積雪草酸對實(shí)驗(yàn)性蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠腦損傷的保護(hù)作用

武瀟瀟 胡玉鯤 吳江

摘要：目的 探討積雪草酸（AA）對實(shí)驗(yàn)性蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）大鼠腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。方法 將108只成年SD大鼠分為假手術(shù)（Sham）1組、SAH+Vehicle（空載）組與SAH+AA組，每組36只；42只大鼠分為Sham2組及SAH后3、6、12、24、48、72 h組，每組6只。除Sham組外，其余各組采用單側(cè)頸外動(dòng)脈線刺法建立SAH模型，造模后SAH+AA組灌胃AA溶液（30 mg/kg）。采用踏空實(shí)驗(yàn)和改良Garcia評分評估神經(jīng)行為學(xué)改變，Western blot檢測腦組織谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）蛋白表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測腦組織谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）濃度，F(xiàn)luoro-Jade B染色檢測神經(jīng)元死亡情況。結(jié)果 與Sham1組相比，SAH+Vehicle組踏空步數(shù)比例明顯增多且改良Garcia評分明顯降低，腦組織GPX4蛋白表達(dá)水平和GSH含量降低，MDA含量升高，死亡神經(jīng)元數(shù)目增多（均P＜0.05）。與SAH+Vehicle組相比，SAH+AA組踏空步數(shù)比例下降且改良Garcia評分升高，腦組織GPX4蛋白表達(dá)升高，MDA含量下降，GSH含量升高，死亡神經(jīng)元數(shù)目明顯下降（P＜0.05）。結(jié)論 AA可能通過抑制脂質(zhì)過氧化減輕大鼠SAH后的腦損傷。

關(guān)鍵詞：積雪草酸；脂質(zhì)過氧化；蛛網(wǎng)膜下腔出血；腦損傷

中圖分類號：R743.35文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.11958/20231956

Protective effect of asiatic acid on brain injury after experimental subarachnoid

hemorrhage in rats

WU Xiaoxiao1， HU Yukun2， WU Jiang3△

1 Suzhou Medical College of Soochow University， Suzhou 215000， China; 2 the Affiliated Changshu Hospital of Nantong University; 3 the First Affiliated Hospital of Soochow University

△Corresponding Author E-mail： szjiangwu@163.com

Abstract： Objective To explore the neuroprotective effect of asiatic acid （AA） on brain damage after experimental subarachnoid hemorrhage （SAH） in rats. Methods A total of 108 adult SD rats were divided into the sham1 group， the SAH+vehicle group and the SAH+AA group， with 36 rats in each group. The 42 rats were divided into the sham2 group， 3， 6， 12， 24， 48 and 72 h after SAH groups， with 6 rats in each group. Except the sham group， SAH model was established by unilateral external carotid artery puncture method in other groups. After modeling， the SAH+AA group was given AA solution （30 mg/kg） by gavage. Neurobehavioral changes were assessed by foot fault test and modified Garcia score. Western blot assay was used to detect the protein level of glutathione peroxidase 4 （GPX4） in brain tissue. ELISA was used to detect the concentrations of glutathione （GSH） and malondialdehyde （MDA）. Fluoro Jade B （FJB） staining was used to detect the neuronal death. Results Compared with the sham1 group， the SAH+vehicle group showed a significant increase in the proportion of empty steps and a significant decrease in the modified Garcia score， a significant decrease in GPX4 protein levels， a significant increase in MDA concentration （P＜0.05）， a decrease in GSH concentration （P＜0.01） and a significant increase in the number of dead neurons （P＜0.05）. Compared with the SAH+vehicle group， a significant decrease in the proportion of empty steps， a significant increase in the modified Garcia score， a significant increase in GPX4 protein level， a significant decrease in MDA concentration， a significant increase in GSH concentration （P＜0.05） and a significant decrease in the number of dead neurons in the SAH+AA group （P＜0.05）. Conclusion AA may reduce brain injury after SAH in rats by inhibiting lipid peroxidation.

