凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)液及其離心上清液、菌懸液的抑菌性能研究

■ 王雪艷 王乙茹 黃遵錫 陳德近 周安樹(shù) 何 雪 安清聰 程志斌*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.達(dá)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 達(dá)州 635001；3.云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650222；4.愛(ài)科特生物工程(昆明)有限公司，云南 昆明 650506)

大量體內(nèi)外試驗(yàn)及綜述表明，抑菌性能是飼用凝結(jié)芽孢桿菌平衡或調(diào)控畜禽腸道菌群、改善生產(chǎn)性能的重要作用機(jī)制之一[1-7]。體外菌株的抑菌性能評(píng)估可用于高效篩選優(yōu)質(zhì)飼用凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)品，常用方法是牛津杯抑菌試驗(yàn)法。然而，當(dāng)前凝結(jié)芽孢桿菌體外牛津杯抑菌試驗(yàn)操作尚無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，造成不同研究報(bào)道的抑菌圈直徑值及其代表的抑菌作用差異較大，這在本課題組前期綜述已有描述。本文推測(cè)，除了不同研究中凝結(jié)芽孢桿菌菌株的差異外，牛津杯體外抑菌的很多操作步驟對(duì)抑菌圈直徑有影響，分析如下：①凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)液及其處理方式。絕大多數(shù)牛津杯抑菌試驗(yàn)操作，均在牛津杯中直接注入凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)液。隨著凝結(jié)芽孢桿菌分泌抗菌肽類物質(zhì)的抑菌機(jī)制逐步清晰[8-10]，近年來(lái)有少量研究將凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)液進(jìn)行前處理，并比較凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)液、培養(yǎng)液離心后的上清液、培養(yǎng)液離心后的底層菌懸液之間抑菌性能的差異，以期獲得客觀、真實(shí)的體外抑菌結(jié)果[11-12]。然而令人遺憾的是，目前少量的報(bào)道結(jié)果有較大差異。②凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)液的pH。很多綜述文章提示，凝結(jié)芽孢桿菌分泌乳酸等酸性物質(zhì)，而乳酸等酸性物質(zhì)具有抑菌性能，這也可能是凝結(jié)芽孢桿菌抑菌作用機(jī)制之一[13-14]。然而，這一假設(shè)并無(wú)更多的體內(nèi)外試驗(yàn)驗(yàn)證，這不利于支撐飼用凝結(jié)芽孢桿菌在畜禽胃腸道不同pH 環(huán)境下，調(diào)控腸道菌群的作用效果。

鑒于此，本試驗(yàn)參照畜禽胃腸道pH環(huán)境，比較研究了凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)液及其離心上清液、菌懸液在不同pH條件下對(duì)3個(gè)腸道有害菌的抑菌作用，為規(guī)范凝結(jié)芽孢桿菌牛津杯抑菌法的操作提供科學(xué)依據(jù)，為科學(xué)、準(zhǔn)確地評(píng)估凝結(jié)芽孢桿菌體外抑菌性能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

凝結(jié)芽孢桿菌（菌株編號(hào)為YNAU 3127）由課題組前期從云南當(dāng)?shù)仄贩N“大河豬”腸道中分離[15-17]。牛津杯體外抑菌試驗(yàn)的指示菌豬霍亂沙門(mén)氏菌（S.choleraesuisBNCC186354）、雞白痢沙門(mén)氏菌（S.pullorumBNCC124693）、大腸桿菌K88（E.coliCGMCC1.2385）購(gòu)買(mǎi)于北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

針對(duì)可能影響凝結(jié)芽孢桿菌牛津杯法體外抑菌作用的兩個(gè)因素（菌液的處理、菌液的pH），試驗(yàn)設(shè)計(jì)了主效應(yīng)因素（菌液的處理）和次效應(yīng)因素（菌液的pH）進(jìn)行研究。①主效應(yīng)設(shè)計(jì)4 個(gè)處理組，對(duì)照組（無(wú)菌蒸餾水, sterile distilled water，SDW組）、凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)液組（B.coagulansculture solution，BCS組）、凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)液離心后的上清液組（centrifuged supernatant ofB.coagulansculture solution, CSS 組）、凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)液離心后的底層菌懸液組（centrifuged bacterial suspension ofB.coagulansculture solution, CBS 組）；②次效應(yīng)參照畜禽胃腸道pH，設(shè)計(jì)pH 2.5、4.0、5.5、7.0條件下，檢測(cè)4個(gè)處理組對(duì)3個(gè)腸道有害菌指示菌的體外抑制作用。

1.3 牛津杯抑菌試驗(yàn)

1.3.1 BCS組、CSS組、CBS組的制備

1.3.1.1 制備凝結(jié)芽孢桿菌菌液采用改良MRS 培養(yǎng)基，有氧培養(yǎng)凝結(jié)芽孢桿菌24 h[15-16]，制備凝結(jié)芽孢桿菌菌液180 mL。

