液態(tài)芯片技術(shù)篩選胸腔積液細(xì)胞因子對(duì)結(jié)核性胸膜炎的診斷價(jià)值

杜鳳嬌 杜博平 賈紅彥 邢愛英 李自慧 朱傳智 李華

摘要：目的 應(yīng)用液態(tài)芯片技術(shù)篩選結(jié)核性胸膜炎（plTB）胸腔積液結(jié)核特異性細(xì)胞因子建立診斷模型，并探討其應(yīng)用價(jià)值。方法 納入plTB患者（plTB組）86例，其中確診plTB組41例，臨床診斷plTB組45例；其他胸腔積液患者（對(duì)照組）42例。采用液相芯片技術(shù)分析胸腔積液17個(gè)細(xì)胞因子，包括白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、γ-干擾素誘導(dǎo)蛋白10（IP-10）、IL-15、IL-17F、IL-27、腫瘤壞死因子（TNF）-α、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-3a（MIP-3α）、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）、β-干擾素（IFN-β）的表達(dá)量。篩選確診plTB組和對(duì)照組組間差異因子，并在確診plTB患者中繪制受試者工作特征（ROC）曲線，將AUC＞0.850、特異度＞80%的IP-10、IL-27和MCP-1聯(lián)合診斷plTB，并同胸腔積液腺苷酸脫氨酶（ADA）檢測(cè)和結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT.TB）比較，評(píng)估診斷效能。結(jié)果 確診plTB組IL-2、IP-10、IL-27、TNF-α和MCP-1水平均高于對(duì)照組（P＜0.05）；IP-10、IL-27和MCP-1三因子聯(lián)合確診plTB的敏感度為87.8%，特異度為81.0%；三因子聯(lián)合診斷在45例臨床診斷plTB組中的敏感度仍高達(dá)86.7%，與確診plTB組的敏感度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。plTB組中，TIP-10、IL-27和MCP-1三因子聯(lián)合檢測(cè)的敏感度為87.2%，高于T-SPOT.TB單獨(dú)檢測(cè)（81.4%）和ADA單獨(dú)檢測(cè)（54.7%）。結(jié)論 應(yīng)用液態(tài)芯片技術(shù)對(duì)胸腔積液IP-10、IL-27和MCP-1聯(lián)合檢測(cè)，可為plTB診斷提供幫助。

關(guān)鍵詞：結(jié)核；胸腔積液；胸膜炎；白細(xì)胞介素-27；液態(tài)芯片技術(shù)；γ-干擾素誘導(dǎo)蛋白10；單核細(xì)胞趨化蛋白-1

中圖分類號(hào)：R521文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.11958/20230793

Study on the value of screening cytokines in pleural effusion by liquid array technology in the diagnosis of tuberculous pleurisy

DU Fengjiao1， DU Boping1， JIA Hongyan1， XING Aiying1， LI Zihui1， ZHU Chuanzhi1， LI Hua2△

1 Beijing Key Laboratory of Drug Resistance Tuberculosis Research， Beijing 101149， China; 2 Department of Tuberculosis Two， Beijing Chest Hospital， Capital Medical University， Beijing Tuberculosis and Thoracic Tumor Research Institute

△Corresponding Author E-mail： lhlbw1997@hotmail.com

Abstract： Objective To screen the specific cytokines of tuberculous pleural effusion （plTB） by using liquid array technique to establish a diagnostic model and discuss its application value. Methods A total of 86 patients with plTB （plTB group） were included， including 41 patients in the confirmed plTB group and 45 patients in the clinically diagnosed plTB group. There were 42 other patients with pleural effusion in the control group. Seventeen cytokines in pleural effusion were analyzed by liquid array technology. Interleukin （IL） -1β， IL-2， IL-4， IL-5， IL-6， IL-8， IL-9， IL-10， gamma-interferon-induced protein 10 （IP-10）， IL-15， IL-17F， IL-27， tumor necrosis factor （TNF） -α， monocyte chemotactic protein-1 （MCP-1）， the expression levels of macrophage inflammatory protein-3a （MIP-3α）， macrophage colony-stimulating factor （M-CSF） and β-interferon （IFN-β） were detected. Difference factors between the confirmed plTB group and the control group were screened， and the receiver operating characteristic （ROC） curve was drawn in the confirmed plTB patients. IP-10， IL-27 and MCP-1 with AUC > 0.850 and specificity > 80% were combined to diagnose plTB， and were compared with adenylate deaminase （ADA） and T-SPOT.TB in pleural effusion to evaluate the diagnostic efficacy. Results The levels of IL-2， IP-10， IL-27， TNF-α and MCP-1 were higher in the confirmed plTB group than those in the control group （P＜0.05）. The sensitivity and specificity of IP-10， IL-27 and MCP-1 in the diagnosis of plTB were 87.8% and 81.0%. The sensitivity of three-factor combined diagnosis in 45 patients with plTB was still as high as 86.7%， and there was no significant difference in sensitivity compared with that in the diagnosed plTB group （P＞0.05）. In the plTB group， the sensitivity of IP-10， IL-27 and MCP-1 combined detection was 87.2%，which was higher than that of T-SPOT.TB （81.4%） and ADA （54.7%）. Conclusion The application of liquid array technology to the joint detection of pleural effusion IP-10， IL-27 and MCP-1 can provide help for the diagnosis of plTB.