Key words： asiatic acid; lipid peroxidation; subarachnoid hemorrhage; brain damage

蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是出血性腦卒中的主要形式之一，也是一種致死致殘率高的神經(jīng)外科急重癥［1-2］。目前已有大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)SAH后神經(jīng)損傷與氧化應(yīng)激有關(guān)，是導(dǎo)致預(yù)后不良的主要病理改變［3-5］。積雪草酸（asiatic acid，AA）是熱帶植物積雪草中天然存在的五環(huán)三萜類化合物，具有強(qiáng)大的抗氧化和抗炎等廣泛的生物活性［6-7］。已有研究證實(shí)，AA可以穿透血腦屏障，并在腦梗死等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［5，8］。本研究旨在探討AA在SAH中的神經(jīng)保護(hù)作用及可能機(jī)制，為改善SAH患者預(yù)后提供潛在的治療途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 150只SPF級成年健康雄性SD大鼠，8～10周齡，體質(zhì)量280～330 g，購自昭衍新藥研究中心有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2023-0004。大鼠以常規(guī)棒狀顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水，定期更換飼料，清理鼠籠，動(dòng)物房溫度18～22 ℃，維持晝夜循環(huán)。本研究過程中動(dòng)物的使用符合《國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用指南》的相關(guān)規(guī)定，實(shí)驗(yàn)及操作經(jīng)過蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理會批準(zhǔn)（編號：2021倫審批第124號）。

1.1.2 主要試劑和儀器 AA（純度98.23%）購自Aktin Chemicals公司，二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma公司，兔抗鼠谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase，GPX4）抗體（DF 6701）、磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體（AF 7021）購自Affinity公司，抗兔IgG抗體（7074S）購自Cell Signaling公司，丙二醛（MDA）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測試劑盒購自同仁化學(xué)公司，谷胱甘肽（GSH）ELISA檢測試劑盒購自BioVision公司，Western blot相關(guān)試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，F(xiàn)luoro-Jade B（FJB）粉末購自Biosensis公司。光學(xué)顯微鏡（SMZ745型）、熒光顯微鏡（DS-Ri2型）購自日本Nikon公司，多功能酶標(biāo)儀（DR-200Bn型）購自無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司。溶液配制：空載溶液為50 mL生理鹽水+50 μL DMSO，AA溶液為50 mL生理鹽水+50 μL DMSO+150 mg AA粉末。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及大鼠SAH模型的建立 大鼠喂養(yǎng)1～2周后按照隨機(jī)數(shù)字表法將108只大鼠分為假手術(shù)（Sham）1組、SAH+Vehicle組（溶劑對照）、SAH+AA組（給藥），每組36只。剩余42只分為Sham2組及SAH后3、6、12、24、48、72 h組，每組6只。除Sham組外，其余組均采用單側(cè)頸外動(dòng)脈線刺法構(gòu)建SAH模型。術(shù)前8 h禁食，稱體質(zhì)量后，使用4%水合氯醛溶液（10 mL/kg）腹腔注射麻醉。常規(guī)消毒備皮后將大鼠固定在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)臺上，在頸部做縱向切口，分離肌肉和筋膜，暴露頸外動(dòng)脈。頭側(cè)解剖并結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端，繼續(xù)解剖并暴露頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。懸吊頸內(nèi)動(dòng)脈以暫時(shí)阻斷血流，用動(dòng)脈夾夾住遠(yuǎn)端頸總動(dòng)脈以阻斷血流。用顯微剪刀在頸外動(dòng)脈殘端上剪開一個(gè)破口，然后沿著破口插入線栓，直到栓線標(biāo)記處到達(dá)頸內(nèi)外動(dòng)脈分叉口處再向內(nèi)行進(jìn)0.5～1.0 cm，直至感覺到突破；5 s后，拔出線栓，結(jié)扎頸外動(dòng)脈殘端，松開頸總動(dòng)脈的動(dòng)脈夾。觀察血管的再灌注情況?？p合切口并進(jìn)行術(shù)后護(hù)理［9］。Sham組僅結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端。

1.2.2 干預(yù)時(shí)間及給藥方式 （1）干預(yù)時(shí)間：將Sham2組及SAH后3、6、12、24、48、72 h組的42只大鼠麻醉后處死，用150 mL PBS灌注心臟后完整取出腦組織，取顳底腦組織，置入IP細(xì)胞裂解液中充分裂解30 min。4 ℃、12 000 r/min離心10 min，分離上清液，使用BCA檢測試劑盒測量上清液中蛋白質(zhì)含量并平衡濃度。平衡后的樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后將目的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。封閉液封閉60 min，添加GPX4一抗（1∶1 000），在4 ℃孵育過夜。次日用PBST沖洗3次，添加抗兔IgG二抗（1∶2 000），在室溫下孵育60 min。最后在顯影儀上用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法曝光，Image J軟件測量目的條帶的灰度值并計(jì)算GPX4蛋白相對表達(dá)量［10］。根據(jù)GPX4表達(dá)水平確定SAH后取材時(shí)間。

