蠲痹方含藥血清對絕經(jīng)后膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨細(xì)胞自噬的影響及其作用機(jī)制

馬靖哲,康武林,姚彬,黃文博,李越,陳小林,李思聰,袁普衛(wèi)

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,陜西 咸陽 712046;2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,陜西 咸陽 712046)

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨退變、軟骨下骨改變、滑膜炎癥等為特征的慢性退行性疾病[1-3],主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、僵硬和活動受限[4]。調(diào)查顯示,我國40歲以上人群中女性KOA的患病率明顯高于男性[5]。伴隨著雌激素水平的下降,女性KOA的發(fā)病率呈陡增趨勢[6]。骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病與炎癥及軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解的失衡密切相關(guān)[7-8]。軟骨細(xì)胞外基質(zhì)代謝異常可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分解代謝加速[9]。自噬是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要過程,細(xì)胞可通過吞噬和降解功能失調(diào)的蛋白質(zhì)與衰老受損的細(xì)胞器來維持自身的代謝需求[10]。軟骨細(xì)胞自噬功能異常與KOA的發(fā)生密切相關(guān),通過激活細(xì)胞自噬可以抑制軟骨細(xì)胞的凋亡,延緩關(guān)節(jié)軟骨退變[11]。蠲痹膠囊為陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑,在臨床上用于KOA的治療取得了滿意的療效[12-13]。本團(tuán)隊(duì)前期研究[14]證實(shí),蠲痹膠囊治療KOA的作用機(jī)制可能與降低滑膜中炎癥因子的表達(dá),抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。但該藥對軟骨細(xì)胞的影響,尚缺乏相關(guān)研究。我們根據(jù)蠲痹膠囊的組方藥物制備蠲痹方含藥血清,觀察其對絕經(jīng)后KOA大鼠軟骨細(xì)胞自噬的影響,并對其作用機(jī)制進(jìn)行了探討,現(xiàn)總結(jié)報(bào)告如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

8周齡SD雌性大鼠25只,體質(zhì)量(200±30)g,購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(湘)2019-0004。實(shí)驗(yàn)動物于陜西中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心喂養(yǎng),使用許可證號:SCXK(陜)2021-001。實(shí)驗(yàn)室溫度18～25℃,相對濕度50%～80%,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。本研究實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審查通過,倫理批件號:SUCMDL20220621002。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

蠲痹膠囊藥物組成:熟地黃12 g、肉蓯蓉10 g、骨碎補(bǔ)15 g、淫羊藿15 g、白芍12 g、生黃芪30 g、當(dāng)歸15 g、牛膝12 g、甘草片6 g。以上藥物由陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供。藥物加水浸泡30 min,文火煎煮2次,2次煎煮的藥液合并后,用100 ℃恒溫水浴將藥液加熱濃縮至每毫升含生藥1.0 g的蠲痹方藥物濃縮液,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit,CCK)-8購自北京博奧森生物科技有限公司,Compound C購自上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司,Ⅱ型膠原蛋白抗體購自常州市祥泰生物技術(shù)有限公司,G蛋白耦聯(lián)受體30(G protein-coupled receptor 30,GPR30)抗體購自美國Abcam公司,微管相關(guān)蛋白輕鏈3β(microtubule-associated protein light chain 3 beta,MAPLC3β)抗體、Beclin-1抗體、p62、AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)抗體、磷酸化AMP活化蛋白激酶(phosphorylated AMP-activated protein kinase,p-AMPK)抗體、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)抗體、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamycin,p-mTOR)抗體購自美國CST公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

生物安全柜、CO2培養(yǎng)箱(新加坡ESCO公司),倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司),全自動酶標(biāo)儀(美國ELX808公司),電泳儀(美國BIO-RAD公司),微量移液器(德國Eppendorf公司),YP601N電子天平(哈爾濱眾匯衡器公司),3K15冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司),Western Blot儀器(美國BIO-RAD公司),BG-gdsAUTO 710 MINI 發(fā)光成像儀(北京百晶生物公司)。

