養(yǎng)基培養(yǎng)。24 h后拍照觀察,采用Image J軟件測(cè)量劃痕面積,計(jì)算細(xì)胞傷口修復(fù)率,修復(fù)率=(初始面積-24 h面積)/初始面積×100%。

2.2.4地塞米松對(duì)C2C12細(xì)胞遷移能力的影響 將孔徑為8 μm的Transwell小室置于24孔板中,采用不含胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基將C2C12細(xì)胞重懸,調(diào)整密度,接種至上層小室內(nèi)(200 μL,約1×105個(gè)),分為對(duì)照組和地塞米松組,每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組下層小室內(nèi)加入600 μL常規(guī)培養(yǎng)基,地塞米松組下層小室內(nèi)加入600 μL地塞米松培養(yǎng)基。分別于24 h和48 h后,吸棄下層小室的培養(yǎng)基,用4%多聚甲醛室溫固定15 min,PBS漂洗3遍,0.1%的結(jié)晶紫室溫染色10 min,再用PBS漂洗3遍,鏡下每孔隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照,計(jì)算每個(gè)視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量。

2.3 與C2C12細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)ATDC5細(xì)胞活性影響的觀察

2.3.1與C2C12細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)ATDC5細(xì)胞增殖的影響 采用孔徑為0.4 μm的Transwell小室對(duì)C2C12細(xì)胞和ATDC5細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。分3組,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。共培養(yǎng)組和預(yù)處理組上層小室內(nèi)接種C2C12細(xì)胞(200 μL,約1×105個(gè)),分別以常規(guī)培養(yǎng)基和地塞米松培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基,用PBS漂洗2次,然后將Transwell小室轉(zhuǎn)移至接種ATDC5細(xì)胞(600 μL,約2×105個(gè))的培養(yǎng)孔中;對(duì)照組上層小室內(nèi)為無(wú)細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)基。上下層小室內(nèi)細(xì)胞均以常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,采用CCK8法檢測(cè)各組下層小室內(nèi)ATDC5細(xì)胞增殖率,方法同2.2.1。

2.3.2與C2C12細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)ATDC5細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的影響 細(xì)胞分組、培養(yǎng)方法同2.3.1。共培養(yǎng)24 h后,吸棄下層小室內(nèi)的培養(yǎng)基,每孔加入400 μL現(xiàn)配制的DCFH-DA試劑(用PBS稀釋1000倍),避光培養(yǎng)30 min后置于熒光顯微鏡下觀察拍照,用 Image J軟件分析比較各組的熒光強(qiáng)度。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。地塞米松組和對(duì)照組C2C12細(xì)胞增殖率、蛋白含量、傷口修復(fù)率、細(xì)胞遷移數(shù)量的組間比較均采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);對(duì)照組、共培養(yǎng)組、預(yù)處理組ATDC5細(xì)胞增殖率、細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的總體比較均采用單因素方差分析,組間兩兩比較均采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié) 果

3.1 地塞米松干預(yù)后C2C12細(xì)胞增殖率和蛋白含量測(cè)定結(jié)果

地塞米松組C2C12細(xì)胞增殖率和蛋白含量均低于對(duì)照組[(78.402±5.401)%,(100.000±3.096)%,t=8.498,P=0.000;(5 080.367±296.657)μg·mL-1,(5 775.577±150.476)μg·mL-1,t=3.620,P=0.022]。

3.2 地塞米松干預(yù)后C2C12細(xì)胞傷口修復(fù)率測(cè)定結(jié)果

與對(duì)照組相比,地塞米松組C2C12細(xì)胞的修復(fù)能力下降(圖1)。地塞米松組C2C12細(xì)胞的24 h傷口修復(fù)率低于對(duì)照組[(53.173±1.800)%,(79.979±10.176)%,t=4.493,P=0.011]。

圖1 2組C2C12細(xì)胞24 h修復(fù)結(jié)果

3.3 地塞米松干預(yù)后C2C12細(xì)胞遷移數(shù)量測(cè)定結(jié)果

培養(yǎng)24 h和48 h時(shí),地塞米松組C2C12細(xì)胞遷移數(shù)量均少于對(duì)照組[24 h:(24.200±5.630)個(gè),(57.000±2.449)個(gè),t=11.945,P=0.000;48 h:(57.600±8.820)個(gè),(91.000±4.743)個(gè),t=7.457,P=0.000]。見(jiàn)圖2。

