女貞不同部位總黃酮含量對(duì)比及其抗氧化性能研究

■ 徐瑞芳

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

女貞樹簡(jiǎn)稱女貞（Ligustrum lucidumAit.），木犀科常綠植物，分布于華東、華南、西南及華中各地。女貞子（Fructus ligustri lucidi）為木犀科植物女貞的果實(shí)，具有補(bǔ)腰膝、壯筋骨、烏須發(fā)等作用，作為中藥應(yīng)用已有2 000 多年[1-3]。女貞子化學(xué)成分豐富，主要包含萜類、黃酮類、揮發(fā)油及多糖等成分，其中黃酮類化合物（Flavonoids）是一類存在于自然界的、具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)的化合物[4-6]。研究表明，女貞子及其提取物應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)中，具有提高生產(chǎn)性能、抗氧化、提高免疫力、促進(jìn)脂類代謝、抑菌抗炎、改善畜禽產(chǎn)品品質(zhì)等功能[7-9]。

黃酮類化合物是天然的抗氧化劑，能夠抑制和清除動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的不良自由基（主要來自酶促反應(yīng)或非酶促反應(yīng)），在生物系統(tǒng)中具有保護(hù)功能[10-12]。研究表明，黃酮類化合物有抗氧化、抗微生物、提高免疫力、抗炎抑菌、降血糖、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和抗癌等藥理作用[13-15]；可以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育、提高動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量，因此在動(dòng)物生產(chǎn)中被廣泛用作飼料添加劑[16-18]。

女貞子在我國(guó)分布廣泛、資源多、價(jià)格低，它作為飼料添加劑具備無殘留、無抗藥性等特點(diǎn)[19]。女貞中的黃酮類物質(zhì)是女貞發(fā)揮藥理活性的重要成分，其含量是鑒別評(píng)價(jià)女貞質(zhì)量的標(biāo)志物之一[20-21]。女貞總黃酮的研究多在女貞子黃酮含量測(cè)定及提取工藝方面，關(guān)于女貞不同部位黃酮的含量及活性是否有差異報(bào)道較少。試驗(yàn)選取女貞樹的莖、葉、果實(shí)作為研究材料，采用超聲波提取總黃酮，并以其總還原能力、清除DPPH·和ABTS+·的能力來評(píng)價(jià)其抗氧化活性，研究女貞樹各部位總黃酮含量與抗氧化活性，為女貞樹資源的充分開發(fā)利用提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

女貞葉、女貞莖、女貞子（青果）采于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院內(nèi)（2022 年9 月份，采集植株30 棵），并另采取女貞子（紫果）（2022 年12 月份，采樣植株同9月份）。

蘆丁，≥98%，上海源葉生物科技有限公司；抗壞血酸（VC），分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH），96%，上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；2,2'氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽（ABTS），98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無水乙醇、甲醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁等其他試劑均為分析純。

XFB型中藥粉碎機(jī)，湖南中誠制藥機(jī)械廠；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海科恒實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；BSA224S 分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；SHZ-DⅢ循環(huán)水式多用真空泵，上海力辰邦西儀器科技有限公司；TD4 低速離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；R206 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生科技有限公司；UV-1600 型紫外可見分光光度計(jì)，翱藝儀器有限公司。

1.2 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.02 g，用無水甲醇溶解定容于100 mL 容量瓶制備0.2 mg/mL 蘆丁對(duì)照品溶液。取蘆丁對(duì)照品溶液0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL 到7 個(gè)潔凈的10 mL 容量瓶中，用50%的乙醇補(bǔ)充至4 mL，然后依次向其中先加入5%的亞硝酸鈉試劑0.4 mL搖勻后靜放10 min，再加入10%的硝酸鋁試劑0.4 mL并搖勻后靜放10 min，再加入4%的氫氧化鈉試劑4 mL，之后以50%的乙醇定容至10 mL，震搖后靜放15 min。用紫外可見分光光度計(jì)在510 nm，以空白溶液校零，檢測(cè)各濃度的吸光度值A(chǔ)。以不同的蘆丁濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，各濃度的吸光度值A(chǔ) 為縱坐標(biāo)繪圖，得到線性回歸方程。

1.3 材料預(yù)處理

將女貞葉、女貞莖和女貞子（青果）、女貞子（紫果）用清水沖洗干凈，放置于恒溫干燥箱中，70 ℃烘干至恒重，用中藥粉碎機(jī)粉碎至粉末狀態(tài)，分別放置于干燥廣口玻璃瓶中常溫保存。