2 方 法

2.1 絕經(jīng)后KOA動物模型建造

25只SD雌性大鼠,按照體質(zhì)量由高至低排序,依次編號1～25。從隨機(jī)數(shù)字表中隨機(jī)選取1行隨機(jī)數(shù)字,連續(xù)抄錄25個(gè)隨機(jī)數(shù)字與大鼠編號依次對應(yīng),將抄錄的隨機(jī)數(shù)字由大到小排序(隨機(jī)數(shù)字相同則按照出現(xiàn)順序排序)。對隨機(jī)數(shù)字排序在前20位的大鼠,采用摘取卵巢及切斷內(nèi)側(cè)副韌帶、前交叉韌帶,摘除內(nèi)側(cè)半月板的方法[15]進(jìn)行絕經(jīng)后KOA造模,其余大鼠不做處理。

2.2 蠲痹方含藥血清制備

造模成功后,根據(jù)蠲痹膠囊成人口服劑量及成人和大鼠等效劑量公式[16]計(jì)算出大鼠用藥劑量,按上述隨機(jī)方法隨機(jī)選取15只模型大鼠進(jìn)行蠲痹方藥物濃縮液(0.014 mL·g-1)灌胃,其余大鼠正常喂養(yǎng)。灌胃每日早晚各1次,連續(xù)7 d。末次給藥1 h后腹主動脈取血,采集血漿,4 ℃下靜置2 h后,于低溫離心機(jī)4 ℃、3500 r·min-1(離心半徑155 mm)離心 15 min。離心后轉(zhuǎn)移至超凈工作臺內(nèi)取上清液。將離心好的血清用移液槍轉(zhuǎn)移到事先標(biāo)記好的無菌離心管中,56 ℃水浴滅活30 min后用0.22 μm的濾膜過濾,移入無菌離心管中,置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 大鼠軟骨細(xì)胞提取

采用過量麻醉法處死大鼠,取下大鼠整個(gè)膝關(guān)節(jié),分別進(jìn)行軟骨細(xì)胞提取。將大鼠膝關(guān)節(jié)浸泡于75%乙醇中15 min后,轉(zhuǎn)移至生物安全柜中。用手術(shù)剪剔除皮毛,暴露并打開膝關(guān)節(jié),剝離膝關(guān)節(jié)表面的透明軟骨層。將剝離的透明軟骨層置于15 mL無菌離心管中,加入胰蛋白酶,于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育30 min,然后用0.2%的Ⅱ型膠原酶消化 3 h,過200目濾網(wǎng),1500 r·min-1(離心半徑155 mm)離心10 min。PBS緩沖液洗滌3次,收集細(xì)胞。模型大鼠和正常大鼠分別進(jìn)行軟骨細(xì)胞提取。

2.4 蠲痹方含藥血清最佳作用濃度篩選

將模型大鼠軟骨細(xì)胞以5000個(gè)·孔-1的濃度接種至96孔板,分為模型組及1.25%、2.5%、5%、10%、20%含藥血清組6組,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后,除模型組用新鮮DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)外,其余組分別加入相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的蠲痹方含藥血清進(jìn)行干預(yù)。24 h后,參照CCK-8試劑盒說明,每孔避光加入CCK-8溶液10 μL,在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h后,用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的光密度。光密度值越高,細(xì)胞活力越強(qiáng)。

2.5 蠲痹方含藥血清對大鼠軟骨細(xì)胞GPR30表達(dá)影響的檢測

將模型大鼠軟骨細(xì)胞以5000個(gè)·孔-1的濃度接種至96孔板,分為模型組及1.25%、2.5%、5%、10%含藥血清組,并取正常大鼠軟骨細(xì)胞設(shè)為空白組,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。除空白組和模型組用新鮮DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)外,其余組分別加入相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的蠲痹方含藥血清進(jìn)行干預(yù)。24 h后,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參蛋白,用蛋白免疫印跡法檢測各組軟骨細(xì)胞GPR30的相對表達(dá)量。

2.6 蠲痹方含藥血清對大鼠軟骨細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)及AMPK/mTOR信號通路影響的檢測