Key words： tuberculosis; pleural effusion; pleurisy; interleukin-27; liquid array technology; IP-10; MCP-1

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）是僅次于新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的第二大致死性傳染病，位列全球疾病死因第13位［1］。結(jié)核性胸膜炎（tuberculous pleurisy，plTB）是一種常見的TB類型，發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。plTB可引起胸膜增厚、結(jié)核性膿胸、乳糜胸、氣胸等并發(fā)癥，導(dǎo)致肺功能損害、慢性胸痛或呼吸困難，對(duì)患者造成極大傷害。早期診斷是控制plTB的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［2-3］。細(xì)菌學(xué)和病理學(xué)結(jié)果是plTB診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但抗酸桿菌涂片檢測(cè)陽性率低于5.8%，結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，M.tb）培養(yǎng)周期長(zhǎng)（4～8周），而組織病理學(xué)檢查多為有創(chuàng)，因此都不適于普及。分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)仍存在假陽性及技術(shù)等方面問題，難以推廣［4］。近年來，偶有潛在細(xì)胞因子可診斷plTB的研究［5］。液態(tài)芯片技術(shù)（Luminex）可多指標(biāo)并行分析，具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、通量高等優(yōu)點(diǎn)，為疾病特異性標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和新診斷方法的建立提供了研究思路和平臺(tái)［6］。目前尚缺乏胸腔積液大樣本、同時(shí)檢測(cè)多個(gè)細(xì)胞因子的相關(guān)研究。本研究應(yīng)用液態(tài)芯片技術(shù)檢測(cè)胸腔積液細(xì)胞因子，篩選plTB敏感度高、特異度好的輔助診斷標(biāo)志物，并同傳統(tǒng)的胸腔積液腺苷酸脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）檢測(cè)及結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT.TB）比較，評(píng)估其臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018年7月—2021年12月在北京胸科醫(yī)院住院或門診就診的X線檢查顯示有胸腔積液，疑似結(jié)核性胸膜炎的患者155例。收集患者病歷資料，剔除資料不全和診斷不明確者27例，最終納入128例患者，其中男80例，女48例，年齡18～86歲，中位年齡54（37，66）歲；分為plTB組（86例）和對(duì)照組（42例）。plTB組男54例，女32例，年齡18～86歲，中位年齡44（33，59）歲，26例合并肺結(jié)核，13例合并糖尿病。依據(jù)WS196—2017肺結(jié)核診斷指南［7］，將病原學(xué)（包括細(xì)菌學(xué)和分子生物學(xué)）或病理學(xué)確診的plTB者作為確診plTB組（41例），臨床診斷plTB者作為臨床診斷plTB組（45例）。對(duì)照組為確診其他胸膜疾病，排除plTB，且既往無TB史和結(jié)核接觸史，均未經(jīng)過放化療和手術(shù)治療者，包括肺癌39例（腺癌26例、鱗癌5例和小細(xì)胞癌8例），胸膜間皮瘤2例和細(xì)菌性胸膜炎1例；男26例，女16例，年齡26～76歲，中位年齡64（57，72）歲；5例合并糖尿病。以上患者均無妊娠、嚴(yán)重肝腎功能損害、急性病毒感染、肝炎、人免疫缺陷病毒感染和免疫抑制劑應(yīng)用史。本研究通過首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批件號(hào)：（2021）年臨床審第（06）號(hào)。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 Human 17-plex免疫因子分析試劑盒（美國(guó)Panomics公司）；T-SPOT.TB試劑盒（英國(guó)Oxford Immunotech公司）；Luminex20液相芯片分析儀（美國(guó)Millipore公司）；5417R低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；705超低溫冰箱（日本三洋公司）。