1.4 超聲波提取總黃酮

超聲波是一種空化機(jī)械波，其產(chǎn)生的空化效應(yīng)可以加速活性物質(zhì)的溶出，運(yùn)用超聲輔助提取天然活性物質(zhì)不僅可以提高得率，還能避免因提取溫度過高而對(duì)活性物質(zhì)產(chǎn)生的破壞作用[22-23]。參考周旋等[24]對(duì)超聲輔助提取女貞子總黃酮工藝研究方法，設(shè)計(jì)以下操作方法。

準(zhǔn)確稱取女貞葉粉末2 g 放入錐形瓶中，以料液比1∶50（g∶mL）加入濃度為60%的乙醇100 mL，200 W，超聲90 min，4 000 r/min 離心10 min 收集上清，沉淀重復(fù)超聲一次，合并濾液，取1 mL 總濾液按照1.2 的方法測(cè)定吸光度A，帶入線性回歸方程計(jì)算女貞總黃酮的含量，用公式（1）計(jì)算得到女貞總黃酮含量（mg/g），重復(fù)3 次操作計(jì)算平均值，女貞莖、女貞子（青果）、女貞子（紫果）的總黃酮提取方法及計(jì)算方式同女貞葉。

1.5 女貞各部位總黃酮粗純化

將女貞葉、女貞莖和女貞子（青果）、女貞子（紫果）總黃酮提取液分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行旋蒸，濃縮成浸膏，用蒸餾水沖洗下來。為除去其中所含的脂溶性雜質(zhì)及葉綠素等干擾物質(zhì)，用等量的石油醚溶液對(duì)其進(jìn)行萃取，反復(fù)萃取至石油醚層無色，收集水相繼續(xù)進(jìn)行旋蒸，濃縮成浸膏，再用無水乙醇溶解，移入離心管中標(biāo)記為不同部位女貞總黃酮儲(chǔ)備液，4 ℃冰箱保存。

1.6 不同部位女貞總黃酮的體外抗氧化性試驗(yàn)

1.6.1 總還原力測(cè)定方法

將純化后的葉、莖、紫果、青果黃酮溶液配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 樣品溶液。取0.4 mL黃酮溶液，加入pH 為6.6 的0.2 mol/L 磷酸緩沖溶液和1%的鐵氰化鉀溶液各1 mL，混勻后50 ℃水浴20 min，冰水浴快速降溫，再加入1 mL 10%的三氯乙酸溶液，搖勻，置于離心機(jī)，4 000 r/min 離心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水、0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液中止反應(yīng)，靜置10 min 后。以蒸餾水調(diào)零，于700 nm處測(cè)定吸光度，并以相同濃度的抗壞血酸（VC）做陽性對(duì)照，重復(fù)操作3次取均值。

1.6.2 女貞總黃酮對(duì)DPPH·清除作用

將純化后的葉、莖、紫果、青果黃酮溶液配制成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08、0.10 mg/mL 樣品溶液。取樣品溶液2.0 mL，加入2.0 mL 0.04 mg/mL的DPPH-乙醇溶液，混勻后放于暗處充分反應(yīng)30 min，在510 nm 處檢測(cè)待測(cè)溶液吸光度記為A 樣品。以無水乙醇代替樣品溶液的吸光度值為A 空白，以無水乙醇代替DPPH 溶液的吸光度值作為A對(duì)照 ，以同濃度的抗壞血酸（VC）溶液作為陽性對(duì)照。重復(fù)3次算平均值，用公式（2）計(jì)算得到清除率，公式如下：

1.6.3 女貞總黃酮清除ABTS+·活性測(cè)定

取等體積的2.6 mmol/L 過硫酸鉀溶液和7.4 mmol/L ABTS 溶液均勻混合，室溫下避光靜置16 h 作為儲(chǔ)備液避光密封保存。取儲(chǔ)備液用蒸餾水稀釋，檢測(cè)734 nm 波長(zhǎng)下的吸光度為0.70±0.02 即制得ABTS工作液，溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。

將純化后的葉、莖、紫果、青果黃酮溶液配制成0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20 mg/mL樣品溶液。取樣品溶液0.2 mL，加入3 mL ABTS 工作液混勻后反應(yīng)15 min，于734 nm 處測(cè)定吸光度A 樣品，以蒸餾水代替樣品溶液的吸光度值為A空白，以蒸餾水代替ABTS 溶液的吸光度值作為 A 對(duì)照，以同濃度的抗壞血酸（VC）溶液作為陽性對(duì)照。重復(fù)3次算平均值，用公式（2）計(jì)算得到清除率。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel統(tǒng)計(jì)記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線、女貞各部位總黃酮含量計(jì)算采用Excel 計(jì)算分析；用SPSS 5.0 分析計(jì)算不同部位總黃酮抗氧化結(jié)果的差異顯著性及半數(shù)清除率；文中圖片均采用 GraphPad Prism 5制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，方程是：y=0.012 6x+0.004 5（R2=0.998），當(dāng)濃度在0.00～60.00 μg/mL 區(qū)間時(shí)，存在良好的線性關(guān)系，可以作為女貞總黃酮含量的計(jì)算公式。