將模型大鼠軟骨細(xì)胞以5000個(gè)·孔-1的濃度接種至96孔板,分為模型組、含藥血清組、含藥血清+Compound C組、Compound C組,并取正常大鼠軟骨細(xì)胞設(shè)為空白組,每組每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔。除模型組和空白組用新鮮DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)外,含藥血清組、含藥血清+Compound C組、Compound C組分別加入10%蠲痹方含藥血清、10%蠲痹方含藥血清+Compound C及Compound C進(jìn)行干預(yù)。24 h后,采用蛋白免疫印跡法,GAPDH為內(nèi)參蛋白,檢測軟骨細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白MAPLC3β、Beclin-1、p62的相對表達(dá)量;分別以AMPK、mTOR為內(nèi)參蛋白檢測AMPK/mTOR信號通路相關(guān)蛋白p-AMPK、p-mTOR的相對表達(dá)量。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。各組軟骨細(xì)胞細(xì)胞活力、GPR30、MAPLC3β、Beclin-1、p62、p-AMPK、p-mTOR相對表達(dá)量的組間總體比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié) 果

3.1 動物模型鑒定結(jié)果

造模8周后,處死造模大鼠1只,見造模大鼠膝關(guān)節(jié)表面軟骨毛糙或缺損,關(guān)節(jié)間隙變窄,滑膜增生,絕經(jīng)后KOA大鼠模型造模成功。

3.2 軟骨細(xì)胞鑒定結(jié)果

所提取的原代細(xì)胞,甲苯胺藍(lán)染色見細(xì)胞漿呈淺藍(lán)色,細(xì)胞核呈深藍(lán)色[圖1(1)];CollagenⅡ免疫熒光染色見細(xì)胞漿和細(xì)胞膜上有CollagenⅡ的特征性表達(dá)[圖1(2)];鑒定為軟骨細(xì)胞。

圖1 大鼠軟骨細(xì)胞染色圖片

3.3 蠲痹方含藥血清最佳作用濃度篩選結(jié)果

5組軟骨細(xì)胞細(xì)胞活力的組間總體比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。5%、10%、20%含藥血清組細(xì)胞活力均高于1.25%、2.5%含藥血清組和模型組(LSD-t=6.767,P=0.003,LSD-t=7.666,P=0.002,LSD-t=5.091,P=0.007;LSD-t=5.080,P=0.007,LSD-t=6.690,P=0.003,LSD-t=3.433,P=0.027;LSD-t=7.590,P=0.002,LSD-t=8.200,P=0.001,LSD-t=6.031,P=0.004);1.25%、2.5%含藥血清組細(xì)胞活力與模型組比較,組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LSD-t=1.182,P=0.303,LSD-t=1.785,P=0.187);10%含藥血清組細(xì)胞活力高于5%含藥血清組和20%含藥血清組(LSD-t=3.204,P=0.033,LSD-t=4.671,P=0.010)。

表1 不同濃度蠲痹方含藥血清干預(yù)后大鼠軟骨細(xì)胞活力

3.4 蠲痹方含藥血清對大鼠軟骨細(xì)胞GPR30表達(dá)影響的檢測結(jié)果 各組大鼠軟骨細(xì)胞GPR30相對表達(dá)量組間總體比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2、圖2)。模型組GPR30相對表達(dá)量低于空白組及5%、10%含藥血清組(LSD-t=5.695,P=0.005,LSD-t=5.400,P=0.006,LSD-t=9.006,P=0.001);模型組GPR30

表2 不同濃度蠲痹方含藥血清干預(yù)后大鼠軟骨細(xì)胞G蛋白耦聯(lián)受體30的相對表達(dá)量

GPR30為G蛋白耦聯(lián)受體30,GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶,①為空白組,②為模型組,③為1.25%含藥血清組,④為2.5%含藥血清組,⑤為5%含藥血清組,⑥為10%含藥血清組。

相對表達(dá)量與1.25%、2.5%含藥血清組比較,組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LSD-t=0.776,P=0.481,LSD-t=1.585,P=0.170);5%、10%含藥血清組GPR30相對表達(dá)量均高于1.25%含藥血清組(LSD-t=2.782,P=0.049,LSD-t=4.473,P=0.011);10%含藥血清組GPR30相對表達(dá)量高于2.5%含藥血清組(LSD-t=4.544,P=0.011);5%含藥血清組GPR30相對表達(dá)量與2.5%含藥血清組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LSD-t=2.521,P=0.065);5%、10%含藥血清組GPR30相對表達(dá)量與空白組比較,組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LSD-t=2.274,P=0.085,LSD-t=0.997,P=0.375);5%含藥血清組GPR30相對表達(dá)量與10%含藥血清組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LSD-t=2.578,P=0.062)。