1.3.1.2 調(diào)整凝結(jié)芽孢桿菌菌液的pH

將180 mL分為4份（每份45 mL），裝于4個(gè)50 mL無(wú)菌離心管。依據(jù)菌液初始pH（實(shí)測(cè)pH 為4.7±0.1），用乳酸和NaOH 依次將4 個(gè)離心管的菌液pH 調(diào)為2.5、4.0、5.5、7.0。

1.3.1.3 制備凝結(jié)芽孢桿菌的BCS組、CSS組、CBS組

調(diào)完pH 后，從4 個(gè)離心管中各取5 mL，裝入4 個(gè)EP管中，作為BCS組。隨后，將4個(gè)離心管剩余菌液高速離心處理（10 000 r/min、15 min），上清液移出裝入4 個(gè)EP 管，作為CSS 組。同時(shí)，底層的懸濁液（＞600 μL）盡量移出，作為CBS 組。制備好的BCS 組、CSS 組、CBS組放于4 ℃冰箱中備用。

1.3.2 SDW組的制備

取4 等份無(wú)菌蒸餾水，置于滅過(guò)菌的EP 管中，分別調(diào)節(jié)pH 至2.5、4.0、5.5、7.0，作為SDW 組，于4 ℃冰箱中備用。

為了全面提高柳林縣鄉(xiāng)鎮(zhèn)抗旱應(yīng)急能力，保障嚴(yán)重干旱年城鄉(xiāng)用水安全，推進(jìn)構(gòu)建與經(jīng)濟(jì)社會(huì)可持續(xù)發(fā)展相適應(yīng)的抗旱減災(zāi)體系，為全縣經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)型發(fā)展、跨越發(fā)展、和諧發(fā)展打造良好用水環(huán)境，提供有力水資源支撐，根據(jù)國(guó)家水利部組織編制的《抗旱規(guī)劃實(shí)施方案（2013—2017年）》大綱和省、市水利部門(mén)統(tǒng)一安排，結(jié)合柳林縣實(shí)際，縣水利局制定了《柳林縣抗旱規(guī)劃實(shí)施方案》。

1.3.3 指示菌涂布平板的制備

指示菌涂布平板的制備參考前期報(bào)道[18]。3個(gè)指示菌豬霍亂沙門(mén)氏菌、雞白痢沙門(mén)氏菌、大腸桿菌采用LB 培養(yǎng)基，有氧培養(yǎng)24 h。隨后，從3 個(gè)指示菌培養(yǎng)液中各取800 μL，加入裝有7.2 mL 蒸餾水的EP 管中。以上操作重復(fù)2 次，逐次稀釋至10-2。進(jìn)一步從10-2菌液中吸取200 μL，涂布于MRS 培養(yǎng)基平板上，每個(gè)指示菌涂3個(gè)平板。

平板靜置15 min 后，即可用于抑菌圈直徑（diameter of inhibition zone，DIZ）的測(cè)定。以上操作重復(fù)3次。

1.3.4 抑菌圈直徑測(cè)定方法

每個(gè)平板上放置4 個(gè)牛津杯，牛津杯中依次加入的200 μL 的SDW、CSS、BCS、CBS，隨后平板于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12 h后取出平板，用游標(biāo)卡尺測(cè)定DIZ值[15]。

以DIZ 值判定抑菌作用（見(jiàn)表1）[15]，評(píng)估主效應(yīng)及次效應(yīng)對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌體外抑菌作用的影響，確定凝結(jié)芽孢桿菌牛津杯法體外抑菌試驗(yàn)的合理操作。

表1 抑菌作用的判定標(biāo)準(zhǔn)[15]

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

同一個(gè)pH 條件下，對(duì)菌液處理的3 個(gè)處理組（BCS、CSS、CBS 組）及無(wú)菌蒸餾水的對(duì)照組（SDW組），進(jìn)行抑菌圈直徑數(shù)據(jù)的單因素方差分析和LSD多重比較；對(duì)同一處理組，在不同pH 條件下測(cè)定的抑菌圈直徑數(shù)據(jù)，進(jìn)行單因素方差分析和LSD 多重比較。統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS 21.0，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 BCS 組、CSS 組、CBS 組在不同pH 條件下對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌的抑制作用

由表2 和圖1 結(jié)果可知，pH 4.0、5.5、7.0 條件下，BCS 組和CBS 組對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌均有抑制作用，且CBS 組抑制效果顯著大于BCS 組（P＜0.05）。CSS 組在pH 4.0 條件下，對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌有抑制作用（敏感），但在pH 5.5 和7.0 時(shí)均無(wú)抑制作用（不敏感）。SDW 組在pH 4.0、5.5 和7.0 時(shí)，對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌均無(wú)抑制作用（不敏感）。此外，pH 2.5條件下，4個(gè)處理組對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌有強(qiáng)抑制作用（高敏感），BCS、CSS、CBS 3 組之間抑制效果差異不顯著，且抑制作用均顯著大于SDW組（P＜0.05）。

