枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物聯(lián)合添加在斷奶仔兔上的應(yīng)用效果研究

■ 刁 慧 湯文杰 張 晶 嚴(yán)鴻林 晏家友 周夢佳 黃崇波 李書偉

（1.四川省畜牧科學(xué)研究院，動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川 成都 610066；2.四川省畜科集團有限公司，畜禽生物制品四川省重點實驗室，四川 成都 610066；3.重慶市畜牧技術(shù)推廣總站，重慶 401121；4.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽 621010）

隨著肉兔產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展，肉兔腸炎、腹瀉等腸道疾病和鼻炎、肺炎等呼吸道病給肉兔產(chǎn)業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失[1]。為了追求肉兔的生長速度和生產(chǎn)成績，高劑量無機微量元素和抗生素被長期添加到肉兔飼料中，但抗生素由于其耐藥性也給人們帶來了沉重的后果和嚴(yán)峻的考驗[2]。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的194 號公告規(guī)定退出除中藥外的所有促生長類藥物飼料添加劑，這勢必會導(dǎo)致養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)水平下降。酵母培養(yǎng)物是由酵母菌在特配的液體培養(yǎng)液和谷物培養(yǎng)基上經(jīng)過深度發(fā)酵而成，終端產(chǎn)品包括變性的培養(yǎng)基、酵母細胞本身和細胞外代謝物等200 多種代謝產(chǎn)物，在機體腸道健康和免疫功能的改善上具有重要的作用[3]?？莶菅挎邨U菌能破壞植物細胞的細胞壁，自身能產(chǎn)生維生素、氨基酸、促生長因子等多種容易被利用的物質(zhì)，通過自身分泌的枯草菌素及產(chǎn)生的孢子來頡頏、競爭性排斥有害病原菌，維持腸道健康[4]。然而，酵母培養(yǎng)物和枯草芽孢桿菌在肉兔上的聯(lián)合使用未見報道。因此，研究以斷奶伊拉肉兔為試驗動物，探討益生菌和酵母培養(yǎng)物對肉兔生長性能、養(yǎng)分消化率、血清免疫、抗氧化和抗應(yīng)激功能的影響，旨在揭示益生菌和酵母培養(yǎng)物在斷奶仔兔上的應(yīng)用效果，為其在生產(chǎn)上的合理應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設(shè)計

選用396 只35 日齡、體重為（0.979±0.037） kg 斷奶的肉兔，隨機分為4 個處理（每個處理11 個重復(fù)，每個重復(fù)9 只兔），分別為基礎(chǔ)飼糧（對照組）、添加1 000 mg/kg 枯草芽孢桿菌、添加3 000 mg/kg 酵母培養(yǎng)物、添加1 000 mg/kg枯草芽孢桿菌+3 000 mg/kg酵母培養(yǎng)物（聯(lián)合添加組）。試驗兔在同一棟封閉式兔舍不銹鋼籠子（60 cm×60 cm×45 cm）里飼養(yǎng)，每個籠子3 只兔。預(yù)試期7 d，正試期30 d。每天08:00 和17: 00投喂2次飼料。試驗期間自由飲水。每日清掃兔舍1次，每隔4 d對兔舍進行噴霧消毒1次。仔兔免疫程序及其他飼養(yǎng)管理按兔場常規(guī)進行。

1.2 試驗飼糧

試驗飼糧參照De Blas 等[5]《兔的營養(yǎng)需要》進行配制，飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 樣品采集

1.3.1 飼料樣

飼料樣品通過四分法進行采集，每個處理取200 g左右，放入-20 ℃冰箱保存待測養(yǎng)分的含量。

1.3.2 糞樣

于試驗第27～30 天，采用內(nèi)源指示劑收糞法，進行消化試驗。消化試驗共4 d，進行直腸糞樣收集?；靹蚝蠹尤?0%硫酸和幾滴甲苯固氮防腐，65 ℃烘至恒重，粉碎過40目篩。

1.3.3 血樣

試驗結(jié)束時，每個重復(fù)選1 只接近平均體重的肉兔進行耳緣靜脈采血3 mL，4 ℃冰箱中靜置12 h，4 000 r/min離心10 min，分離出血清，-20 ℃保存待用。

1.4 測定指標(biāo)

1.4.1 生長性能

試驗第0 天、第15 天和第30 天末，分別對每只兔進行空腹稱重。試驗期內(nèi)，以重復(fù)為單位，記錄總投料量和總剩料量。根據(jù)ADG和投料量計算F/G。