3.5 蠲痹方含藥血清對大鼠軟骨細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)影響的檢測結(jié)果

各組軟骨細(xì)胞MAPLC3β、Beclin-1、p62相對表達(dá)量組間總體比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3、圖3)。

表3 5組大鼠軟骨細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的相對表達(dá)量

MAPLC3β為微管相關(guān)蛋白輕鏈3β,GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶,①為空白組,②為模型組,③為含藥血清組,④為含藥血清+Compound C組,⑤為Compound C組。

p-AMPK為磷酸化AMP活化蛋白激酶,AMPK為AMP活化蛋白激酶,mTOR為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白,p-mTOR為磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白,①為空白組,②為模型組,③為含藥血清組,④為含藥血清+Compound C組,⑤為Compound C組。

模型組、含藥血清+Compound C組、Compound C組MAPLC3β相對表達(dá)量均低于空白組、含藥血清組(LSD-t=6.855,P=0.002,LSD-t=8.675,P=0.001;LSD-t=5.096,P=0.007,LSD-t=5.931,P=0.004;LSD-t=5.560,P=0.005,LSD-t=5.354,P=0.006);模型組、Compound C組MAPLC3β相對表達(dá)量均低于含藥血清+Compound C組(LSD-t=4.627,P=0.010,LSD-t=8.677,P=0.001);模型組MAPLC3β相對表達(dá)量與Compound C組比較,組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LSD-t=2.605,P=0.060);含藥血清組MAPLC3β相對表達(dá)量與空白組比較,組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LSD-t=1.677,P=0.169)。

模型組、Compound C組Beclin-1相對表達(dá)量低于空白組、含藥血清組、含藥血清+Compound C組(LSD-t=12.912,P=0.000,LSD-t=7.401,P=0.002,LSD-t=5.360,P=0.006;LSD-t=2.950,P=0.042,LSD-t=5.484,P=0.005,LSD-t=3.903,P=0.018);含藥血清+Compound C組Beclin-1相對表達(dá)量低于空白組(LSD-t=26.840,P=0.000)。模型組Beclin-1相對表達(dá)量與Compound C組比較,組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LSD-t=0.346,P=0.767);含藥血清組Beclin-1相對表達(dá)量與含藥血清+Compound C組、空白組比較,組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LSD-t=4.648,P=0.358,LSD-t=1.032,P=0.361)。

含藥血清組、空白組p62相對表達(dá)量低于模型組、含藥血清+Compound C組、Compound C組(LSD-t=3.925,P=0.017,LSD-t=3.985,P=0.019,LSD-t=0.016,P=0.001;LSD-t=3.149,P=0.035,LSD-t=5.094,P=0.007,LSD-t=8.740,P=0.001),含藥血清+Compound C組p62相對表達(dá)量低于Compound C組(LSD-t=3.455,P=0.026)。模型組p62相對表達(dá)量與含藥血清+Compound C組、Compound C組比較,組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LSD-t=0.787,P=0.476,LSD-t=1.565,P=0.193);空白組p62相對表達(dá)量與含藥血清組比較,組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LSD-t=1.972,P=0.120)。

3.6 蠲痹方含藥血清對大鼠軟骨細(xì)胞AMPK/mTOR信號通路影響的檢測結(jié)果

5組軟骨細(xì)胞p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR相對表達(dá)量組間總體比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4、圖4)。