圖1 蘆丁質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 女貞不同部位總黃酮提取率

女貞不同部位總黃酮超聲提取測(cè)定結(jié)果見表1，女貞不同部位總黃酮含量大小為：女貞子（青果）＞女貞子（紫果）＞女貞葉＞女貞莖。女貞樹中，女貞子黃酮含量較其他部位高，而不同時(shí)期女貞子中黃酮含量存在變化，以青色女貞子總黃酮含量最高。

表1 女貞不同部位總黃酮含量（mg/g）

2.3 女貞不同部位總黃酮抗氧化能力的測(cè)定

2.3.1 總還原力的測(cè)定

女貞葉、女貞莖、女貞子（青果）、女貞子（紫果）所含總黃酮的總還原力測(cè)定結(jié)果如圖2 所示，在相同濃度下，抗壞血酸（VC）溶液的總還原力明顯比女貞總黃酮溶液的總還原力強(qiáng)，女貞4 種樣品總黃酮總還原力隨樣品溶液濃度增加而加強(qiáng)，也具有良好的還原能力。各樣品還原能力差異顯著性分析結(jié)果如圖3 所示，樣品濃度在0.1～0.3 mg/mL 時(shí)，女貞葉與女貞莖還原能力大于女貞青果和紫果，差異顯著（P＜0.05）；在0.4 mg/mL 時(shí)，女貞青果的還原力增加至與女貞莖還原力相當(dāng)，女貞葉還原能力較女貞其他3 個(gè)部位強(qiáng)（P＜0.05），女貞紫果還原能力小于女貞其他3 個(gè)部位（P＜0.05）；在0.5 mg/mL 時(shí)，女貞葉（1.747）、女貞莖（1.719）、青果（1.720）還原能力基本持平，紫果（1.535）還原能力較上述3 種小，且差異顯著（P＜0.05）。女貞葉和女貞莖與女貞子相比還原能力較好，不同時(shí)期的女貞子的還原力有一定的差異。

圖2 女貞各樣品黃酮總還原力

圖3 女貞各樣品黃酮總還原力比較

2.3.2 對(duì)DPPH·消除率的測(cè)定

女貞葉、女貞莖、女貞子（青果）、女貞子（紫果）所含的總黃酮對(duì)DPPH·的清除效果如圖4 所示，抗壞血酸溶液對(duì)DPPH·的消除力高于女貞各樣品總黃酮，在0.01～0.06 mg/mL，隨著女貞各樣品濃度的增加，各樣品對(duì)DPPH·的消除率增加。在樣品濃度為0.06 mg/mL之后，女貞葉、女貞子（青果）、女貞子（紫果）對(duì)DPPH·的消除率增長(zhǎng)緩慢趨于平穩(wěn)；在樣品濃度為0.01 mg/mL時(shí)，三者對(duì)DPPH·消除效率達(dá)到95%以上；而女貞莖對(duì)DPPH·的消除率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。用SPSS 計(jì)算樣品對(duì) DPPH·的半數(shù)清除率（IC50）并進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果如圖5 所示，VC、女貞葉、女貞莖、女貞子（青果）、女貞子（紫果）為0.741、10.539、11.940、8.882、10.150 μg/mL，VC 對(duì)DPPH·的消除效率高于女貞各樣品，女貞子（青果）對(duì)DPPH·的消除效率要優(yōu)于其他3種樣品，女貞4種樣品對(duì)DPPH·的消除力為：女貞子（青果）＞女貞子（紫果）＞女貞葉＞女貞莖。

圖4 女貞各樣品黃酮對(duì)DPPH·的清除率

圖5 女貞各樣品黃酮對(duì)DPPH·的IC50

2.3.3 對(duì)ABTS+·消除率的測(cè)定

女貞葉、女貞莖、女貞子（青果）、女貞子（紫果）總黃酮對(duì)ABTS+·的消除效果測(cè)定結(jié)果如圖6 所示，VC對(duì)ABTS+·的消除力明顯高于各部位女貞總黃酮，隨著女貞各樣品濃度的增加，各樣品對(duì)ABTS+·的消除率增加，樣品濃度在0.20 mg/mL 時(shí)，女貞葉、女貞莖、女貞子（青果）、女貞子（紫果）對(duì)ABTS+·消除效率分別為92.48%、90.33%、87.25%、81.51%。用SPSS 計(jì)算各樣品對(duì)DPPH·的IC50并進(jìn)行顯著性差異分析，結(jié)果如圖7所示，VC、女貞葉、女貞莖、女貞子（青果）、女貞子（紫果）對(duì)ABTS+·的IC50為26.468、46.571、53.274、76.139、94.669 μg/mL，女貞葉對(duì)ABTS+·的消除力較女貞其他3 種成分效果好。女貞4 種樣品對(duì)ABTS+·的消除力為：女貞葉＞女貞莖＞女貞子（青果）＞女貞子（紫果）。