1.4.2 養(yǎng)分表觀消化率

參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》[6]測定CP、干物質(zhì)（DM）、粗脂肪（EE）和CF，采用內(nèi)源指示劑法（AIA 法）計算肉兔飼糧養(yǎng)分表觀消化率。內(nèi)源指示劑鹽酸不溶灰分的測定方法參見GB/T 23742—2009《飼料中鹽酸不溶灰分的測定》。

1.4.3 血清抗氧化指標(biāo)

用南京建成生物工程研究所有限公司生產(chǎn)的試劑盒，結(jié)合紫外光分光光度計（UV-1100，上海美普達）測定血清中抗氧化相關(guān)指標(biāo)，包括丙二醛（MDA）、總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）。

1.4.4 血清免疫指標(biāo)

用南京建成生物工程研究所有限公司生產(chǎn)的試劑盒，結(jié)合紫外光分光光度計測定血清中K、Na 和溶菌酶含量。血清免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、干擾素γ（IFN-γ）和白細胞介素-10（IL-10）含量采用ELISA 試劑盒測定，測定試劑盒購自北京誠林生物科技有限公司，操作均按說明書進行。

1.4.5 血清抗應(yīng)激指標(biāo)

血清醛固酮、皮質(zhì)醇和熱休克蛋白70（Hsp70）含量采用ELISA 試劑盒測定，測定試劑盒購自北京誠林生物科技有限公司，操作均按說明書進行。

1.5 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均用Excel 2010 進行初步整理，采用SAS 8.0中的one-way ANOVA檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，以P＜0.05作為差異顯著，0.05≤P＜0.10視為有趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物對肉兔生長性能的影響

由表2可知，與對照組相比，飼糧添加3 000 mg/kg酵母培養(yǎng)物顯著提高斷奶仔兔1～15 d ADG，降低F/G，提高飼料轉(zhuǎn)化率（P＜0.05）。聯(lián)合添加組斷奶仔兔16～30 d ADG 顯著高于對照組，F(xiàn)/G 顯著低于對照組（P＜0.05）。從全期來看，枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物聯(lián)合添加有提高斷奶仔兔ADG、降低F/G 的趨勢（P＜0.10）。

表2 枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物對斷奶肉兔生長性能的影響

2.2 枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物對肉兔養(yǎng)分表觀消化率的影響

由表3可知，與對照組相比，飼糧添加3 000 mg/kg酵母培養(yǎng)物或與1 000 mg/kg 枯草芽孢桿菌聯(lián)用，顯著提高斷奶仔兔DM 和EE的表觀消化率（P＜0.05）；聯(lián)合添加組斷奶仔兔CF 的表觀消化率顯著提高（P＜0.05）；各處理組均可提高斷奶仔兔CP 的表觀消化率（P＜0.05）。

表3 枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物對斷奶肉兔養(yǎng)分消化率的影響(%)

2.3 枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物對肉兔免疫指標(biāo)的影響

由表4 可知，與對照組相比，3 個處理組均可提高斷奶仔兔血清IgA 和IgG 的含量（P＜0.05）；飼糧添加3 000 mg/kg 酵母培養(yǎng)物或與1 000 mg/kg 枯草芽孢桿菌聯(lián)用，顯著提高斷奶仔兔血清IgM 和IFN-γ的含量（P＜0.05）。聯(lián)合添加組斷奶仔兔血清IgA和IgM的含量顯著高于1 000 mg/kg 枯草芽孢桿菌組和3 000 mg/kg酵母培養(yǎng)物組（P＜0.05）。聯(lián)合添加組斷奶仔兔血清IFN-γ的含量顯著高于1 000 mg/kg 枯草芽孢桿菌組（P＜0.05）。與其他幾組相比，聯(lián)合添加組斷奶仔兔血清溶菌酶含量顯著提高（P＜0.05）。

表4 枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物對斷奶肉兔血清免疫指標(biāo)的影響

2.4 枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物對肉兔抗氧化能力的影響

由表5 可知，與對照組相比，3 個處理組均可降低斷奶仔兔血清MDA 的含量（P＜0.05）；飼糧添加3 000 mg/kg 酵母培養(yǎng)物或與1 000 mg/kg 枯草芽孢桿菌聯(lián)用均可提高斷奶仔兔血清T-AOC（P＜0.05）；聯(lián)合添加組斷奶仔兔血清SOD 活性顯著提高（P＜0.05）。