表4 5組大鼠軟骨細(xì)胞AMPK/mTOR信號通路相關(guān)蛋白的相對表達(dá)量

含藥血清組p-AMPK相對表達(dá)量高于模型組、Compound C組(LSD-t=3.623,P=0.022,LSD-t=6.537,P=0.003),空白組p-AMPK相對表達(dá)量高于模型組、含藥血清+Compound C組、Compound C組(LSD-t=4.149,P=0.014,LSD-t=2.791,P=0.049,LSD-t=5.734,P=0.004);含藥血清+Compound C組p-AMPK相對表達(dá)量高于Compound C組(LSD-t=5.958,P=0.004)。模型組p-AMPK相對表達(dá)量與含藥血清+Compound C組、Compound C組比較,組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LSD-t=2.739,P=0.052,LSD-t=2.774,P=0.050);含藥血清組p-AMPK相對表達(dá)量與空白組、含藥血清+Compound C組比較,組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LSD-t=2.055,P=0.109,LSD-t=1.236,P=0.284)。

空白組、含藥血清組、含藥血清+Compound C組p-mTOR相對表達(dá)量均低于模型組(LSD-t=8.722,P=0.001,LSD-t=8.849,P=0.001,LSD-t=5.558,P=0.005);含藥血清組、空白組p-mTOR相對表達(dá)量低于含藥血清+Compound C組、Compound C組(LSD-t=4.201,P=0.014,LSD-t=10.030,P=0.001;LSD-t=4.879,P=0.008,LSD-t=9.782,P=0.001);含藥血清+Compound C組p-mTOR相對表達(dá)量低于Compound C組(LSD-t=6.934,P=0.002)。模型組p-mTOR相對表達(dá)量與Compound C組比較,組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LSD-t=1.476,P=0.214);含藥血清組p-mTOR相對表達(dá)量與空白組比較,組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LSD-t=1.708,P=0.150)。

4 討 論

KOA屬中醫(yī)學(xué)“骨痹”“痹癥”的范疇。《素問·上古天真論》曰:“女子七七,任脈虛,太沖脈衰少,天癸竭,地道不通,故形壞而無子也?！苯^經(jīng)后KOA的內(nèi)因?yàn)楦文I虧虛、精血不足,外因?yàn)轱L(fēng)寒濕邪外侵,多為本虛標(biāo)實(shí)之證[17]。蠲痹膠囊的藥物組成由陜西省名老中醫(yī)李堪印教授的臨床經(jīng)驗(yàn)方加減而得,具有補(bǔ)腎益氣、舒筋通絡(luò)之功效[18]。本研究結(jié)果表明蠲痹方含藥血清可增強(qiáng)絕經(jīng)后KOA大鼠軟骨細(xì)胞的活力,最佳作用濃度為10%。

GPR30是一種7次跨膜G蛋白耦聯(lián)雌激素受體,能介導(dǎo)快速細(xì)胞反應(yīng)。成冬等[19]的研究表明,17β-雌二醇通過GPR30和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路保護(hù)ATDC5軟骨細(xì)胞免于線粒體自噬。本研究結(jié)果表明蠲痹方含藥血清可上調(diào)絕經(jīng)后KOA大鼠軟骨細(xì)胞GPR30的表達(dá),最低作用濃度為5%。

軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中唯一的細(xì)胞類型,炎癥和氧化應(yīng)激等病理因素可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞過度凋亡、細(xì)胞密度降低和細(xì)胞外基質(zhì)降解,從而加速骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。因此,預(yù)防軟骨細(xì)胞過度凋亡可能是預(yù)防骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展的有效方法[20]。細(xì)胞自噬是細(xì)胞內(nèi)損壞的蛋白或細(xì)胞器經(jīng)溶酶體降解成可循環(huán)利用的細(xì)胞成分的過程[21]。關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞處于特殊的低氧環(huán)境中,營養(yǎng)物質(zhì)缺乏,細(xì)胞自噬對于維持軟骨細(xì)胞的生存和功能十分重要[22]。軟骨細(xì)胞自噬活性降低,清除自身衰老、受損的細(xì)胞器的能力下降,細(xì)胞穩(wěn)態(tài)被打破,代謝失衡,可致細(xì)胞發(fā)生炎性反應(yīng),出現(xiàn)細(xì)胞損傷。Luo等[23]的研究表明,自噬在維持關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)中起著重要作用,軟骨細(xì)胞自噬能力增強(qiáng),可增強(qiáng)其基質(zhì)代謝活性,從而延緩KOA的進(jìn)展。細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白MAPLC3β、Beclin-1、p62的表達(dá)量可反映細(xì)胞自噬情況[24]。軟骨細(xì)胞中MAPLC3β、Beclin-1的表達(dá)量上調(diào),p62的表達(dá)量下調(diào),說明細(xì)胞自噬能力增強(qiáng)。