（2）給藥方式：SAH+AA組大鼠在造模后按照30 mg/kg劑量［11］灌胃AA溶液（參與行為學(xué)實(shí)驗(yàn)大鼠在SAH后3 h給藥，每隔24 h給藥1次，共3次，其余實(shí)驗(yàn)大鼠在SAH后3 h給藥，隔12 h給藥1次，共2次）。SAH+Vehicle組在大鼠SAH造模3 h后通過灌胃給藥，根據(jù)AA需要量計(jì)算相應(yīng)計(jì)量給予空載溶液。Sham1組不予處理。

1.2.3 踏空實(shí)驗(yàn) 將大鼠置于升高的網(wǎng)格鐵架上，網(wǎng)格大小為6 cm×6 cm。大鼠把爪子放在鐵絲上，沿著格子移動(dòng)。為了便于記錄步態(tài)，從格子下方對大鼠進(jìn)行錄像。當(dāng)神經(jīng)受損的前肢負(fù)重時(shí)，可能會掉落到鐵絲之間，即為踏空［12］。記錄左側(cè)前爪的踏空步數(shù)和總步數(shù)，計(jì)算踏空比例。大鼠于造模前3 d進(jìn)行訓(xùn)練，每天3次，每次錄像1 min，取平均值作為術(shù)前基礎(chǔ)值。在建模后的第3、5、7、14天，每組取12只大鼠進(jìn)行測試。

1.2.4 改良Garcia評分 大鼠于建模前1 d進(jìn)行評分，每只大鼠測評3次，取平均值作為基線水平，在建模后第3、5、7天，每組取12只大鼠進(jìn)行評估。改良Garcia評分用于評估SAH后大鼠的身體本體感覺、攀爬、前肢運(yùn)動(dòng)、觸須側(cè)轉(zhuǎn)、肢體對稱性以及自主運(yùn)動(dòng)6項(xiàng)，每項(xiàng)0～3分，總分18分；評分越高，代表神經(jīng)功能越好［13］。

1.2.5 Western blot 各組取6只大鼠，在SAH后24 h處死，PBS灌注心臟后完整取出腦組織，參照1.2.2中步驟檢測腦組織中GPX4表達(dá)。

1.2.6 腦組織Fluoro-Jade B（FJB）染色 各組取6只大鼠在SAH后24 h處死，PBS及4%多聚甲醛灌注心臟后完整取出腦組織，取含有顳底的整塊腦組織制成石蠟切片。切片在70 ℃的烘箱中放置1 h，然后用二甲苯和乙醇水溶液對切片進(jìn)行脫蠟。將切片置入0.06%的高錳酸鉀溶液中15 min，然后用去離子水沖洗2 min，再浸入FJB工作液（0.1%乙酸）中浸泡30 min。然后將切片在50～60 ℃烘烤15 min，二甲苯透明，中性樹膠封片。熒光顯微鏡下采用藍(lán)色激發(fā)光（波長為450～490 nm）觀察及圖像采集［14］，計(jì)數(shù)死亡神經(jīng)元數(shù)量。

1.2.7 ELISA檢測腦組織中MDA及GSH含量 各組取6只大鼠，在SAH后24 h處死，用PBS灌注心臟完整取出腦組織，PBS沖洗，每組取20 mg顳底腦組織采用微量板酶標(biāo)法MDA的含量，根據(jù)檢測試劑盒說明進(jìn)行操作；同上方法處死大鼠后，取100 mg顳底腦組織，采用微量板酶標(biāo)法檢測GSH的含量，根據(jù)檢測試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以[x] ±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，SAH后不同時(shí)點(diǎn)指標(biāo)比較采用重復(fù)測量資料的方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AA可提高大鼠SAH后行為學(xué)表現(xiàn) 與Sham1組相比，SAH+Vehicle組SAH后各時(shí)點(diǎn)踏空步數(shù)比例增多，改良Garcia評分降低（P＜0.05），與SAH+Vehicle組相比，SAH+AA組踏空步數(shù)比例下降，改良Garcia評分升高（P＜0.05），見表1、2。

2.2 SAH后腦組織中GPX4表達(dá)水平降低 Western blot結(jié)果顯示，與Sham2組相比，SAH后24 h腦組織中GPX4蛋白表達(dá)明顯下降，其他時(shí)間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。故選擇SAH后24 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的取材時(shí)間點(diǎn)。