1.2.2 樣品采集及處理 收集2 h內(nèi)采集的每位患者胸腔積液2 mL于EP管中，4 ℃、10 000×g離心5 min后，收集上清液于1.5 mL EP管，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 液相芯片分析胸腔積液的細(xì)胞因子水平 按照試劑盒說明書稀釋標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、偶聯(lián)抗體珠。96孔板每孔加入洗液200 μL，室溫避光水平振搖10 min。棄上清液，吸水紙上拍凈。制備2 000、400、80、16、3.2和0 ng/L的標(biāo)準(zhǔn)品加入對(duì)應(yīng)孔，然后將室溫平衡的樣本加入對(duì)應(yīng)孔后，加入預(yù)混磁珠25 μL，避光，4 ℃振搖2 h。在磁性板架上棄上清液，洗板2次。每孔加入檢測(cè)抗體25 μL，室溫避光振搖1 h。每孔加入鏈親和霉素-藻紅蛋白25 μL，避光室溫振搖30 min，洗板2次。每孔加入150 μL鞘液重懸磁珠，避光室溫振搖? ? ? 5 min，在液相芯片分析儀上檢測(cè)白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、γ-干擾素誘導(dǎo)蛋白10（interferon-gamma inducible protein of 10，IP-10）、IL-15、IL-17F、IL-27、腫瘤壞死因子（TNF）-α、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-3a（MIP-3α）、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）、β-干擾素（IFN-β）共17個(gè)細(xì)胞因子的表達(dá)量。

1.2.4 T-SPOT.TB檢測(cè) 按照T-SPOT.TB試劑盒說明書進(jìn)行操作。用肝素抗凝管采集4 mL外周血，4 h內(nèi)用淋巴細(xì)胞分離液分離得到外周血單個(gè)核細(xì)胞并制備成2.5×106/mL的細(xì)胞懸液。分別取100 μL細(xì)胞懸液放于空白對(duì)照孔（無血清培養(yǎng)基）、陽性對(duì)照孔（植物血凝素）、早期分泌靶向抗原（early secretory antigenic target，ESAT）-6和培養(yǎng)濾液蛋白（culture flit protein，CFP）-10孔中進(jìn)行過夜培養(yǎng)，通過美國(guó)CTL公司的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)系統(tǒng)（CTL ImmunoSpop S5 Versa Analyzer）計(jì)數(shù)斑點(diǎn)形成細(xì)胞（spots forming cells，SFCs）。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)空白對(duì)照孔SFCs＜6時(shí)，ESAT-6或CFP-10任一個(gè)實(shí)驗(yàn)孔SFCs≥6即為陽性；若空白對(duì)照孔SFCs≥6，ESAT-6或CFP-10任一個(gè)實(shí)驗(yàn)孔SFCs≥2倍空白孔SFCs，結(jié)果為陽性；若空白對(duì)照孔內(nèi)SFCs≥10或陽性對(duì)照孔內(nèi)SFCs＜20，試驗(yàn)無效。

1.2.5 ADA測(cè)定 采用抗凝管收集10 mL胸腔積液，1 000×g離心5 min，取上清液，用酶法（北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司試劑盒）測(cè)定ADA活性，參照試劑盒說明書進(jìn)行診斷，ADA≥45 U/L定義為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以[x] ±s表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，2組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，3組間陽性率比較采用Cochrans Q檢驗(yàn)，組間多重比較采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)，繪制受試者工作特征（ROC）曲線。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 確診plTB組和對(duì)照組胸腔積液的細(xì)胞因子水平比較 確診plTB組IL-2、IP-10、IL-27、TNF-α和MCP-1水平均高于對(duì)照組（P＜0.05），確診plTB組IL-6水平低于對(duì)照組（P＜0.05），見表1。

2.2 胸腔積液IL-2、IL-6、IP-10、IL-27、TNF-α和MCP-1對(duì)確診plTB的診斷效能 各因子單獨(dú)診斷41例確診plTB的AUC、敏感度和特異度見圖1、表2。將AUC＞0.850且特異度＞80%的IP-10、IL-27和MCP-1聯(lián)合確診plTB，其中任一因子為陽性則判定為聯(lián)合診斷陽性，三因子均為陰性則判定為聯(lián)合診斷陰性，聯(lián)合確診plTB的敏感度為87.8%（36/41），特異度為81.0%（34/42）。三因子聯(lián)合診斷在45例臨床診斷plTB患者中的敏感度仍高達(dá)86.7%（39/45），與確診plTB組的敏感度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.025，P＞0.05）。三因子聯(lián)合診斷plTB的敏感度為87.2%（75/86），特異度為81.0%（34/42）。