圖1 BCS組、CSS組、CBS組在不同pH條件下對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌的抑制作用

表2 BCS組、CSS組、CBS組在不同pH條件下對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌的抑制作用(DIZ值, mm)

2.2 BCS 組、CSS 組、CBS 組在不同pH 條件下對(duì)雞白痢沙門(mén)氏菌的抑制作用

表3 和圖2 結(jié)果可知，pH 4.0、5.5、7.0 條件下，BCS 組和CBS 組對(duì)雞白痢沙門(mén)氏菌均有抑制作用（敏感），且CBS 組抑制效果顯著大于BCS 組（P＜0.05）。CSS 組在pH 4.0 條件下，對(duì)雞白痢沙門(mén)氏菌有抑制作用（敏感），但在pH 5.5 和7.0 時(shí)均無(wú)抑制作用（不敏感）。SDW 組在pH 4.0、5.5和7.0時(shí)，對(duì)雞白痢沙門(mén)氏菌均無(wú)抑制作用（不敏感）。此外，pH 2.5條件下，4個(gè)處理組對(duì)雞白痢沙門(mén)氏菌有強(qiáng)抑制作用（高敏感），BCS、CSS、CBS 3組之間抑制效果差異不顯著，且抑制作用均顯著大于SDW組（P＜0.05）。

圖2 BCS組、CSS組、CBS組在不同pH條件下對(duì)雞白痢沙門(mén)氏菌的抑制作用

表3 BCS組、CSS組、CBS組在不同pH條件下對(duì)雞白痢沙門(mén)氏菌的抑制作用(DIZ值，mm)

2.3 BCS 組、CSS 組、CBS 組在不同pH 條件下對(duì)大腸桿菌K88的抑制作用

表4 和圖3 結(jié)果可知，pH 4.0、5.5、7.0 條件下，BCS 組和CBS 組對(duì)大腸桿菌K88 均有抑制作用（敏感），且CBS 組抑制效果顯著大于BCS 組（P＜0.05）。CSS 組在pH 4.0 條件下，對(duì)大腸桿菌K88 有抑制作用（敏感），但在pH 5.5和7.0時(shí)均無(wú)抑制作用（不敏感）。SDW 組在pH 4.0、5.5 和7.0 時(shí)，對(duì)大腸桿菌K88 均無(wú)抑制作用（不敏感）。此外，pH2.5 條件下，4 個(gè)處理組對(duì)大腸桿菌K88 有強(qiáng)抑制作用（高敏感），BCS、CSS、CBS 3 組之間抑制效果差異不顯著，且抑制作用均顯著大于SDW組（P＜0.05）。

圖3 BCS組、CSS組、CBS組在不同pH條件下對(duì)大腸桿菌K88的抑制作用

表4 BCS組、CSS組、CBS組在不同pH條件下對(duì)大腸桿菌K88的抑制作用(DIZ值, mm)

3 討論

現(xiàn)有凝結(jié)芽孢桿菌體外牛津杯抑菌試驗(yàn)報(bào)道中，大部分操作是將凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)液（BCS）直接注入牛津杯，檢測(cè)抑菌圈直徑來(lái)表征抑菌作用的強(qiáng)弱[16-20]，但少量報(bào)道是用培養(yǎng)液的離心上清液(CSS)注入牛津杯，檢測(cè)抑菌圈直徑[21-23]。鑒于這一試驗(yàn)操作差異，劉冬梅等[11]和林松泉等[12]比較了凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)液(BCS)及其離心處理的上清液(CSS)、菌懸液(CBS)抑菌效果差異。劉冬梅等[11]研究顯示，凝結(jié)芽孢桿菌抑菌性能“CSS組顯著強(qiáng)于CBS組，CSS＞CBS”；林松泉等[12]進(jìn)一步報(bào)道，凝結(jié)芽孢桿菌抑菌性能“CSS＞BCS＞CBS”。以上結(jié)果與本研究凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)3 個(gè)指示菌的綜合（pH 為4.0～7.0）抑菌性能“CBS組＞BCS組＞CSS組”矛盾。