2.3 AA能夠減少神經(jīng)元死亡 見圖2。FJB染色結(jié)果顯示，Sham1組、SAH+Vehicle組、SAH+AA組變性神經(jīng)元數(shù)量分別為（0.67±0.82）、（10.83±1.17）和（7.17±1.17）個(gè)/mm2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=6，F(xiàn)=140.300，P＜0.01）。SAH+Vehicle組變性神經(jīng)元數(shù)目較Sham1組增多（P＜0.05），而相比SAH+Vehicle組，SAH+AA組中變性神經(jīng)元出現(xiàn)減少（P＜0.05）。

2.4 AA對脂質(zhì)過氧化蛋白表達(dá)的影響 與Sham1組相比，SAH+Vehicle組大鼠腦組織中GPX4蛋白相對表達(dá)量和GSH含量降低，MDA含量升高（P＜0.05）。與SAH+Vehicle組相比，SAH+AA組GPX4蛋白相對表達(dá)量和GSH含量升高，MDA含量下降（P＜0.05），見圖3、表3。

3 討論

SAH是出血性腦卒中的一種致命亞型，它通常由顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂導(dǎo)致［15］。目前已有大量針對SAH后神經(jīng)損傷機(jī)制的研究，但是具體干預(yù)機(jī)制以及有效的治療手段仍然相對有限［16］。AA作為天然植物中存在的成分，具有抗氧化、保護(hù)神經(jīng)的功能［10，17］。研究發(fā)現(xiàn)AA可明顯改善缺血性卒中后腦損傷［12］。因此，筆者推測AA可能對SAH同樣具有神經(jīng)保護(hù)作用。本研究通過在大鼠SAH后給予AA進(jìn)行藥物干預(yù)，觀察其在改良Garcia評分、踏空實(shí)驗(yàn)等行為學(xué)測試中的表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)AA可有效改善大鼠SAH后的神經(jīng)行為學(xué)功能損傷。本研究同時(shí)觀察到AA能夠有效減少SAH大鼠神經(jīng)元的死亡，為SAH后腦損傷的治療提供了一種新型的藥物治療思路。

研究已經(jīng)表明，許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中均有脂質(zhì)過氧化的出現(xiàn)，并且對于調(diào)控神經(jīng)元死亡具有重要作用［18］，其中GSH、MDA以及GPX4則是脂質(zhì)過氧化的重要標(biāo)志物［19-20］。本研究發(fā)現(xiàn)，在SAH 24 h后大鼠腦組織中GPX4的含量明顯下降，這也印證了SAH后脂質(zhì)過氧化的發(fā)生。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)SAH后大鼠腦組織中MDA含量增加，GSH含量下降，確證了SAH后脂質(zhì)過氧化的發(fā)生及其下游產(chǎn)物的堆積。給予AA干預(yù)后，腦組織GPX4及GSH的含量較前得到提升，MDA含量下降，死亡神經(jīng)元數(shù)量減少，提示AA可能通過抑制脂質(zhì)過氧化來減少大鼠SAH后神經(jīng)元死亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本研究探究了AA在SAH中的作用，為SAH后的治療提供了新的思路方法。但本研究中尚存在著一些局限性，如僅簡單驗(yàn)證了AA在大鼠SAH后的神經(jīng)保護(hù)作用，具體的靶向蛋白及下游機(jī)制通路尚不明確；另外，GSH的耗竭、GPX4的失活以及MDA的堆積雖然是脂質(zhì)過氧化發(fā)生過程中重要的一環(huán)，但根據(jù)上述指標(biāo)的變化尚不能直接表明脂質(zhì)過氧化的變化情況，療效證據(jù)不足；再者，AA是否通過脂質(zhì)過氧化以外的其他信號通路來改善大鼠SAH后神經(jīng)損傷還需進(jìn)一步明確。

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［20］ 陳玉，蘇建軍，韓允，等. 富馬酸二甲酯調(diào)控Nrf2-GPX4介導(dǎo)的鐵死亡途徑對大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用研究［J］. 天津醫(yī)藥，2022，50（6）：601-607. CHEN Y，SU J J，HAN Y，et al. Study on the protective effect of dimethyl fumarate on myocardial ischemia/reperfusion injury by regulating the iron death pathway mediated by Nrf2-GPX4 in rats［J］. Tianjin Med J，2022，50（6）：601-607. doi：10.11958/20212639.

（2023-12-10收稿 2023-12-25修回）

（本文編輯 胡小寧）