2.3 各指標(biāo)診斷效能比較 IP-10、IL-27和MCP-1三因子聯(lián)合檢測(cè)和T-SPOT.TB的敏感度均高于ADA檢測(cè)（Cochrans-Q=39.813，χ2分別為12.777和57.695，P＜0.01），且三因子聯(lián)合檢測(cè)的敏感度高于T-SPOT.TB（χ2=11.631，P＜0.01）；三因子聯(lián)合檢測(cè)、T-SPOT.TB和ADA檢測(cè)的特異度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Cochrans-Q=6.000，P＞0.05），見表3。

3 討論

plTB是M.tb及其代謝產(chǎn)物由近胸膜的原發(fā)病灶直接波及胸膜，或經(jīng)血液、淋巴途徑傳播至胸膜而引起的滲出性炎癥，與機(jī)體復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)被激發(fā)產(chǎn)生免疫反應(yīng)有關(guān)。大量的胸腔積液降低了M.tb的濃度，從而導(dǎo)致胸腔積液M.tb體外培養(yǎng)陽性率極低［8］。宿主參與抗M.tb免疫應(yīng)答中的各類細(xì)胞及其因子具有潛在的開發(fā)免疫學(xué)診斷試劑的價(jià)值［5］。鑒于傳統(tǒng)方法檢測(cè)免疫因子效能有限，僅有少數(shù)單個(gè)指標(biāo)的研究報(bào)道。本研究應(yīng)用液態(tài)芯片技術(shù)檢測(cè)胸腔積液中的17種免疫因子并進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)確診plTB組中IL-2、IP-10、IL-27、TNF-α和MCP-1水平均高于對(duì)照組，IL-6低于對(duì)照組，提示檢測(cè)胸腔積液中特異性免疫因子具有潛在診斷價(jià)值。

近年來新發(fā)現(xiàn)的二聚體細(xì)胞因子IL-27是IL-6/IL-12家族成員，由活化的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞共同作用產(chǎn)生，與分布在免疫細(xì)胞上的受體結(jié)合，進(jìn)而通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）1/STAT2通路調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞向Th1方向分化和增殖。IL-27可有效識(shí)別并清除M.tb，可與結(jié)核性胸腔積液中存在的多種細(xì)胞因子發(fā)生作用并參與plTB的發(fā)生與發(fā)展［9-10］。劉佳慶等［11］也發(fā)現(xiàn)利用液相芯片技術(shù)對(duì)患者胸腔積液IL-27檢測(cè)在plTB診斷中存在一定的價(jià)值。在TB高流行地區(qū)，胸腔積液中IL-27對(duì)plTB有較好的診斷效果，且陰性結(jié)果排除plTB可能性較大［12］。本研究中，胸腔積液IL-27的診斷臨界值為4 589.00 ng/L，敏感度為75.61%，特異度為88.10%，顯示了較好的診斷價(jià)值。這可能是由于患者胸腔積液微環(huán)境改變，M.tb入侵，滲出液誘發(fā)局部超敏反應(yīng)，使得IL-27水平增高所致［10］。