很多試驗(yàn)研究證明，凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)液中含有多種高分子抗菌蛋白和（或）肽類抑菌物質(zhì)[9-10，24]，是凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)揮抑菌作用的關(guān)鍵。眾所周知，培養(yǎng)液中均勻分布的蛋白質(zhì)或肽類物質(zhì)，在高速離心作用下，會(huì)更多地向離心管底部聚集。因此，理論上若僅考慮凝結(jié)芽孢桿菌所分泌的抗菌蛋白或抗菌肽濃度對(duì)抑菌性能的影響，抑菌性能“CBS＞BCS＞CSS”是合理的，這也與本試驗(yàn)主效應(yīng)的研究結(jié)果相符。此外，考慮到離心操作設(shè)備及參數(shù)帶來(lái)的可能差異，本研究建議直接用培養(yǎng)液（BCS）開(kāi)展凝結(jié)芽孢桿菌牛津杯體外抑菌試驗(yàn)。

除高分子抗菌蛋白和（或）肽類抑菌物質(zhì)外，凝結(jié)芽孢桿菌同時(shí)分泌乳酸等多種低分子有機(jī)酸，也可能是凝結(jié)芽孢桿菌體外抑菌、體內(nèi)調(diào)控腸道菌群的作用機(jī)制之一[13-14，25]。有機(jī)酸中H+能降低pH，理論上有抑制腸道有害菌增殖的作用。鑒于此，本試驗(yàn)次效應(yīng)研究，實(shí)測(cè)了該株凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)液pH 為4.7 后，將培養(yǎng)液進(jìn)一步調(diào)整為pH 2.5（胃環(huán)境）及4.0、5.5、7.0（腸道環(huán)境），模擬畜禽胃腸道pH環(huán)境，評(píng)估H+對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌抑菌性能的影響，為飼用凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)畜禽胃腸道菌群的調(diào)控效果提供支撐。綜合對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌、雞白痢沙門(mén)氏菌、大腸桿菌K88等3個(gè)指示菌的抑菌結(jié)果顯示，pH 調(diào)整為4.0、5.5、7.0 對(duì)培養(yǎng)液（BCS）的抑菌性能無(wú)顯著影響，且pH 4.0、5.5、7.0對(duì)菌懸液（CBS）的抑菌性能也無(wú)顯著影響。以上結(jié)果表明，飼用凝結(jié)芽孢桿菌在畜禽腸道pH 范圍內(nèi)，其抑菌性能不受pH影響；基于飼用凝結(jié)芽孢桿菌在腸道內(nèi)分泌的各類有機(jī)酸，被食糜、消化器官分泌液等不同程度地緩沖，以上結(jié)果進(jìn)一步提示，“產(chǎn)酸抑菌”不是飼用凝結(jié)芽孢桿菌調(diào)控畜禽腸道菌群的主導(dǎo)機(jī)制。

此外，綜合3 個(gè)指示菌的抑菌結(jié)果均顯示，培養(yǎng)液組（BCS）pH 2.5 時(shí)的抑菌圈直徑（DIZ=23.82～25.09，高敏感）幾乎是pH 4.0～7.0 時(shí)測(cè)定結(jié)果（DIZ=11.08～14.54，敏感）的約2 倍，由于培養(yǎng)液中主導(dǎo)抑菌作用的抗菌蛋白或抗菌肽含量恒定，這一變化顯然是高濃度H+造成的。為驗(yàn)證這一觀點(diǎn)，本研究對(duì)照組無(wú)菌蒸餾水（SDW 組），先用乳酸將pH 調(diào)整為至2.5，檢測(cè)SDW 對(duì)3個(gè)指示菌抑制作用也達(dá)到了“高敏感”；隨后，用氫氧化鈉降低SDW 中的H+、將pH 調(diào)整為4.0、5.5 和7.0 時(shí)，檢測(cè)SDW 對(duì)3 個(gè)指示菌均無(wú)抑制作用。由于該株凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)液實(shí)測(cè)pH 為4.7，因此以上的結(jié)果證明“產(chǎn)酸抑菌機(jī)制”不是飼用凝結(jié)芽孢桿菌調(diào)控胃腸道菌群的主導(dǎo)機(jī)制。

綜上所述，用牛津杯法體外評(píng)估凝結(jié)芽孢桿菌抑菌性能時(shí)，凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)液和菌懸液均可用于反映凝結(jié)芽孢桿菌的抑菌性能，但培養(yǎng)液操作更方便。同時(shí)模擬畜禽腸道pH 環(huán)境發(fā)現(xiàn)，凝結(jié)芽孢桿菌抑菌性能不受pH影響。

4 結(jié)論

本研究表明，凝結(jié)芽孢桿菌的培養(yǎng)液適合用于牛津杯抑菌試驗(yàn)操作。進(jìn)一步通過(guò)模擬畜禽腸道的不同pH 條件（pH 4～7），發(fā)現(xiàn)用凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)液評(píng)估的抑菌性能（抑菌圈直徑數(shù)據(jù)）差異不顯著。以上研究結(jié)果為規(guī)范凝結(jié)芽孢桿菌體外牛津杯抑菌試驗(yàn)操作、進(jìn)一步闡明抑菌機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。