AMPK是一種異源三聚體復(fù)合物,包含1個(gè)催化亞基α和2個(gè)調(diào)節(jié)亞基β和γ,每個(gè)亞基由2個(gè)或3個(gè)不同的基因編碼,導(dǎo)致不同AMPK復(fù)合物有12種不同的α/β/γ組合[25]。AMPK能感知能量穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)因子三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)的水平,當(dāng)細(xì)胞ATP處于低水平時(shí),AMPK可以通過調(diào)節(jié)代謝酶來對ATP與磷酸腺苷比率下降作出反應(yīng),以促進(jìn)ATP的產(chǎn)生并抑制ATP的消耗[26]。當(dāng)細(xì)胞能量較低時(shí),α亞基中的Thr172被磷酸化,導(dǎo)致AMPK復(fù)合物的激活。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,在細(xì)胞自噬的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。mTOR有兩種蛋白質(zhì)復(fù)合物亞基,即mTOR復(fù)合體1和mTOR復(fù)合體2[27]。mTOR復(fù)合體1受生長因子調(diào)節(jié),并對不利于細(xì)胞生長的環(huán)境(如DNA損傷、缺氧、低ATP水平和氨基酸耗盡等)作出反應(yīng),可促進(jìn)細(xì)胞中脂質(zhì)和核苷酸的合成,并通過促進(jìn)葡萄糖代謝促進(jìn)細(xì)胞生長[28]。mTOR復(fù)合體2主要通過磷酸化和激活蛋白激酶B來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖[26]。此外,mTOR復(fù)合體2通過磷酸化AGC蛋白激酶家族成員來控制細(xì)胞生長和代謝[28]。AMPK是自噬激活因子,mTOR復(fù)合體1是主要的自噬抑制因子。當(dāng)AMPK激活后,可阻斷mTOR信號通路的磷酸化,抑制細(xì)胞中mTOR的表達(dá),增強(qiáng)AMPK和細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白之間的相互作用,進(jìn)而激活細(xì)胞自噬[29-30]。Li等[31]的研究表明,二甲雙胍通過以AMPK介導(dǎo)的方式抑制mTOR信號通路,誘導(dǎo)細(xì)胞自噬,從而延緩H2O2誘導(dǎo)的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞衰老。本研究結(jié)果表明,蠲痹方含藥血清可上調(diào)絕經(jīng)后KOA大鼠軟骨細(xì)胞中AMPK磷酸化水平,下調(diào)mTOR磷酸化水平,引入AMPK抑制劑Compound C干預(yù)后,發(fā)現(xiàn)Compound C抑制了絕經(jīng)后KOA大鼠軟骨細(xì)胞的自噬并減弱了蠲痹方含藥血清的作用。

本研究結(jié)果表明,蠲痹方含藥血清作用于絕經(jīng)后KOA大鼠軟骨細(xì)胞,可增加細(xì)胞活力,并通過上調(diào)MAPLC3β、Beclin-1的表達(dá)和抑制p62的表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞自噬能力;其作用機(jī)制可能與促進(jìn)GPR30表達(dá),上調(diào)AMPK磷酸化水平,下調(diào)mTOR磷酸化水平,激活GPR30和AMPK/mTOR信號通路有關(guān)。本研究分別提取了正常大鼠與絕經(jīng)后KOA模型大鼠的膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞,由于未對2組大鼠軟骨細(xì)胞的形態(tài)及炎癥因子水平進(jìn)行比較,不能確認(rèn)所提取模型大鼠的軟骨細(xì)胞完全反映了絕經(jīng)后KOA軟骨細(xì)胞的狀態(tài),但經(jīng)鑒定所提取的細(xì)胞均為軟骨細(xì)胞。未來的研究需要繼續(xù)完善實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),進(jìn)一步闡明蠲痹方含藥血清影響絕經(jīng)后KOA大鼠軟骨細(xì)胞自噬的具體作用機(jī)制。