2.5 枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物對肉兔抗應(yīng)激能力的影響

由表6 可知，與對照組相比，3 個處理組均可提高斷奶仔兔血清Hsp70 的含量（P＜0.05）；飼糧添加3 000 mg/kg酵母培養(yǎng)物或與1 000 mg/kg枯草芽孢桿菌聯(lián)用，均可降低斷奶仔兔血清醛固酮和皮質(zhì)醇的含量以及K/Na 比值（P＜0.05）。與1 000 mg/kg 枯草芽孢桿菌組相比，聯(lián)合添加組斷奶仔兔血清醛固酮水平顯著降低（P＜0.05）。

表6 枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物對斷奶肉兔抗應(yīng)激能力的影響

3 討論

研究證實，幼齡動物消化系統(tǒng)在斷奶時發(fā)育并不完善，腸道微生物群落發(fā)育也不成熟，在斷奶后7～10 d 才會逐步建立適應(yīng)固體飼料消化的正常微生物菌落[7]。因此，肉兔斷奶后添加酵母培養(yǎng)物和枯草芽孢桿菌可以幫助機體快速形成平衡的微生物菌落，改善營養(yǎng)物質(zhì)消化，促進生長。已有大量試驗表明，酵母培養(yǎng)物對提高豬、雞、鵝、牛、羊的生產(chǎn)性能具有良好的效果，但在肉兔上的研究非常有限。酵母培養(yǎng)物富含酶、氨基酸、有機酸、活性小肽、甘露寡糖、未知生長因子等，進入胃腸道后促進肉兔腸道發(fā)育，減少斷奶對肉兔帶來的應(yīng)激，從而提高生長性能。唐麗等[8]研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加0.1%、0.2%和0.3%的酵母培養(yǎng)物可顯著降低肉兔腹瀉率，添加0.2%和0.3%酵母培養(yǎng)物組擁有更高濃度的血清葡萄糖，有利于保證機體能量供給，維持正常生理功能，提高生長性能。Celaire 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加產(chǎn)植酸酶活性酵母培養(yǎng)物提高肉兔ADG，改善生長性能，提示酵母培養(yǎng)物是一種高效的兔用飼料添加劑。作為飼料中常用的益生菌種之一，枯草芽孢桿菌對改善畜禽生長性能具有正向效果。Guo等[10]比較不同水平枯草芽孢桿菌（105、106CFU/g 和107CFU/g）對肉兔生長性能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，斷奶仔兔飼糧中添加106CFU/g 枯草芽孢桿菌組具有最佳的ADG。張燦[11]在獺兔上的研究得到了類似的結(jié)果。此外，枯草芽孢桿菌和其他的益生菌（乳酸桿菌、兔源脆弱擬桿菌）[4,12]或功能性添加劑（果寡糖、酸化劑、酶制劑等）[13]聯(lián)用進一步提高肉兔ADG，改善飼料轉(zhuǎn)化率。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，飼糧單獨添加3 000 mg/kg 酵母培養(yǎng)物顯著提高斷奶仔兔1～15 d ADG、降低F/G；與1 000 mg/kg 枯草芽孢桿菌聯(lián)用顯著提高斷奶仔兔16～30 d ADG、降低F/G。關(guān)于酵母培養(yǎng)物和枯草芽孢桿菌提高生長性能的原因，有研究者認為與其增加腸道微生物多樣性、改善腸道屏障功能和提高養(yǎng)分消化率有關(guān)[4,14]。

肉兔在斷奶時極易造成腸道功能紊亂，導(dǎo)致養(yǎng)分消化率降低，產(chǎn)生腹瀉。在本試驗中，飼糧添加3 000 mg/kg酵母培養(yǎng)物或與1 000 mg/kg枯草芽孢桿菌聯(lián)用，顯著提高斷奶仔兔CP、DM 和EE 的表觀消化率，這與前人在酵母培養(yǎng)物或枯草芽孢桿菌上的研究結(jié)果一致。飼糧添加2%酵母培養(yǎng)物顯著提高獺兔CF、CP 和DM 的表觀消化率，飼糧添加3%酵母培養(yǎng)物顯著提高獺兔鈣的表觀消化率[15]。肉兔盲腸發(fā)達，微生物豐富，酵母培養(yǎng)物豐富的營養(yǎng)物質(zhì)為盲腸中的微生物提供營養(yǎng)，從而提高飼料的消化率。飼糧添加100、200 mg/kg 或300 mg/kg 枯草芽孢桿菌均顯著提高獺兔總鈣和酸性洗滌纖維的表觀消化率，飼糧添加200 mg/kg 枯草芽孢桿菌顯著提高獺兔中性洗滌纖維的表觀消化率[11]。0.5×106CFU/g枯草芽孢桿菌和0.5×107CFU/g乳酸桿菌聯(lián)用提高斷奶仔兔DM、CP、中性洗滌纖維、有機質(zhì)和總能的表觀消化率[4]。消化酶活性的高低和腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性是反映機體消化能力強弱的重要標(biāo)志?？莶菅挎邨U菌的添加或灌服顯著提高肉兔空腸淀粉酶和蛋白酶活性[16]，促進小腸黏膜細胞的增殖，提高十二指腸絨毛高度和隱窩深度比值，增大小腸吸收面積，可維持小腸上皮的正常結(jié)構(gòu)，因而增強了機體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收功能[12]。因此，酵母培養(yǎng)物和枯草芽孢桿菌可通過提高肉兔腸道消化酶活性，改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)，進而提高養(yǎng)分消化率。