圖6 女貞各樣品黃酮對(duì)ABTS+·消除率

圖7 女貞各樣品黃酮對(duì)ABTS+·的IC50

3 討論

從植物中提取黃酮類化合物可以用來制備動(dòng)物飼料添加劑，利用藥用植物的有效成分替代抗生素也是飼料業(yè)的研究熱點(diǎn)[25]。黃酮類化合物是藥用植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物，可以在植物的根、莖、葉、花、果實(shí)和種子等各個(gè)器官中合成并積累，藥用植物的主要藥用成分含量隨著生長(zhǎng)季節(jié)和生長(zhǎng)年限發(fā)生著動(dòng)態(tài)變化；同時(shí)，在不同器官與組織中合成或積累的成分質(zhì)和量也有所不同[26-27]。

在料液比1∶50（g∶mL）、60%的乙醇溶液、超聲功率200 W、超聲90 min（重復(fù)1 次）的條件下提取女貞各部位總黃酮，女貞葉中含量達(dá)到35.21 mg/g，女貞莖中達(dá)16.38 mg/g，女貞子（青果）中達(dá)70.61 mg/g，女貞子（紫果）中達(dá)59.92 mg/g。試驗(yàn)結(jié)果表明，黃酮類化合物在女貞樹不同組織器官中合成和積累的含量有所差異，推測(cè)女貞樹的果實(shí)和葉子是產(chǎn)生黃酮類化合物的主要組織器官；莖作為營(yíng)養(yǎng)成分運(yùn)輸?shù)慕M織，黃酮類化合物產(chǎn)生和積累較少。青果時(shí)期女貞子中總黃酮含量大于紫果時(shí)期女貞子的總黃酮含量，12月份女貞子處于成熟時(shí)期，其黃酮化合物含量有所下降。仇小月等[28]研究發(fā)現(xiàn)女貞子中總黃酮、總?cè)坪投嗵呛侩S著月份的遞增整體均呈下降趨勢(shì)，總黃酮和總?cè)圃?月初達(dá)到最大值。鄭志慧等[29]研究發(fā)現(xiàn)女貞葉和女貞子黃酮含量隨采摘時(shí)間不同變化幅度明顯。研究結(jié)果與上述研究相一致，表明女貞果中黃酮類化合物的產(chǎn)生與積累隨時(shí)間有一定的變化。

3種抗氧化試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明女貞總黃酮有良好的抗氧化能力，其中女貞葉和女貞莖的總還原能力和對(duì)ABTS+·的清除能力較女貞子好；女貞子對(duì)DPPH·的清除能力優(yōu)于女貞葉和女貞莖，由此推測(cè)女貞不同部位積累的黃酮成分結(jié)構(gòu)存在差異，因此所起到的抗氧化活性不相同。隨著各樣品濃度增加，女貞子和女貞葉對(duì)DPPH·清除率均達(dá)到95%以上，且總體而言女貞子（青果）的抗氧化能力高于女貞子（紫果）的能力。上官琨瑤等[30]通過比較月季花不同采收期總黃酮含量與其抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)月季花總黃酮含量在4 月份最高，7 月份抗氧化活性最強(qiáng)。研究結(jié)果也顯示女貞子不同時(shí)期的總黃酮抗氧化能力有所變化，女貞子（青果）的抗氧化能力高于女貞子（紫果）能力，表明在植物相同部位積累的黃酮種類及結(jié)構(gòu)隨生長(zhǎng)時(shí)間不同也會(huì)發(fā)生變化。

4 結(jié)論

女貞子的總黃酮含量較其他部位高，且青果黃酮得率（70.61 mg/g）也較紫果（59.92 mg/g）高，青果的抗氧化能力也優(yōu)于紫果，因此在青果期間采摘可以獲取更高質(zhì)量的總黃酮。而女貞葉總黃酮得率雖然較女貞子少，但抗氧化能力良好，且黃酮得率可達(dá)到35.21 mg/g。女貞葉資源豐富，也可作為女貞總黃酮獲取的材料之一，在制備飼料添加劑方面有一定的研究?jī)r(jià)值。