IP-10屬于趨化因子CXC亞家族，CXC趨化因子受體3（CXCR3）是其唯一的配體，可趨化高度表達(dá)CXCR3的多種炎性細(xì)胞，屬于Th1型細(xì)胞因子。其主要通過內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞活化產(chǎn)生，可選擇性誘導(dǎo)白細(xì)胞表達(dá)整合素，誘導(dǎo)更多趨化因子產(chǎn)生，放大信號(hào)，產(chǎn)生強(qiáng)烈細(xì)胞反應(yīng)，增加病灶內(nèi)細(xì)胞濃度，損傷局部組織器官［13］。IL-2是一種淋巴激活因子，可促進(jìn)T細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的產(chǎn)生和增殖，在介導(dǎo)免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用［14］。研究顯示，胸腔積液IP-10和IL-2對(duì)plTB具有較高的診斷價(jià)值［13-14］。本研究中IP-10和IL-2診斷plTB的敏感度分別為80.49%和70.73%，特異度分別為88.10%和83.33%，提示檢測(cè)IP-10較IL-2診斷plTB的價(jià)值高。此外，IP-10和IL-2在人免疫缺陷病毒感染患者和兒童TB診斷中較γ-干擾素敏感度高［15-16］。MCP-1屬于趨化因子CC亞家族。在結(jié)核宿主免疫中，MCP-1能夠誘導(dǎo)結(jié)核的非特異性免疫反應(yīng)和肉芽組織的形成過程，還具有促進(jìn)單核/巨噬細(xì)胞合成和分泌TNF-α的特性，同時(shí)TNF-α可反過來刺激MCP-1在肺內(nèi)的表達(dá)。這提示MCP-1與TNF-α不僅本身參與結(jié)核結(jié)節(jié)的形成，而且MCP-1與TNF-α在細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中有相互促進(jìn)作用，這可能是結(jié)核結(jié)節(jié)形成的機(jī)制之一［17-19］。本研究結(jié)果提示單獨(dú)應(yīng)用MCP-1較TNF-α鑒別診斷的可靠性高。

IL-6是一種多功能細(xì)胞因子，由T細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，并促進(jìn)T細(xì)胞和B細(xì)胞的分化與增殖，在急性炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，如誘導(dǎo)產(chǎn)生一些急性期蛋白及合成免疫球蛋白，以助于感染早期γ-干擾素快速表達(dá)等［14，20］。有研究表明結(jié)核性胸腔積液中IL-6含量高于惡性胸腔積液，且高于自身外周血清［21］，可能由于胸膜腔受到M.tb感染時(shí)產(chǎn)生過敏反應(yīng)，T細(xì)胞被激活，產(chǎn)生并分泌IL-6。本研究中IL-6診斷plTB的敏感度為68.29%，特異度為85.71%，檢測(cè)胸腔積液IL-6有助于鑒別診斷。

本研究應(yīng)用液態(tài)芯片技術(shù)首先在確診plTB組與對(duì)照組間篩選出6個(gè)胸腔積液差異細(xì)胞因子，進(jìn)而在plTB組中聯(lián)合檢測(cè)IL-6、IP-10和MCP-1，使得敏感度提高至87.8%，特異度為81.0%，且三因子聯(lián)合檢測(cè)在臨床plTB組中的敏感度仍高達(dá)86.7%，提示聯(lián)合檢測(cè)對(duì)plTB有輔助診斷價(jià)值，尤其對(duì)臨床plTB者具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

γ-干擾素釋放試驗(yàn)是近20年來基于免疫和分子生物學(xué)發(fā)展起來的一種快速的體外檢測(cè)結(jié)核菌感染的新方法，被廣泛用于TB的輔助診斷。基于外周血單個(gè)核細(xì)胞的T-SPOT.TB將細(xì)胞調(diào)至2.5×106/mL，保障了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和敏感度。但是，在TB高負(fù)擔(dān)國(guó)家中結(jié)核潛伏感染率高，診斷特異度較低，常用于TB患者的排除，而非納入，且操作復(fù)雜、價(jià)格昂貴，限制了其常規(guī)臨床應(yīng)用［5］。本研究中T.SPOT-TB診斷plTB的敏感度略低于IP-10、IL-27和MCP-1三因子聯(lián)合檢測(cè)。ADA檢測(cè)是臨床常規(guī)應(yīng)用的、診斷plTB較為準(zhǔn)確的輔助指標(biāo)。ADA是嘌呤核苷酸分解代謝過程中的關(guān)鍵酶，主要存在于機(jī)體淋巴細(xì)胞中，當(dāng)患者感染M.tb時(shí)，T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答會(huì)使淋巴細(xì)胞明顯增高，ADA濃度也大幅提高［22］。本研究中ADA檢測(cè)、三因子聯(lián)合檢測(cè)和T.SPOT-TB的特異度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但聯(lián)合檢測(cè)的敏感度高于ADA檢測(cè)。

綜上所述，應(yīng)用液態(tài)芯片技術(shù)對(duì)IP-10、IL-27和MCP-1聯(lián)合檢測(cè)plTB具有較高的敏感度和特異度，且操作簡(jiǎn)單、方便。因此，三因子聯(lián)合診斷具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，但本研究納入的患者例數(shù)較少，尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

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（2023-05-25收稿 2023-09-04修回）

（本文編輯 李志蕓）