氧化應(yīng)激是指活性氧的產(chǎn)生與機體抗氧化防御能力之間的不平衡。對于幼齡動物來說，斷奶和感染可導(dǎo)致氧化應(yīng)激，給細胞抗氧化防御系統(tǒng)帶來巨大的損害[17]。酵母培養(yǎng)物，由釀酒酵母經(jīng)過深度發(fā)酵而成，終端產(chǎn)品包括200 多種代謝產(chǎn)物，具有抗氧化的功能[3]。本研究中發(fā)現(xiàn)，飼糧添加3 000 mg/kg酵母培養(yǎng)物和/或1 000 mg/kg枯草芽孢桿菌顯著降低血清MDA的含量，說明酵母培養(yǎng)物和枯草芽孢桿菌均具有降低脂質(zhì)過氧化程度、降低細胞損傷的功能。機體清除自由基的能力與酶促和非酶抗氧化防御系統(tǒng)有關(guān)，SOD、CAT 和GSH-Px是體內(nèi)具有代表性的酶性抗氧化物質(zhì)，通過減少H2O2的積累對有毒化合物和氧自由基作出反應(yīng)，TAOC 參與非酶抗氧化防御系統(tǒng)[18]。本研究中發(fā)現(xiàn)，飼糧單獨添加3 000 mg/kg酵母培養(yǎng)物，可提高斷奶仔兔血清T-AOC的含量，枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物同時添加顯著提高斷奶仔兔血清SOD活性。本研究結(jié)果與謝開春[19]在肉兔上的研究結(jié)果一致，飼料中添加0.3%或0.6%枯草芽孢桿菌能顯著增加血清GSH-Px、SOD活性及T-AOC，降低MDA 含量。由此說明，枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物可以保護斷奶仔兔免受氧化應(yīng)激的影響，具有維持抗氧化防御系統(tǒng)的功能。

斷奶應(yīng)激除了引起機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激外，也會引起以促炎因子炎癥含量提高為標(biāo)志的免疫反應(yīng)[20]。體液免疫是動物機體特異性免疫的重要組成部分，抗體對毒素的中和作用和免疫調(diào)理吞噬作用都與免疫球蛋白的水平有關(guān)，淋巴細胞產(chǎn)生的免疫球蛋白在血清中的含量可以直接反映機體體液免疫狀態(tài)[21]。本研究中發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物單獨或聯(lián)合使用均可提高斷奶仔兔血清IgA、IgG 和溶菌酶的含量，酵母培養(yǎng)物單獨添加或與枯草芽孢桿菌聯(lián)用顯著提高斷奶仔兔血清IgM 和IFN-γ的含量，這與前人在獺兔或肉兔上單獨添加酵母培養(yǎng)物或枯草芽孢桿菌的研究結(jié)果一致。飼糧添加2%酵母培養(yǎng)物顯著提高獺兔血清IgA 與IgM 的含量，飼糧添加3.0%酵母培養(yǎng)物可以顯著提高血清中IgA 與IgG 的含量[15]。酵母培養(yǎng)物中含有豐富的作為抗原活性物質(zhì)的細胞壁免疫多糖，通過與病原菌的代謝產(chǎn)物作用競爭性抑制其在腸道內(nèi)活動，降低病原性微生物在腸黏膜的附著能力，同時活化多種免疫細胞，提高抗體含量，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[22]。研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物對宿主的體液免疫和細胞免疫均有一定的調(diào)節(jié)作用，如誘導(dǎo)CD4+細胞的增殖，調(diào)節(jié)樹突狀細胞，影響腸黏膜Th 細胞因子的分泌，激活自然殺傷細胞[23-24]。新西蘭大白兔飼喂106CFU/g 枯草芽孢桿菌顯著提高血清中免疫球蛋白IgG 和IgA 的含量，增加胸腺和脾臟相對重量，提高盲腸菌群的物種多樣性，上調(diào)脾臟和空腸模式識別受體核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白1（NOD1）、NOD 樣受體家族 CARD 結(jié)構(gòu)域 3（NLRC3）、富含亮氨酸重復(fù)序列的家族蛋白X1（NLRX1）表達量和下游的白介素1β（IL-1β）、白介素8（IL-8）和IFN-γ以及β防御素表達量，說明枯草芽孢桿菌可以通過激活NOD1誘導(dǎo)下游β防御素的表達從而提高機體抗病力[25]。飼糧添加300、400 mg/kg復(fù)合芽孢桿菌制劑，均能提高肉兔腸黏膜分泌型IgA含量、血清IgM、補體3、補體4的含量，降低肉兔盲腸大腸桿菌和總好氧菌數(shù)量，顯著增加乳酸桿菌、雙歧桿菌和總厭氧菌數(shù)量[26]。因此，從前面提到的所有證據(jù)來看，酵母培養(yǎng)物和枯草芽孢桿菌可通過調(diào)節(jié)細胞因子和抗體的產(chǎn)生誘導(dǎo)仔兔免疫應(yīng)答。