圖2 2組C2C12細(xì)胞24 h和48 h遷移結(jié)果(結(jié)晶紫染色 ×400)

3.4 與C2C12細(xì)胞共培養(yǎng)條件下ATDC5細(xì)胞增殖率測(cè)定結(jié)果

3組ATDC5細(xì)胞增殖率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)照組和共培養(yǎng)組ATDC5細(xì)胞增殖率均高于預(yù)處理組(P=0.037,P=0.006),共培養(yǎng)組ATDC5細(xì)胞增殖率高于對(duì)照組(P=0.001)。見(jiàn)表1。

表1 與C2C12細(xì)胞共培養(yǎng)條件下ATDC5細(xì)胞增殖率和細(xì)胞內(nèi)活性氧含量

3.5 與C2C12細(xì)胞共培養(yǎng)條件下ATDC5細(xì)胞內(nèi)活性氧含量測(cè)定結(jié)果

3組ATDC5細(xì)胞內(nèi)活性氧含量比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。預(yù)處理組ATDC5細(xì)胞內(nèi)活性氧含量高于對(duì)照組和共培養(yǎng)組(P=0.001,P=0.000),對(duì)照組和共培養(yǎng)組ATDC5細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.137)。見(jiàn)圖3、表1。

圖3 3組與C2C12細(xì)胞共培養(yǎng)的ATDC5細(xì)胞二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯活性氧熒光染色結(jié)果(×200)

4 討 論

肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活、增殖、分化對(duì)維持出生后骨骼肌結(jié)構(gòu)與功能起著至關(guān)重要的作用。當(dāng)肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量減少時(shí),骨骼肌的再生和修復(fù)能力下降,其生成和降解平衡遭到破壞,從而導(dǎo)致骨骼肌萎縮。骨骼肌中的肌動(dòng)蛋白在分子水平上與軟骨及骨相互作用,與KOA的發(fā)病密切相關(guān)[9]。由此可見(jiàn),“肌肉-軟骨”在細(xì)胞分子水平的交互作用可能是影響KOA發(fā)生、發(fā)展的重要原因。

本研究發(fā)現(xiàn),地塞米松可抑制肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和蛋白合成,并能抑制肌衛(wèi)星細(xì)胞的修復(fù)和遷移。可見(jiàn),采用地塞米松對(duì)肌衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),可體外模擬肌萎縮條件下肌衛(wèi)星細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。地塞米松抑制肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖,也可能是其引起骨骼肌萎縮的重要原因。糖皮質(zhì)激素對(duì)分解代謝有促進(jìn)作用,可通過(guò)減少蛋白質(zhì)合成和增加蛋白質(zhì)降解,使肌纖維尺寸縮小、Ⅱ型纖維選擇性萎縮,誘導(dǎo)骨骼肌萎縮,并能引起骨骼肌內(nèi)脂肪堆積,降低肌肉質(zhì)量,促進(jìn)肌少癥的發(fā)生[10]。地塞米松誘導(dǎo)的肌少癥與增齡性肌少癥都有肌肉量減少,肌力降低,肌纖維蛋白合成減少、分解加快,肌纖維再生能力消失等特點(diǎn),二者在病理特點(diǎn)上具有較高的相似性,因此地塞米松常被用于肌少癥動(dòng)物模型的構(gòu)建[11]。同時(shí),采用地塞米松對(duì)體外培養(yǎng)且分化成熟的成肌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),可使肌管橫徑減小,形成肌肉萎縮,這一方法被用于肌肉萎縮的體外細(xì)胞建模[12-13]。然而,也有研究發(fā)現(xiàn),地塞米松可促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞分化,增加肌管的橫徑和面積[14]。這可能與該研究中使用的地塞米松濃度較低(5～25 nmol·L-1)及干預(yù)時(shí)間點(diǎn)(肌衛(wèi)星細(xì)胞分化前)不同有關(guān)。這說(shuō)明地塞米松對(duì)肌衛(wèi)星細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)作用對(duì)藥物濃度和干預(yù)時(shí)間點(diǎn)具有依賴性。