皮質(zhì)醇是一種糖皮質(zhì)激素，能夠抑制機體生長和免疫功能，參與機體糖代謝和熱調(diào)節(jié)，其水平是衡量動物應(yīng)激程度和生理機能變化的重要指標(biāo)之一[27]。應(yīng)激會激活下丘腦垂體腎上腺皮質(zhì)軸，引起體內(nèi)皮質(zhì)醇水平升高，是抑制免疫細胞、導(dǎo)致動物機體免疫功能下降的主要因素[28]。醛固酮是一種鹽皮質(zhì)激素，具有調(diào)節(jié)體內(nèi)Na/K 平衡的功能，在維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起著重要作用[29]。腦脊液和血漿中血管緊張素Ⅱ的含量在機體處于應(yīng)激狀態(tài)下增高，促使醛固酮分泌增加，引起血管收縮，水鈉潴留，Na/K 上升，進一步加重血液動力的障礙[30]。肉雞上的研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激添加益生菌制劑顯著降低血清中皮質(zhì)醇的含量，改善生長性能[31]。豬上的研究發(fā)現(xiàn)，在高溫高濕的狀態(tài)下，添加酵母培養(yǎng)物在一定程度上降低血清中的皮質(zhì)醇濃度，改善長期熱應(yīng)激導(dǎo)致的機體免疫功能下降[32]。奶牛上的研究發(fā)現(xiàn)，飼喂產(chǎn)甘油酵母培養(yǎng)物使血清皮質(zhì)醇含量降低15.71%。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加酵母培養(yǎng)物或與枯草芽孢桿菌聯(lián)用顯著降低斷奶仔兔血清中醛固酮和皮質(zhì)醇的含量以及K/Na 比值，這說明補充酵母培養(yǎng)物和枯草芽孢桿菌后改善了仔兔受應(yīng)激的狀態(tài)。Hsp70 的表達與機體遭受熱應(yīng)激刺激密切相關(guān)，能夠提高機體的抗應(yīng)激能力[33]。研究發(fā)現(xiàn)，夏季動物血液淋巴細胞Hsp70 表達量顯著高于其他季節(jié)[34]。湯志宏等[35]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加酵母培養(yǎng)物或復(fù)合益生菌顯著提高了熱應(yīng)激奶牛42 d 血清中三碘甲腺原氨酸濃度，42 d 血清Hsp70 的含量分別提高了19.20%和23.46%，說明酵母培養(yǎng)物和益生菌可以通過提高血清Hsp70 濃度來增強奶?？箲?yīng)激能力。本試驗是在夏季7 月高溫進行，酵母培養(yǎng)物或枯草芽孢桿菌的添加顯著提高仔兔血清中Hsp70 濃度，提示補充酵母培養(yǎng)物或枯草芽孢桿菌可緩解仔兔遭受高溫應(yīng)激帶來的負面影響。

4 結(jié)論

綜上，飼糧添加3 000 mg/kg 酵母培養(yǎng)物或與1 000 mg/kg 枯草芽孢桿菌聯(lián)用，可提高斷奶仔兔DM、CP 和EE 的表觀消化率；降低血清MDA 的含量，增加血清T-AOC，提高斷奶仔兔抗氧化能力；增加血清中IgA、IgG、IgM 和IFN-γ的含量，改善斷奶仔兔免疫力；降低血清醛固酮、皮質(zhì)醇的含量，增加血清Hsp70 的含量，提高斷奶仔兔抗應(yīng)激能力，最終改善生長性能。