為進(jìn)一步研究“肌肉-軟骨”在細(xì)胞水平的相互作用對(duì)KOA的影響,本研究構(gòu)建了肌衛(wèi)星細(xì)胞-軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),正常狀態(tài)下,肌衛(wèi)星細(xì)胞與軟骨細(xì)胞間接共培養(yǎng)時(shí),可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖,這可能與肌衛(wèi)星細(xì)胞產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物能影響軟骨細(xì)胞活性有關(guān)。國(guó)外研究表明,與肌細(xì)胞或肌細(xì)胞條件培養(yǎng)基共同培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞對(duì)白細(xì)胞介素-1β和腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的軟骨損傷的抵抗作用增強(qiáng),且肌細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子可促進(jìn)軟骨細(xì)胞生成胰島素樣生長(zhǎng)因子1,調(diào)節(jié)軟骨發(fā)育[15];在肌細(xì)胞條件培養(yǎng)基中培養(yǎng),能減輕炎癥誘導(dǎo)對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的軟骨細(xì)胞的損傷[16]。此外,肌細(xì)胞和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)條件下,Ⅱ型和Ⅸ型膠原的表達(dá)也明顯增強(qiáng)[17]?？梢?jiàn),正常狀態(tài)下,肌肉組織中的肌細(xì)胞和肌衛(wèi)星細(xì)胞均可對(duì)軟骨細(xì)胞有正向調(diào)節(jié)作用。同時(shí),本研究還發(fā)現(xiàn),與正常肌細(xì)胞共培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞中的活性氧含量明顯下降。這可能與肌衛(wèi)星細(xì)胞可增強(qiáng)軟骨細(xì)胞對(duì)損傷的防御作用及減輕軟骨損害有關(guān)。當(dāng)活力降低的肌衛(wèi)星細(xì)胞與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí),會(huì)明顯抑制軟骨細(xì)胞增殖,同時(shí)會(huì)明顯提高軟骨細(xì)胞中活性氧的水平,增加軟骨細(xì)胞氧化性損傷。可見(jiàn),骨骼肌萎縮狀態(tài)下肌衛(wèi)星細(xì)胞活性降低,可通過(guò)“肌肉-軟骨”之間的細(xì)胞耦合作用加速軟骨退變,抑制軟骨細(xì)胞增殖,并加重其氧化性損傷,從而導(dǎo)致KOA的發(fā)生和發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn),血管中骨骼肌中免疫細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子能減輕關(guān)節(jié)軟骨損傷[18]。由此可見(jiàn),肌肉組織中細(xì)胞產(chǎn)生的生物化學(xué)物質(zhì)可隨血液流動(dòng)至關(guān)節(jié)。通過(guò)調(diào)節(jié)肌肉萎縮可影響關(guān)節(jié)軟骨的合成與代謝,進(jìn)而影響KOA的發(fā)病及病理進(jìn)程。從本研究的結(jié)果來(lái)看,“肌肉-軟骨”之間可能存在細(xì)胞水平的耦合作用,正常狀態(tài)下肌細(xì)胞對(duì)軟骨細(xì)胞具有促增殖作用,維持肌肉的健康狀態(tài)對(duì)關(guān)節(jié)軟骨有保護(hù)作用;當(dāng)肌肉發(fā)生萎縮時(shí),肌衛(wèi)星細(xì)胞活性下降,會(huì)降低軟骨細(xì)胞活力,加重軟骨細(xì)胞損傷。因此,防治骨骼肌萎縮對(duì)保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨至關(guān)重要。

本研究的結(jié)果提示,地塞米松可抑制肌衛(wèi)星細(xì)胞C2C12增殖,應(yīng)用地塞米松干預(yù)肌衛(wèi)星細(xì)胞C2C12可體外模擬肌肉萎縮條件下肌衛(wèi)星細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。正常狀態(tài)下,肌衛(wèi)星細(xì)胞C2C12的代謝產(chǎn)物可促進(jìn)軟骨細(xì)胞ATDC5增殖;肌衛(wèi)星細(xì)胞C2C12活力降低,可抑制軟骨細(xì)胞ATDC5增殖,同時(shí)會(huì)增加軟骨細(xì)胞ATDC5氧化性損傷。